CN112921109A - 一对用于黄瓜微型化性状鉴定的snp标记的引物、试剂盒、应用和方法 - Google Patents

一对用于黄瓜微型化性状鉴定的snp标记的引物、试剂盒、应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应用和方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物，包括正向引物F和反向引物R；所述正向引物F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述反向引物R的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物可快速对黄瓜微型化性状进行鉴定，能够有效解决表型鉴定结果可靠性低、费时、成本高、难度大等问题。

Description

一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应 用和方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应用和方法。
背景技术
黄瓜属葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，是世界上十大蔬菜作物之一。尽管黄瓜的地理分布十分广泛，但其遗传基础狭窄，导致现有可用于各种表型基因研究的材料较为缺乏，阻碍了黄瓜功能基因组学和遗传研究工作的快速发展。株型是指植物体的形态特征及空间排列方式，决定着植株的受光姿态，直接影响作物的光合效率。株型也是决定作物栽培方式的主要因子。因此，理想株型的选育对作物高效生产具有重要的理论和实践意义。目前生产中栽培的黄瓜多为蔓生品种，主蔓长度在2～3米左右。但因其生长密集，叶片堆叠程度大，常常会影响光合作用，降低光合产量，而且也易造成病害的产生和传播，最终影响栽培黄瓜的经济效益。目前生产上常常投入较多的人力进行绑蔓、打枝、疏叶摘心等工作，增加了生产成本。因此，株高适宜，叶片分布合理，可满足不同栽培条件的黄瓜理想株型的选育是黄瓜高产育种的一个重要方向，对黄瓜高效生产具有重要的理论和实践意义。而利用常规育种方法的表型鉴定来选育具有微株型表型的黄瓜品种具有耗时长，成本高、难度大等缺点。因此，迫切需要一种简单有效的黄瓜微型化性状鉴定方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应用和方法。本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物可快速对黄瓜微型化性状进行鉴定。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物，包括正向引物F和反向引物R；
所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，SNP位点的物理位置为黄瓜‘Chinese Long’基因组v2版本参考序列黄瓜7号染色体17507331核苷酸位点。
本发明提供了一种用于黄瓜微型化性状鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案中所述的引物。
本发明提供了上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述的试剂盒在筛选黄瓜微型化性状的辅助育种中的应用。
本发明提供了上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述的试剂盒在黄瓜微型化性状鉴定中的应用。
本发明提供了一种基于上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述试剂盒的鉴定黄瓜微型化性状的方法，包括如下步骤：以待检黄瓜基因组DNA为模板，利用上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物，对待测黄瓜进行基因分型；根据基因分型的结果进行黄瓜微型化性状的判定。
优选的，所述基因分型的方法包括：当SNP位点的基因型为TT时，鉴定为微型化黄瓜；当SNP位点的基因型为CC时，鉴定为正常株型黄瓜；当SNP位点的基因型为TC时，鉴定为中间株型黄瓜。
有益效果：
本发明提供了一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物，包括正向引物F和反向引物R；所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物可快速对黄瓜微型化性状进行鉴定，能够有效解决表型鉴定结果耗时长、成本高、难度大等问题。实施例的结果表明，利用本发明提供的引物对708株黄瓜样品及62个黄瓜品种进行微型化性状鉴定，鉴定结果的准确率为100％。本发明提供的引物用于黄瓜微型化性状鉴定不仅简单而且高效精准，为分子标记辅助育种提供了分子工具和理论依据。
附图说明
图1为黄瓜微型化突变体与野生型WT及其杂交F1代表型比对图；
图2为扩增序列测序结果部分峰图；
图3为本发明提供的SNP标记的引物对黄瓜62个自交系材料进行鉴定。
具体实施方式
本发明提供了一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物，包括正向引物F和反向引物R；所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述SNP位点在黄瓜基因Csa7G435510上，所述SNP位点的具体物理位置为黄瓜‘Chinese Long’基因组v2版本参考序列黄瓜7号染色体17507331核苷酸位点。本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物可快速对黄瓜微型化性状进行鉴定，不仅简单而且高效精准，能够有效解决表型鉴定结果可靠性低、费时、成本高、难度大等问题，适合用于黄瓜微型化性状的辅助育种和黄瓜微型化性状的鉴定。
