KR20220132985A - 고추 착과 방향성 예측용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents
고추 착과 방향성 예측용 분자마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다,
Description
본 발명은 고추 착과 방향성 예측용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추 착과의 방향성을 판별할 수 있는 6개의 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 고추 착과의 방향성 예측방법에 관한 것이다.
고추(Capsicum spp L.)는 중앙아메리카와 남아메리카에서 기원했으며, 중요한 가지과 작물이다. 캡시큠(Capsicum) 속에 속한 식물 중 캡시큠 안늄(C. annuum), 캡시큠 프루테스센스(C. frutescens), 캡시큠 박카튬(C. baccatum), 캡시큠 치넨세(C. chinense) 및 캡시큠 푸베스센스(C. pubescens) 다섯 종은 6,000년 전에 순화된 것으로 알려져 있다. 고추는 음식을 보존하는 용도와 약으로 사용되기 시작하였고, 이후 향신료와 먹는 채소의 형태로 소비되었다. 야생 고추는 작고 부드러운 과실이 맺히며 빨간색으로 톡 쏘는 맛을 가지고 있으며, 잎은 작고 솜털이 존재하는 형태였다. 그러나 여러 가지 색상과, 털이 없으며 잎이 크고 덜 톡 쏘는 맛을 가진 고추가 순화기간 동안 선발되었다. 또한, 고추 과실 착과의 상향형에서 하향형으로의 변화는 순화과정 중 일어난 주요 특징 중의 하나이다. 상향형에서 하향형으로의 변화는 과실의 크기 증가, 과경의 길이 증가 및 굵기의 감소, 태양광으로부터의 더 나은 보호, 새와 같은 포식자로부터의 보호를 가능하게 하였다. 과경에 관련된 다른 선행연구들을 살펴보면 애기장대의 BREVIPEDICELLUS (BP) 유전자는 과경의 세포증식과 과경의 배축의 굽음을 조절한다고 알려졌다. 또한 담배에서는 과경 방향과 과경의 확장은 MADS-box 유전자 NtSVP (SHORT VEGETATIVE PHASE)의 역할이라고 보고되었다. 유사하게 토마토에서는 S1AGO7 (ARGONAUTE7) 유전자가 과경의 상향형과 관련되었음이 보고되었다.
고추에서 과실 착과 방향에 관한 유전적 연구가 있었으며(Cheng et al., 2016, Scientific reports, 6;1-11), 이들 연구에서 과실의 착과방향성은 염색체 12번에 위치한 단일 유전자에 의한 질적 형질임을 밝혔다. Saengryeog 211 (하향형), Saengryeog 213 (상향형), 이들의 F1 그리고 BC1 자손을 사용한 선행연구에서는 up 유전자가 열성유전자임을 밝혀내었으며(Lee et al., 2008, Molecules & Cells (Springer Science & Business Media BV); 26), up 지역으로부터 4.3 cM의 유전적 거리를 가지고 있는 upCAPS 마커를 개발하였다. 그리고 2016년에는 재조합순계 집단을 사용한 초고밀도 bin mapping에서는 FP-12.2에서 과실의 착과방향성을 조절하는 주요 QTL (quantitative trait loci)을 보고하였다. 상기 보고된 지역은 CM344 표준유전체 기준으로 하였을 때 염색체 12번 199.6Mb 지역에 위치하였으며, 해당 위치는 표현형 변이의 40% 이상을 설명하는 결과를 보여주었다(Han et al., 2016, DNA Research, 23;81-91). 하지만 선행 연구결과로는 착과 방향를 조절하는 유전자를 포함하고 있는 지역이 너무 넓어서 유전자를 동정하기에 부적합하다.
이에 본 발명에서는 핵심집단을 사용한 GWAS (genome-wide association study) 분석결과를 두 개의 재조합순계(recombinant inbred line: RIL) 집단과 3개의 F2 집단에 적용하여, 새로운 집단 내에서 up 유전자좌의 세밀 유전자 지도 작성를 통해 고추 과실의 착과방향과 관련된 유전자의 위치를 밝혀내었다.
