CN112831589B - 与果形指数紧密相关分子标记的特异性引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及与果形指数紧密相关分子标记的特异性引物及应用。本发明确定了一个与果形显著相关的SNP，并确定了其为控制辣椒果形指数的候选基因，通过设计扩增及测序引物，对包含此SNP的区段进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果鉴定此SNP位点的基因型。

Description

与果形指数紧密相关分子标记的特异性引物及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及与果形指数紧密相关分子标记的特异性引物及应用。
背景技术
辣椒(Capsicum spp.)属茄科(solanaceae)辣椒属(Capsicum)作物，原产于墨西哥和哥伦比亚，世界各国普遍栽培。风味相似的不同辣椒品种，良好果型可以更加吸引消费者，在市场上更具价格优势，以此达到效益增收的目的。同时作为观赏品种的辣椒，果形更是辣椒重要的商品品质。随着我国辣椒市场的不断扩大，种植规模不断加大，关于辣椒果形的遗传研究愈发重要。辣椒的果形是一个高度分化的性状，在已知品种中辣椒果实存在许多形状，如方形、心形、圆形和线性等。这些形状，加上大小、颜色和刺激性等，是果实分类的主要特征。辣椒的果实形状通常作为数量性状遗传，尽管除了遗传控制外，它还受到非遗传因素如气温等环境因子的显著影响。研究者对辣椒果实形状的广泛研究后提出辣椒的果实形状是由基因控制的，而不是由独立遗传的宽度和长度尺寸造成的。尽管辣椒中存在较大的果实形状变化，但目前只有很少的形状属性被研究，其中包括果实宽度、果实长度和果实形状指数(长度/宽度)。
前人利用由钟型辣椒栽培品种‘Maor’和印度多年生小果型品种‘Perennial’杂交得到的F3群体，对辣椒果实性状进行QTL分析，得到一个主要的果形指数数量性状位点fs3.1。通过验证fs3.1在细长果型品种与‘Maor’杂交后的回交自交系(BILs)以及与C.annuum的方形自交系杂交后代，确定fs3.1处的等位基因除了增加果实形状指数外，即增加果实伸长和降低果实宽度，还起到降低果皮厚度的作用，fs3.1对果实尺寸生长的影响因遗传背景的不同而不同。通过测量fs3.1在果实发育过程中不同的近等基因系的子房及果实的长度和宽度，从而确定fs3.1主要通过在授粉后的前2周增加纵轴的生长率来控制形状。除fs3.1以外，fs10.1也被确定为控制果实伸长的基因，这两个数量性状位点是果实形状指数的最显著位。两个QTL都控制着大多数辣椒的果形指数的变异，分别解释了表型变异的67％和44％。在C.annuum和C.chinense之间的种间杂交中发现的控制果形的QTLs，分别存在于1号、3号、4号和10号染色体上，四个主要QTL在4号染色体中，3号、4号和11号染色体中的一个QTL在C.annuum和C.frutescens的杂交中被鉴定(Yarnes et al.,2013)。
在现有的研究中证明果形指数是一个数量性状遗传位点，虽已经定位到许多与果形相关的QTLs，但控制果形的基因尚未被发现，更未确定到对控制果形指数贡献率较大的基因。
发明内容
本发明的目的是提供与辣椒果形指数紧密相关分子标记的特异性引物。
本发明的另一目的是提供鉴定辣椒果实的纵径长度与果实横径长度之比的方法。
本发明的另一目的是提供上述与辣椒果形指数紧密相关分子标记的特异性引物的应用。
根据本发明的果形指数紧密相关分子标记的特异性引物，所述引物的序列为：F-5’GGAGGTCAGACGTGGATCATC3’，R-5’TGATGGTTTGTTTGGTTTGAGCA3’。
据本发明的鉴定辣椒果实纵径长度与果实横径长度之比的方法，所述方法包括使用上述引物进行PCR扩增的步骤，其中，对扩增产物进行测序，在位点Chr03：69484261处为CC基因型，果形指数小于11，为TT基因型，果形指数大于11。
本发明还提供上述果形指数紧密相关分子标记的特异性引物在辣椒育种中的应用。
本发明确定了一个与果形显著相关的SNP，并确定了其为控制辣椒果形指数的候选基因，通过设计扩增及测序引物，对包含此SNP的区段进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果鉴定此SNP位点的基因型。
附图说明
图1为果形指数全基因组关联分析曼哈顿图；
