CN108893552A - 辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测引物及其应用 - Google Patents

辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测引物及其应用 Download PDF

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贾利
丁盼盼
田红梅
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董言香
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Abstract

本发明涉及分子标记领域，具体涉及辣椒果实颜色分子标记及应用，利用此标记，以辣椒杂交或回交后代的叶片基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带检测，筛选出紫色辣椒果实的后代。本发明所采用的这种方法可以在紫色辣椒杂交或回交后代的苗期进行鉴定，能够将紫色植株从群体后代中及早筛选出来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展紫色辣椒材料的创制和品种选育提供科学依据。

Description

辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测 引物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测引物及其应用。
背景技术
辣椒是一种重要的蔬菜作物。辣椒颜色多样，其果皮颜色从未熟期到完熟期会发生不断的变化，如紫色辣椒，未熟期为绿色，转色期为紫色，完熟期为红色；如白色辣椒，未熟期为淡绿色，转色期为白色，青熟期为橙红色。不同颜色的辣椒品种含有的丰富的色素和营养成份，为人们的生活提供丰富的材料。彩色辣椒育种技术的创新和品种的选育为休闲农业和乡村振兴建设提供科技支撑。紫色辣椒是辣椒中稀有的种质资源，其商品青熟期因富含花色素而呈现出紫色，植株具有耐热、耐寒、耐旱以及抗病的特点，对开发和利用种质资源创新等具有重要的意义。
目前，国内外通常采用常规杂交的方法，进行果实颜色性状的转育，需要通过长时间的观察，才能选出目标材料，劳动力使用量大，成本高。我们通过紫色性状遗传规律的分析，紫色性状受单显性基因控制。随着现代生物技术的迅猛发展，分子标记辅助选择育种成为育种工作的重要辅助手段。该技术是利用与决定特定性状基因紧密连锁的分子标记，通过对标记进行检测来确定基因是否存在，从而大大加速育种进程，节约大量成本，显著缩短了育种周期。另外，在聚合育种方面，分子标记辅助选择的优势更加明显。因此，开发有效的分子标记对于新品种的选育具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与辣椒商品青熟期紫色果实性状Pf-g基因紧密连锁的分子标记。
本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否紫色果实的引物，所述引物包括：
CAMS-454-F ：GAGCCTCTTAATGTATCTGAAAACA；
CAMS-454-R：AATTTTGGTGAATCGCACCT；
本发明的另一目的是提供一种利用分子标记在苗期鉴定辣椒是否为紫色果实植株的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否紫色果实植株的方法包括如下步骤：
(1)用上述引物对对待测辣椒DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)检测所述PCR扩增产物的大小；
若PCR扩增产物含有大小为165bp的片段，则待测辣椒是紫色果实植株；
若PCR扩增产物不含有165bp，则待测辣椒不是紫色果实植株；
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测辣椒的基因组DNA。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的分子标记CAMS-454 (引物对)可用于分子标记辅助育种，具有特异性强、稳定性高的特点；
(2)本发明的分子标记CAMS-454(引物对)对检测设备和底物模板质量的要求不高，且所扩增的特异片段较小且在紫色和绿色果实自交系材料间差异明显，检测周期短，适用于现代分子标记辅助育种的实践；
(4)本发明的分子标记CAMS-454(引物对)可应用于辣椒育种工作，可以在苗期鉴定果实紫色性状，极大降低使用不符合目标性状要求的材料，减少了劳动力成本，加快了育种进程。
本发明采用辣椒紫色果实材料H245和绿色果实材料H246及其构建的F1、F2、BC1P1、BC1P2群体进行商品青熟期果实颜色性状鉴定，通过分析发现H245对果实紫色性状的遗传符合单基因显性遗传模式。通过引物筛选以及对F2群体的基因型进行分析，发现CAMS-454PCR扩增特性分子标记与果实紫色性状Pf-g基因紧密连锁。根据连锁遗传图谱显示，分子标记CAMS-454(引物对)与侧翼SSR标记ES-148标记的遗传距离为1.6cM。通过实验证明：本发明的分子标记CAMS-454(引物对)特异性强，可用于辣椒分子标记辅助育种，通过苗期筛选即可对紫色果实植株进行选择，可节约成本，提高选择效率，大大加速育种进程。
附图说明
图1为分子标记CAMS-454在双亲、极端池以及F2群体中随机挑选的紫色和绿色单株中的扩增结果；