한편, 한국공개특허 제2005-0078972호에는 '열매 및 종자 발달 조절용 유전자'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '고추 착과 방향성 예측용 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 고추의 착과 방향성을 조절하는 유전자와 이의 위치를 동정하기 위해 하나의 F2 집단과 두 개의 재조합순계(RIL) 집단을 사용하여 QTL 맵핑을 통해 착과 방향성을 조절하는 유전자의 위치를 확인한 결과 고추 과실의 착과 방향성과 관련된 공통된 QTL 지역이 염색체 12번에서 발견되었다. 그리고, C. annuum 196개, C. baccatum 25개, C. chinense 21개, C. frutescens 4개 자원으로 구성된 고추 핵심집단을 GBS (genotyping-by-sequencing) 방법으로 분석하여 총 187,966 SNPs를 얻었으며, 착과 표현형에 대한 GWAS 분석을 진행하였다. QTL 맵핑과 GWAS 결과를 바탕으로 하였을 때, up 유전자좌의 후보 지역은 고추 염색체 12번 200-250 Mb 지역에 공통적으로 위치한 것으로 확인되었다. 상기 결과를 토대로 정확한 연관마커를 개발하기 위하여 F2 집단을 이용하여 후보 지역에서 과실의 착과 방향성과 완전연관된 마커 두 개를 포함하여 총 여섯 개의 마커를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물을 이용한 고추 착과의 방향성 예측방법을 제공한다.
본 발명에서는 새로운 고추 집단 내에서 up 유전자좌의 세밀 유전자 지도 작성를 통해 고추 과실의 착과 방향성과 관련된 유전자의 위치를 밝혀내었으며, 개발된 분자마커는 고추 과실의 착과 방향성을 정확하게 예측(판별)할 수 있으므로, 고추 품종 개량 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 과경 곡률과 과실 착과방향 표현형에 관한 것으로, (A)는 서로 다른 곡률의 위치를 가진 과경을 빨간별로 표시하였으며, (B) 및 (C)는 과실 형태의 수직 상향형과 수직 하향형을 보여준다.
도 2는 과실 착과방향의 다양성을 보여주는 사진으로, (A)는 수평 하향형 표현형이고, (B)는 수평 상향형 표현형이다.
도 3은 과실의 착과방향성에 대한 다른 집단들의 QTL 결과와 핵심집단의 GWAS 결과를 보여주는 것으로, (A)는 과실의 착과방향성에 관련된 핵심집단의 Manhattan plot으로 염색체 12 (-LogP of 47) 번에서 뚜렷한 피크를 보여준다. (B) 내지 (D)는 PD, FC 및 MJ 집단들의 결과로, 유사하게 염색체 12번에서 뚜렷한 QTL 피크를 보여준다. 가장 높은 피크는 PD 집단에서, FC 집단에서는 두 개의 피크, MJ 집단에서는 넓은 지역에서 낮은 LOD 점수를 보였다.
도 4는 과실의 착과방향성과 관련된 HRM 분석 결과로, 표 4의 마커를 LA-F2 집단에 사용한 결과이다. 6개의 HRM 마커들은 우성인 하향형(녹색), 열성인 상향형(빨강), 이형접합(파랑)의 유전형을 구분하였다. UP199_942와 UP199_462 마커는 완전연관된(0 cM) 마커이다.
도 5는 up 유전자좌의 물리적 지도이다. 개발된 6개의 마커들이 염색체 12번에 218-222 Mbp 사이에 위치함을 보여주고 있으며, LP97 열성 동형접합, 이형접합, 그리고 A79 우성 동형접합의 유전형은 빨간색, 하얀색, 녹색으로 표시하였다. DNA 마커들은 수평선 위에 표시하였으며 마커들 이름 위에 숫자는 재조합 식물체의 개수를 나타낸다.
도 6은 LA-F2 집단에서 up 유전자좌의 물리적 지도와 유전적 지도 사이의 신터니(synteny)이다.
도 2는 과실 착과방향의 다양성을 보여주는 사진으로, (A)는 수평 하향형 표현형이고, (B)는 수평 상향형 표현형이다.
도 3은 과실의 착과방향성에 대한 다른 집단들의 QTL 결과와 핵심집단의 GWAS 결과를 보여주는 것으로, (A)는 과실의 착과방향성에 관련된 핵심집단의 Manhattan plot으로 염색체 12 (-LogP of 47) 번에서 뚜렷한 피크를 보여준다. (B) 내지 (D)는 PD, FC 및 MJ 집단들의 결과로, 유사하게 염색체 12번에서 뚜렷한 QTL 피크를 보여준다. 가장 높은 피크는 PD 집단에서, FC 집단에서는 두 개의 피크, MJ 집단에서는 넓은 지역에서 낮은 LOD 점수를 보였다.
