CN107090498B - 一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物 - Google Patents
一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物，涉及分子鉴定猕猴桃种间杂种后代的引物。获得方法：①实验材料收集；②中华猕猴桃和繁花猕猴桃线粒体和叶绿体基因组序列测定及特有核苷酸多态性位点（SNP）发掘；③选定包含多个中华猕猴桃和繁花猕猴桃物种特征SNP位点的DNA区域，开发出3对叶绿体和3对线粒体鉴定引物：④采用如上引物在中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）杂交子代验证。本发明提供了一套鉴定猕猴桃种间杂种后代的分子引物；实验证明此套引物具有重复性好、稳定性高的特点；能够节省育种成本；用于快速鉴别杂交子代是否为真实的种间杂种后代，可加快猕猴桃育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子鉴定猕猴桃种间杂种后代的引物，尤其涉及一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物，用于快速鉴别杂交子代是否为真实的种间杂种后代，可加快猕猴桃育种进程。
背景技术
猕猴桃作为我国特有的雌雄异株多年生的藤本果树，因其丰富的营养价值和独特的风味已成为全球性重要水果。目前，我国猕猴桃产量和面积均居世界第一，在世界猕猴桃产业中具有举足轻重的地位；但我国猕猴桃品种性状仍然单一、产量低和品质差。猕猴桃属共有55个物种约75个分类单元，物种间具有广泛的果实表型、品质特性和遗传变异的丰富多样性，以果形美观、优质耐贮、丰产、抗逆等为育种目标，选择多个野生猕猴桃种作父母本与目前商业化栽培种（中华猕猴桃和美味猕猴桃）杂交，无疑将拓展猕猴桃品种的多样性，培育出性状优良的‘新型’猕猴桃品种。
然而，猕猴桃育种周期长，从杂交育种到开花结果需要3-5年，需要耗费大量的人力物力。此外，猕猴桃杂交子代早期的物种特征性状不明显，不能通过简单的性状判别去鉴定是否为真实的种间杂种。分子鉴定方法稳定、不受表型及环境变异影响，在判别种间杂交后代的真实性、缩短育种周期和推动作物育种发展方面具有独特优势。
猕猴桃的质体遗传独具特征：猕猴桃子代的叶绿体基因组基本属于父系遗传，线粒体基因属于母系遗传。因此，可通过发掘猕猴桃不同物种叶绿体和线粒体基因组特征序列，通过开发系列引物，基于简单PCR扩增出父本叶绿体和母本线粒体的特征DNA序列，判别子代是否为种间杂交后代。
发明内容
本发明的目的就在于提供一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物，适用于鉴定中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）子代是否为真实的种间杂种后代，在童期就可以开展分子鉴定，节省育种成本。
本发明的目的是这样实现的：
一、一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物的获得方法（简称方法）
本方法包括下列步骤：
①实验材料收集
中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）及其杂交子代群体建立；
②中华猕猴桃和繁花猕猴桃线粒体和叶绿体基因组序列测定及特有核苷酸多态性位点（SNP）发掘；
③选定包含多个中华猕猴桃和繁花猕猴桃物种特征SNP位点的DNA区域，开发出3对叶绿体和3对线粒体鉴定引物：
SEQ ID NO：7-12；SEQ ID NO：13-18；
④采用如上引物在中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）杂交子代验证
验证测试样本为真实的杂交子代必须同时满足：引物1-3扩增出的序列与父本繁花猕猴桃相同；引物4-6扩增出的序列与母本中华猕猴桃相同。
所述的中华猕猴桃和繁花猕猴桃为猕猴桃属的两个物种，其中中华猕猴桃是目前商业化栽培的种，其果皮无毛、果肉黄色；
所述的繁花猕猴桃是猕猴桃属中可作为育种应用的一个种，长势旺盛、维生素C含量较高。
与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：
①提供了一套鉴定猕猴桃种间杂种后代的分子引物，可在猕猴桃童期鉴定中华猕猴桃和繁花猕猴桃杂交子代是否为真实的种间杂种后代；
②实验证明此套引物具有重复性好、稳定性高的特点；
③能够节省育种成本；
④用于快速鉴别杂交子代是否为真实的种间杂种后代，可加快猕猴桃育种进程。
附图说明
图1是本方法的步骤图；
图2是采用杂交子代和测试种测试引物1的准确性；
图3是采用杂交子代和测试种测试引物4的准确性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
一、方法
①实验材料的获得
中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）杂交，获得杂交子代237棵；采用CTAB法提取父母本中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）的线粒体和叶绿体DNA；同时，提取30个中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）杂交子代DNA和10个对照样本（5个山梨猕猴桃和5个软枣猕猴桃）DNA作为实验验证。
②中华猕猴桃和繁花猕猴桃线粒体和叶绿体序列测定及特有核苷酸多态性位点（SNP）发掘
DNA经质量检测合格后基于Illumina HiSeq2000测序平台，对所有的分析样本构建600bp、500bp和180bp的小片段文库，对样本进行20×以上的基因组重测序分析，获得中华猕猴桃和繁花猕猴桃线粒体和叶绿体基因组序列；
首先使用Stampy软件设置为默认参数将每个序列分别比对到‘红阳’猕猴桃参考基因组，得到.bam格式的比对结果；其次，使用GATK软件包的UnifiedGenotyper对每个个体分别进行SNP检测；最后，使用GATK软件包的SelectVariants筛选符合一定测序深度的位点作为最终变异检测位点（SNP）结果。