其中，245：紫色果实亲本；246：绿色果实亲本；1-20：F2群体中20株单株。
图2为分子标记CAMS-454与紫色果实紧密连锁图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明以辣椒紫色辣椒自交系H245为父本、绿色辣椒自交系H246为母本及其以F2群体为试验材料。
实施例1、分子标记CAMS-454的获得
一、辣椒果实颜色鉴定分析
1、苗期辣椒果实颜色鉴定
辣椒紫色辣椒自交系H245为父本、绿色辣椒自交系H246为母本及利用两个亲本配制得到F1和F2群体进行果实颜色鉴定。两亲本各10株，F1群体12株，F2群体186株。
2、辣椒商品青熟期果实颜色鉴定结果
辣椒商品青熟期果实颜色结果表明：辣椒紫色材料H245的所有单株均为紫色；绿果材料H246的所有单株均为绿色； F1和BC1P2两个群体的所有单株全部均为紫色；F2群体中紫色植株有133株，绿色果实植株有53株，经检验符合3:1的分离比例；BC1P2群体中紫色果实植株有28株，绿色果实植株有32株，经检验符合1:1的分离比例，以上结果表明紫色该自交系对紫色性状由1对显性基因控制的，将此基因命名为Pf-g基因。
二、分子标记CAMS-454的获得
采用CTAB法分别提取紫色自交系和绿色自交系的基因组DNA，并采用混合分组分析法(BAS法)进行分子标记的筛选。具体步骤如下：
1、果实紫色和绿色池的获得
在F2分离群体中随机选取10株极端紫色果实植株和10株极端绿色果实植株，分别提取DNA，然后将10株紫色果实植株的DNA等量混合，得到紫色果实池，将10株绿色果实植株的DNA等量混合，得到绿色果实池。
2、分子标记CAMS-454的获得
根据已公布的辣椒基因组分子标记引物，利用两个亲本和两个混池(紫色果实池和绿色果实池)对804对分子标记引物的多态性进行筛选。通过BSA法对这些具多态性的引物进行筛选。结果有3个标记在紫色基因池和绿色基因池扩增出多态性条带，这3个标记分别是CAMS-454、ES-148、hc-139733。
经过筛选，发现分子标记CAMS-454在双亲、紫绿池间具有多态性，且该分子标记所扩增出的条带清晰，在父母本间的差异明显(图)。分子标记CAMS-454的核苷酸序列如下所示：
CAMS-454-F ：GAGCCTCTTAATGTATCTGAAAACA
CAMS-454-R：AATTTTGGTGAATCGCACCT
从图中可以看出：分子标记CAMS-454在辣椒紫色果实植株的基因组DNA扩增产物含有大小为165bp的片段；分子标记CAMS-454在辣椒绿色果实植株的基因组DNA扩增产物无大小为165bp的片段。
三、遗传连锁分析和紫色果实基因的定位
利用在双亲、紫绿池间筛选的具有多态性的分子标记CAMS-454分析F2群体的186个单株的基因型，并结合田间的鉴定结果，利用JoinMap4.0软件绘制连锁遗传图谱。运用QTLIciMapping 4.0软件，采用ICIM作图法，对F2代186个单株的紫色性状基因Pf-g进行QTL分析，得到一个QTL位点，位于CAMS-454和ES-148标记之间，该位点的LOD值为33.8，加性效应值为1.5，显性效应值为0.5，表型贡献率为57%，这个QTL位点的贡献率很高
结果表明：如图2所示，分子标记CAMS-454与紫色果实紧密连锁(图)。
实施例2、分子标记CAMS-454的应用
一、供试材料
本发明用回交群体BC1P2实施例1获得的分子标记CAMS-454进行验证。
二、实验方法
分别以上述供试材料的基因组DNA为模板，采用分子标记CAMS-454进行PCR，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对PCR扩增产物进行测序。
PCR反应体系如下：
10× Buffer (Mg2+free) 1.0µl
dNTP（2.5µmol/L） 1.0µl
MgCl2 1.0µl
引物CAMS-454-F（10µmol/L) 0.5µl
引物CAMS-454-R（10µmol/L) 0.5µl
Taq酶（5µmol/L） 0.1µl
DNA（10ng/µL） 2.0µl
ddH2O 3.9µl
Total 10μL
PCR反应程序如下：
（1）将反应物在94℃下处理4min；（2）在94℃下继续保温30s，降温至53℃，保温30s，升温至72℃保温1min，在此变温处理方式下进行35个循环处理，然后在72℃下处理7min；（3）取3µL PCR扩增产物，用8%非变性PAAG电泳检测结果。
结果表明：分子标记CAMS-454在31个紫色果单株的PCR扩增产物均含有大小为165bp的片段 (测序验证大小)，与田间鉴定结果一致，说明本发明的分子标记CAMS-454特异性强，可用于辣椒紫色果实单株的筛选。

Claims (3)

1.辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测引物，其特征在于，所述引物包括：
CAMS-454-F ：GAGCCTCTTAATGTATCTGAAAACA；
CAMS-454-R：AATTTTGGTGAATCGCACCT。
2.权利要求1所述的辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测引物在鉴定辣椒紫色果实特性方面的应用。
3.一种带有权利要求1所述的辣椒青熟期紫色果实性状紧密连锁的分子标记的特异性检测引物的分子标记物在鉴定辣椒紫色果实特性方面的应用。
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