도 4는 과실의 착과방향성과 관련된 HRM 분석 결과로, 표 4의 마커를 LA-F2 집단에 사용한 결과이다. 6개의 HRM 마커들은 우성인 하향형(녹색), 열성인 상향형(빨강), 이형접합(파랑)의 유전형을 구분하였다. UP199_942와 UP199_462 마커는 완전연관된(0 cM) 마커이다.
도 5는 up 유전자좌의 물리적 지도이다. 개발된 6개의 마커들이 염색체 12번에 218-222 Mbp 사이에 위치함을 보여주고 있으며, LP97 열성 동형접합, 이형접합, 그리고 A79 우성 동형접합의 유전형은 빨간색, 하얀색, 녹색으로 표시하였다. DNA 마커들은 수평선 위에 표시하였으며 마커들 이름 위에 숫자는 재조합 식물체의 개수를 나타낸다.
도 6은 LA-F2 집단에서 up 유전자좌의 물리적 지도와 유전적 지도 사이의 신터니(synteny)이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 프라이머 세트는 HRM(High-resolution melting)용 프라이머 세트일 수 있다. 본 발명의 용어 "HRM(High-resolution melting)"은 전기영동 없이 유전형질을 검정하는 분석방법으로, SNP (single nucleotide polymorphism)를 이용한 PCR 기반의 분석 기법으로 SNP 형태에 따라 형광시료가 감소하는 양상을 해리곡선(melting curve)으로 나타내어 유전형을 구분하는 방법이다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 고추의 과실 방향(상향성 혹은 하향성)과 관련된 up 유전자에서 특이적으로 차별화되는 SNP 염기 타입을 검출할 수 있는 프라이머 세트로, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 서열번호 12 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(21개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 6개의 프라이머 세트를 포함하는 것으로, 상기 프라이머 세트에 관한 상세한 내용은 전술한 것과 같다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측방법을 제공한다.
본 발명의 예측방법에 있어서, 상기 고추 시료는 하배축, 떡잎, 잎, 과실, 뿌리, 줄기 또는 꽃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 예측방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. HRM (High-resolution melting) 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다. 또한, 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
본 발명에는 과실의 방향성이 상향형인 'Micropep' (Capsicum annuum)과 하향형인 'Jeju' (C. annuum)를 교배한 F2 식물체 219개, 상향형 'Lp97' (C. annuum)과 하향형 'A79' (C. annuum)를 교배한 F2 식물체 379개, 상향형 'U92' (C. annuum)과 하향형 'A106' (C. annuum)을 교배한 F2 식물체 63개, 상향형 'Perennial'과 하향형 'Dempsey' 조합인 77계통, 상향형 '35001 (F)'와 하향형 '35009 (C)' 조합인 174계통인 C. annuum에 속하는 두 개의 재조합순계 집단을 사용하였다. 또한 각각의 부모의 이름의 초성을 차용하여 각각의 집단을 MJ, LA, UA, PD, FC로 명명하였다. 부모계통인 Lp79, A79, U92, A106은 에코씨드(한국)에서 제공받았다. C. annuum 196개, C. baccatum 25개, C. chinense 21개 및 C. frutescens 14개로 구성된 핵심집단은 GWAS를 시행하는데 사용되었다.
2. 재배환경과 표현형 조사
양친에서 유래한 다섯 계통은 대한민국 서울대학교 수원농장의 노지 또는 온실에 파종하였다. MJ 집단의 경우 2017년에는 온실에서 재배하였으며, 2018년에는 노지에서 재배하였다. FC와 PD 집단은 2016년부터 2018년까지 2년간 온실에서 재배하였고 UA와 LA 집단은 2018년과 2019년 각각 온실에서 재배하였다. 또한, 핵심집단의 경우 대한민국 안성에 위치한 종자회사인 바이오통크랍사이언스㈜의 온실에서 재배하였다. 각 계통집단의 F1, F2는 대립성 검사에 사용되었고 모든 식물체의 과실의 방향을 데이터로 기록하였다. 실험에서 내재된 양적 형질은 각 계통의 다섯 개의 대표적인 표본으로 측정하였다. 과경과 과실의 길이와 너비는 측경 양각기(caliper)를 사용하였고 과실의 무게를 측정할 경우, 전자저울을 통해 측정하였다.
3. Genomic DNA 추출
2개 또는 3개의 어린잎을 사용하여 게노믹 DNA 추출에 사용하였고 TissueLyserⅡ (Qiagen, Germany)를 사용하여 잎 조직을 균질화하였다. CTAB (cetyl trimethylammonium bromie) 방법에 의해 추출된 게노믹 DNA 샘플은 NanoDrop (NanoDrop Technoogies, USA)을 사용하여 농도와 순도를 측정하였다. 또한, 260/280 비율이 1.8 이상인 DNA 샘플들은 50 ng/㎕로 희석하였다.