本发明提供了一种用于黄瓜微型化性状鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案中所述的引物。在本发明中，所述试剂盒优选还包括2×Taq Master Mix和ddH2O。本发明提供的引物以黄瓜基因组为模板进行PCR扩增，通过分析扩增产物的基因型对黄瓜微型化性状进行鉴定。在本发明中，所述PCR扩增反应的总体系优选为24μL，包括：2×TaqMasterMix 12.0μL，ddH2O 9.0μL，正、反向引物各1μL，DNA 1.0μL。在本发明中，所述PCR的反应程序优选为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
本发明提供了上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述的试剂盒在筛选黄瓜微型化性状的辅助育种中的应用。
本发明提供了上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述的试剂盒在黄瓜微型化性状鉴定中的应用。
本发明提供了一种基于上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述试剂盒的鉴定黄瓜微型化性状的方法，包括如下步骤：以待检黄瓜基因组DNA为模板，利用上述技术方案中所述的引物或上述技术方案中所述试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物，对待测黄瓜进行基因分型；根据基因分型的结果进行黄瓜微型化性状的判定。本发明对黄瓜基因组DNA的获取方法没有特殊要求，采用本领域常规的提取方法即可。在本发明中，所述PCR扩增反应的总体系优选为24μL，包括：2×TaqMasterMix 12.0μL，ddH2O9.0μL，正、反向引物各1μL，DNA 1.0μL。在本发明中，所述PCR的反应程序优选为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。在本发明中，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述扩增产物的总长度为253bp，位于测序序列其正向扩增第35位点存在C/T多态性，本发明优选基于该位点SNP多态性判读基因型为TT、CC以及TC三种基因型。本发明根据基因分型的结果进行黄瓜微型化性状的判定。在本发明中，当SNP位点的基因型为TT时，鉴定为微型化黄瓜；当SNP位点的基因型为CC时，鉴定为正常株型黄瓜；当SNP位点的基因型为TC时，鉴定为中间株型黄瓜。本发明提供的鉴定黄瓜微型化性状的方法高效、准确，可以用于黄瓜微型化性状的辅助育种和黄瓜微型化性状的鉴定。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应用和方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
黄瓜微型化性状连锁的SNP标记的引物获得
(1)黄瓜微型化性状的获得及遗传分析
从EMS(ethyl methylsulfonate)诱变的长春密刺突变体库中筛选到一个黄瓜植株微型化的突变体mp。突变体与野生型相比，它的株高显著降低，生长势减弱、育性降低，叶片变小变深绿，无侧枝，卷须变短，子房变短，图1为黄瓜微型化突变体与野生型WT及其杂交F1代表型比对图。
以突变体mp为父本，与野生型长春密刺杂交，获得子一代F1植株，F1植株与野生型相比，株高变矮，果实长度变短，出现了中间型表型。F1代自花授粉所得的F2中，正常植株、中间型与突变体的分离比为113:255:117≈1:2:1，表明该突变体是不完全显性单基因突变体。
(2)黄瓜基因组DNA的提取
按常规方法—CTAB法提取亲本，F1及全部F2分离群体的叶片总DNA。
(3)利用BSA-seq方法初定位黄瓜微型化基因
利用群体分离法(BSA)从F2分离群体中分别随机选取微型化突变单株和正常株型单株个体各20株，建立微型化(M)和野生型(W)的基因池。采用Illumine HiSEQ 2500测序平台对两混池进行全基因组重测序。去除低质量测序reads后，利用BWA和SAMtools软件将测序数据比对黄瓜参考基因组(‘Chinese Long’v2参考基因组)进行SNP指数计算。SNP指数计算方式为：某一位点上与参考序列基因型的不同的碱基深度与该位点的总深度的比值。使用1Mb大小的窗口进行滑窗分析，每次步移100Kb，以窗口为横坐标，SNP-index为纵坐标，可以得到SNP-index在基因组上的分布曲线。并对所有染色体的SNP-index进行绘图，同时画出两个极端池在同一染色体同一窗口的ΔSNP-index绝对值在染色体上的分布，ΔSNP-index绝对值越大，表示与性状连锁的可能性也越大，同时作出置信区间为99％的阈值线，超过阈值线视为差异显著，认为是候选区域。结合SNP-index曲线与卡方分布的结果，本发明确定了潜在的候选区域，为黄瓜7号染色体15.5-17.6Mb区域内。
(4)候选基因的精细定位及连锁标记的开发
利用另一正常株型品种Hazerd与突变亲本mp进行杂交、自交后产生的F2群体进行候选基因的精细定位。首先对双亲进行全基因组重测序。分析测序数据，在初定位区域内寻找Indel及SNP差异，提取差异位点两侧序列(各400bp)，采用引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物设计，在两个亲本间进行PCR扩增，Indel标记使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，SNP标记采用一代Sanger测序进行多态性检测。其中13对引物有多态性(10对Indel标记及3对SNP标记)。用708个F2群体对13对多态性引物进行进一步筛选，寻找标记基因型与性状表现型的差别，获得标记与黄瓜微型化基因mp的交换单株。位于基因两侧的多态性标记向交换单株逐渐减少的方向步移，将目标区段缩小至引物MSNP-3和M-indel-30之间，而标记MP-SNP重组株为0，表明MP-SNP标记与微株型性状完全连锁。用JoinMap 4软件对Indel标记的结果结合植株表型绘图，结果表明黄瓜微型化调控基因和MP-SNP标记共分离，表明黄瓜微型化性状与MP-SNP标记紧密连锁，其中该SNP标记的位点为黄瓜‘ChineseLong’基因组v2版本参考序列黄瓜7号染色体17507331核苷酸位点上，具有C/T的多态性；该SNP标记的引物由正向引物F和反向引物R组成，引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