③选定包含多个中华猕猴桃和繁花猕猴桃物种特征SNP位点的DNA区域，开发出3对叶绿体和3对线粒体鉴定引物；
在筛选出大量SNP位点中，选择符合如下特征的SNP位点区域开发引物：
a、含有中华猕猴桃和繁花猕猴桃物种特征性的位点，可用来区别其他物种；
b、目标SNP位点上、下游有80bp序列碱基序列不变，且GC含量在30%～70%，便于设计引物；基于如上标准，采用PRIMER5设计引物，引物具体要求如下：a、引物长度控制在17-30bp；b、GC含量30-70%；
c、退火温度范围在52-63℃；
d、扩增的PCR产物长度在300-2000bp；
e、引物序列中不包括其他干扰SNP位点和插入缺失序列；最终筛选获得3对线粒体和3对叶绿体引物，利用如上引物对在中华猕猴桃和繁花猕猴桃杂交后代群体中扩增测序和序列比对，检验如上引物的真实可靠性，以此证实本发明切实可行。
二、实验及其结果
检验本发明涉及的一套鉴定猕猴桃种间杂种后代的分子引物，可在猕猴桃童期鉴定中华猕猴桃和繁花猕猴桃杂交子代是否为真实的种间杂种后代，证实本发明的真实可靠性。
材料：选取中华猕猴桃、繁花猕猴桃，杂交子代和非杂交子代测试种作为材料，检验这套分子引物的有效性。
具体方法和判定条件如下：
引物为：
25μL PCR 反应使用的扩增体系：50-100ng/μL 模板DNA 1μL，10pmol/μL 正反向引物（引物的序列详见SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.15）各1μL，10mmol/L dNTP Mix 2.0μL，5U/μL TaqDNA 聚合酶0.125μL，10×PCR 反应缓冲液2.5μL，双蒸水17.375μL。
PCR扩增条件为：①94℃，5min；②94℃, 1min，55℃，1min，72℃，1min；③72℃,10min；步骤②，循环35次。
测序及数据比对：扩增的PCR产物经1%琼脂糖检测，条带清晰并符合原有设计条带大小；将PCR片段克隆入质粒，每个PCR产物挑选3个克隆送至武汉华大基因公司测序；测序数据经质量检测合格后利用Cluster X软件进行比对。
结果判定：验证本发明涉及的引物体系的真实可靠必须满足，通过简单的PCR检测和测序，杂交子代必须同时满足①引物1-3扩增出的序列与父本繁花猕猴桃相同；②引物4-6扩增出的序列与母本中华猕猴桃相同。
本实验的结果：
我们通过测定子代与父母本序列相似性，发现本发明涉及的引物体系100%真实可靠。以引物1和4为例，利用引物1扩增出的序列与父本繁花猕猴桃100%相同，同时引物4扩增出的序列与母本中华猕猴桃100%相同；同时，我们的对照测试种（山梨猕猴桃和软枣猕猴桃）利用引物1扩增出的序列与繁花猕猴桃只有94%-96%相似性（图2），引物4扩增出的序列与中华猕猴桃只有96%-97%相似性（图3）。这说明杂交子代同时具备父本繁花猕猴桃和母本中华猕猴桃的叶绿体和线粒体基因序列，为真实的种间杂种；而本套引物简单易行，可用来鉴定中华猕猴桃（雌）和繁花猕猴桃（雄）杂交子代的真实性，节省育种成本。
序列表
<110>中国科学院武汉植物园
<120>一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物
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Claims (1)
1.一套中华和繁花猕猴桃种间杂交子代鉴定引物，其特征在于：
选定包含多个中华猕猴桃和繁花猕猴桃物种特征SNP位点的DNA区域，开发出3对叶绿体和3对线粒体鉴定引物：
3对叶绿体鉴定引物：SEQ ID NO：7-12：
序列7：5’-ATCCTTTTTTGTTAGCA-3’，
序列8：5’-GGATTTTCAGTCCTCTGCTCT-3’，
序列9：5’-CGAGTATCGTAATTGGAATACTCGT-3’，
序列10：5’-AGGATCCGCTATGATAATGAGAAAGA-3’，
序列11：5’-ACTCCTGACTATGAAACCAAAGA-3’，
序列12：5’-ACCTGTTTCAGACTGTGCTT-3’；
3对线粒体鉴定引物：SEQ ID NO：13-18：
序列13：5’-TCATTTCGTGGAAGTCCCCG-3’，
序列14：5’-CTATGTTAGCTAGCGGGGGC-3’，
序列15：5’-TGCCAAGATGACGGATCCTG-3’，
序列16：5’-TAGTGAGCGGTTCTTTCGGG-3’，
序列17：5’-TTTCCAGTTTGTCGGTCCCC-3’，
序列18：5’-GCGGTGTGAAAGGAATAGCG-3’。
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| KR20080099735A (ko) * | 2007-05-10 | 2008-11-13 | 연세대학교 산학협력단 | 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배니코티아나 벤타미아나（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）유래의 ＩｓｐＥ |
| CN104611443A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-05-13 | 中国科学院武汉植物园 | 猕猴桃种间杂交品种金艳的分子鉴定方法 |
-
2017
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RETICULATE EVOLUTION IN KIWIFRUIT (ACTINIDIA, ACTINIDIACEAE) IDENTIFIED BY COMPARING THEIR MATERNAL AND PATERNAL PHYLOGENIES;JOËLLE CHAT et.al.;《American Journal of Botany》;20040531;第91卷(第5期);第736–747页 * |
| 利用多分子标记分析‘和平红阳’猕猴桃的性别差异;杨妙贤等;《果树学报》;20141231;第31卷(第1期);第13-19页 * |
Also Published As
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