4. Genotyping-by-sequencing (GBS)
GBS 라이브러리는 EcoRI 어댑터를 포함하여 EcoRI 및 MesI 효소를 사용하여 제작하였다. pooling된 라이브러리들은 마크로젠(한국)에서 HiSeq2000 sequencing system (Illumina, Inc, USA)을 사용하여 시퀀싱을 진행하였다.
5. SNP 마커 개발과 분자 마커들의 연관분석
PD의 염기서열 재분석(Han et al., 2018, Plant biotechnology journal, 16;1546-1558)과 FC, MJ의 GBS 결과 분석은 업데이트된 C. annuum cv. CM334 ver 1.6 (http://peppergenome.snu.ac.kr/), "L_Zunla-1"(http://peppersequence.genomics.cn) 표준유전체와 새롭게 개발된 'Dempsey v.1.0' 표준유전체를 사용하여 수행하였다. Quality control과 GBS 서열 데이터 트리밍(trimming)은 Q20과 함께 CLC Genomics Workbench v6.5 (QIAGEN, Denmark)를 사용하여 실행하였으며 최소 리드(reads) 길이는 30 bp로 설정하였다. 다듬어진 시퀀싱 리드는 Burrows-Wheeler Aligner version 0.7.12에 의해 각각 표준유전체에 맵핑하였다. Picard Tools version 1.119와 SAMtools version 1.1은 리드들을 그룹화하고 분류하는데 사용하였다. 그리고 genome wide SNP calling을 위해 Genome Analysis Toolkit Unified Genotyper version 3.3을 사용하였으며 추후 연구를 위해 질적 value가 30보다 크고 최소 depth가 3인 고품질 SNPs를 선발하였다. Sliding window approach 방법에 따라 Bin linkage map이 만들어졌으며 이전에 연구된 방법을 바탕으로 하여 손실된 데이터와 유전형의 오류를 수정하였다(Han et al., 2016, DNA Research, 23;81-91). Windows QTL Cartographer 2.5는 강력한 분석 기술인 Composite Interval Mapping (CIM)을 사용한 PD, FC, MJ 집단들의 과실 착과 방향성과 관련된 QTL 분석에 사용하였다.
Genomic Association and Prediction Integrated Tool (GAPIT)의 설정된 값을 이용하여 Settlement of MLM Under Progressively Exclusive Relationship (SUPER) GWAS를 시행하였다(Wang et al., 2014, PloS one, 9;e107684). 모든 연관된 분석들의 확률은 선행연구들을 따라 log10P (0.05)로 전환하였다(Siddique et al,. 2019, Scientific reports, 9;1-15). 또한, Manhattan plots에서 SNP가 특정 역치에 도달하는지 아닌지에 따라 염색체 12번의 점수들을 검사하였다. Bonferroni multiple test correction으로 GWAS로부터의 SNP들의 log10P 값을 조정하였다.
본 발명에서 개발한 HRM (high resolution melting) 마커들은 Real-time PCR thermocycler (Rotor-Gene 6000, Qiagene, USA)를 사용하여 F2 집단의 유전형 분석에 이용되었다. HRM은 Hipi PCR buffer 2 ㎕, 10 mM dNTPs 2 ㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 0.5 ㎕, 50 ng/㎕의 gDNA 2 ㎕, Home-taq 0.3 ㎕, 1.25 μM Syto9 0.6 ㎕, 3차 증류수 12.1 ㎕를 혼합한 총 20 ㎕의 부피 반응물로 진행하였다. 또한, HRM은 95℃ 변성 5분; 95℃에서 20초, 57℃에서 20초, 72℃에서 20초의 단계를 총 55회 반복 수행; 및 유지 온도 60℃;로 기본 설정한 후, 분석은 매분 마다 65℃부터 95℃까지 0.1℃ 증가하는 설정으로 실행하였다. UP199_462, UP199_942 및 RSM_+28KB 마커의 경우, 95℃ 변성 10분; 96℃ 20초, 57℃에서 20초, 72℃에서 40초의 단계를 총 50회 반복 수행한 후 유지 온도 95℃ 1분 및 40℃ 1분을 수행하였고, HRM 분석은 매분 마다 65℃부터 95℃까지 0.1℃ 증가하는 설정으로 분석하였다.