SNP标记的引物在黄瓜微型化性状鉴定中的应用
利用本发明的SNP标记的引物在突变体mp、正常株型品种Hazerd及两者的F1和F2的708份材料中进行PCR扩增测序检测，对其进行微型化性状鉴定，以表型鉴定方法作为对照方法，考察本发明提供的引物用于黄瓜微型化性状鉴定的准确性。具体方法如下：
(1)提取待测黄瓜的基因组DNA。
(2)将本发明的引物加入PCR反应体系，并对黄瓜基因组的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为：PCR扩增反应的总体系为24μL，包括：2×Taq MasterMix12.0μL，ddH2O 9.0μL，正、反向引物各1μL，DNA1.0μL。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
将扩增产物进行一代Sanger测序，分析测序结果，扩增序列如SEQ ID NO.3所示，该标记总扩增长度为253bp，位于测序序列其正向扩增第35位点存在C/T多态性，基于该位点SNP多态性判读测序单株的基因型为TT、CC以及TC三种基因型。图2为扩增序列测序结果部分峰图，图中箭头所指为其正向扩增第35核苷酸位点的不同的基因型，由上而下分别为TC、CC和TT型。具体的鉴定结果见表1。
表1本发明的SNP标记的引物对708份黄瓜样本进行微型化性状鉴定的结果
Figure BDA0002971185720000061
Figure BDA0002971185720000071
由表1的结果可知，具有TT基因型的黄瓜均为微型化表型，具有CC基因型的黄瓜单株均表现为正常株型，而具有TC基因型黄瓜的株型介于微型化与正常株型之间，为中间型表型，鉴定结果的准确率为100％，本发明提供的SNP标记的引物可以用于植株表型微型化有无的鉴定。
实施例3
选取62个已知为正常株型的黄瓜品种，结合突变体mp以及野生型亲本WT进行PCR扩增测序检测，对其基因型进行鉴定，考察本发明提供的引物用于黄瓜微型化性状鉴定的准确性。具体检测方法同实施例2，检测结果见图3。
由图3的结果可知，62个黄瓜品种与野生型亲本WT基因型一致，扩增产物的第35位碱基均为CC，而突变体mp该碱基为TT，表明本发明提供的SNP标记的引物可以将具有微株型表型的单株与正常株型的品种区分开。
上述实施例的结果表明，本发明提供的用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物不仅鉴定结果准确，而且简单、高效，可以用于黄瓜微型化性状的鉴定。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物、试剂盒、应用和方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttttttct tcagggcttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgcaacat gtgtacattc 20
<210> 3
<211> 253
<212> DNA
<213> 黄瓜(Cucumis sativus)
<400> 3
ggttttttct tcagggcttc cggtgagcat gaatcttcca gaagagtgaa gtcagaactt 60
ttagttcaag tagatggtgt aaacaacagt tcttcaggcg aagatggtag ccgtaaaata 120
gtgatggttc tggctgctac aaactttcca tgggacattg acgaggcact taggtttgtt 180
ctgttaacat gtctttcaca ctccattcaa gtaaatttga ttgtttatgt ggtgaatgta 240
cacatgttgc agc 253

Claims (7)

1.一对用于黄瓜微型化性状鉴定的SNP标记的引物，其特征在于，包括正向引物F和反向引物R；
所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，SNP位点的物理位置为黄瓜‘ChineseLong’基因组v2版本参考序列黄瓜7号染色体17507331核苷酸位点。
3.一种用于黄瓜微型化性状鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物。
4.权利要求1或2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在筛选黄瓜微型化性状的辅助育种中的应用。
5.权利要求1或2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在黄瓜微型化性状鉴定中的应用。
6.一种基于权利要求1或2所述的引物或权利要求3所述试剂盒的鉴定黄瓜微型化性状的方法，包括如下步骤：以待检黄瓜基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物，对待测黄瓜进行基因分型；根据基因分型的结果进行黄瓜微型化性状的判定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因分型的方法包括：当SNP位点的基因型为TT时，鉴定为微型化黄瓜；当SNP位点的基因型为CC时，鉴定为正常株型黄瓜；当SNP位点的基因型为TC时，鉴定为中间株型黄瓜。
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