图2为PCR产物测序结果峰图，左为测序结果为TT基因型，右为测序结果为CC基因型。
具体实施方式
实施例1
对311份一年生辣椒(Capsicum annuum L.)存取叶片，送样给公司提取DNA进行重测序，测序平台为Illumina Solexa，每份材料测序数据量约30G，采用Trimmomatic v0.33处理原始数据，去除接头、poly-N和低质量片段，得到clean data，利用BWA0.75将cleandata比对到Zunla-1基因组数据(Qin et al.,2014)，设置参数为aln-o 1-e 10-t 4-l 32-i 15-q 10；利用Samtools 0.1.19(Li et al.,2009)，采用Bayesian算法，设置参数-q 1-C50-S-D-m 2-F 0.002-u，运行命令mpileup，查找SNP，过滤SNP，设置最小基因等位频率大于0.01，缺失率小于0.1。
对311份现有的一年生辣椒材料的果形指数进行了表型鉴定，果形指数为果实纵径长度与果实横径长度之比。对上述过滤得到的SNP与果形指数的表型数据进行全基因组关联分析，全基因组关联分析采用Gemma(Zhou and Stephens 2012)中的线型混合模型，将果形指数的显著信号位点定位到3号染色体，如图1所示。在3号染色体第69484261bp与果形指数显著关联，p值为1.51×10-14。此SNP位点为CC时，果形指数偏大；为TT时，果形指数偏小。
对该位点设计PCR扩增引物，扩增引物序列为：F-5’GGAGGTCAGACGTGGATCATC3’，R-5’TGATGGTTTGTTTGGTTTGAGCA3’。利用此对扩增引物对包含246份材料的另一群体的DNA进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示为单一条带，PCR产物送测序，测序引物为PCR扩增引物前引物F-5’GGAGGTCAGACGTGGATCATC3’。测序结果显示(图2)，在位点Chr03：69484261处有40份材料为CC基因型，有206份材料为TT基因型。同时调查该验证群体的果形指数，将此位点为TT的基因型记为0，CC基因型记为2，果形指数与基因型进行相关性分析，相关系数为0.42。将果形指数分界值设为11，果形指数大于11的有226份材料，基因型为TT；果形指数小于11的有20份材料，基因型为CC；综合246份材料，此SNP位点可以准确鉴定果形指数。
对测序标记的验证过程具体如下：
取嫩叶5-8片用锡箔纸包好液氮预冷，-80℃冻存用于提取DNA，进行PCR扩增，检测PCR产物，电泳结束后在BIO-RAD紫外凝胶成像系统下显影，PCR产物在琼脂糖电泳凝胶上呈现出单一条带，将剩余PCR产物送公司进行Sanger测序。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 与果形指数紧密相关分子标记的特异性引物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggtcaga cgtggatcat c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatggtttg tttggtttga gca 23

Claims (2)

1.一种鉴定辣椒果实纵径长度与果实横径长度之比的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
使用与辣椒果形指数紧密相关分子标记的特异性引物进行PCR扩增，
对PCR扩增产物进行测序，在位点Chr03：69484261处为CC基因型，果形指数小于11，为TT基因型，果形指数大于11。
2.根据权利要求1所述的鉴定辣椒果实纵径长度与果实横径长度之比的方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为：
F-5’GGAGGTCAGACGTGGATCATC3’，
R-5’TGATGGTTTGTTTGGTTTGAGCA3’。
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基于辣椒基因组重测序的InDel标记开发及应用;郭广君等;《江苏农业学报》(第06期);全文 *

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