6. PCR 증폭과
up
유전자의 위치
실험 전반에 걸쳐, PCR은 총 부피 50 ㎕의 혼합반응물로 수행하였다. 혼합 반응물에는 50 ng/㎕의 희석 DNA, 10X PCR buffer, 0.1 mM dNTP mix, 10 pmoles/㎕의 정방향 및 역방향 프라이머, 1 U Taq DNA 중합효소 (Takara Korea Biomedical Inc.)를 혼합하여 사용하였다. PCR 증폭 프로그램은 35 주기를 설정하였으며, 95℃에서 5분, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초, 마지막 단계에서 72℃에서 10분을 설정하였다. GXL-Taq (Takara Korea Biomedical Inc.)의 경우 98℃에서 5분, 98℃에서 15초, 60℃에서 15초, 68℃에서 1분 30초, 마지막 단계에서 68℃에서 10분으로 설정하여 증폭을 진행하였다. PCR 프라이머는 Primer3 software (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)를 사용하여 제작하였다. 그리고 표현형과 유전형의 공분리 분석은 FC, MJ, UA, LA 집단에 사용할 수 있는 근접한 SNP 마커를 개발하기 위해 수행하였다. 표현형과 공분리된 다형성 마커들은 MAPMAKER/EXP3.0 프로그램을 사용하여 합쳤으며 이 데이터들은 유전연관지도 개발을 위해 사용하였다.
실시예 1. 고추에서 과실의 방향과 과실 방향의 일시적인 변화
과경의 곡률에 의해 조절되는 과실의 착과방향성은 과경의 굽음이 발생하는 다양한 상대적 위치인 가지와 가까운 지점, 과실로부터 먼 지점과 연관된다(도 1A). 과경의 곡률을 관찰하는 실험에서 사용된 부모라인의 식물체들은 초기 개화 단계에서 명백하게 하향형의 표현형을 보였다(도 1B, 1C). 그러나 LA F2 (LP97 X A97) 집단의 경우 과실의 착과방향성은 개화기와 초기 개화기 단계에서는 결정되지 않았으며 생장 단계가 전환되면서 표현형이 변화하는 모습을 보였다. 수평적 하향형과 수평적 상향형의 경우 과경의 곡률이 관찰되었을 뿐만 아니라 전반적으로 과경의 길이와 과실의 무게, 가지의 생장에 따라 전반적으로 구조를 잃는 것으로 보였다(도 2). 따라서, 긴 가지들과 무거운 과실로 인한 구조를 잃은 고추들은 과경이 상향형임에도 불구하고 수평적 구조 또는 하향형의 모습을 보였다.
실시예 2. 과실 착과방향성에 관한 유전 분석
착과방향성의 유전과 선행연구 내용을 확인하고 이해하기 위해 같은 종 내의 두 개의 서로 다른 집단을 사용하였다. C. annuum의 부모 라인인 A79와 Jeju는 하향형의 과실 착과방향성을 보이는 반면, LP97 및 Micropep은 상향형의 과실 착과방향성을 보였다. 비록 과실의 착과방향성은 질적 형질로 보이지만, 본 발명에서는 모든 과실이 수직의 방향으로 상향형과 하향형의 모습을 보이는 것과 주로 하향형이면서 수직적인 모습을 보이다가 자라면서 수평의 방향으로 향하는 수평 하향형과 수평 상향형 4가지 형태가 관찰되었다(도 1C, 도 2A 및 도 2B). 이에 본 발명의 유전 연구에서는 수평적 하향형은 하향형으로 수평적 상향형은 상향형으로 간주하였다.
상기 기준에 준하여 판단한 결과, LA 집단의 379개의 F2 개체 중에 291개가 하향형이었으며 88개가 상향형이었다. 따라서 멘델의 분리비인 3:1 비율과 일치했고 up 유전자는 단일 열성 유전자임을 확인하였다(X2=0.64, p=0.50). 유사하게 MJ 집단의 214개의 F2 개체 중에 154개가 하향형의 표현형을 보였으며 60개에서 상향형의 표현형을 보였다. MJ 집단의 분리비 또한 멘델의 분리비와 일치했다(3:1, X2=1.05, p=0.30). 상기와 같은 결과들은 고추에서 과실의 착과방향성과 관련된 유전자는 열성유전자임을 제시한다(표 1).
| Population | Generation | No. of plants | Phenotype | Expected ratio | |||
| Pendant | Erect | Pendant : Erect | X2 | P-value | |||
| A79 | parent | 20 | 20 | - | 20:0 | ||
| LP97 | parent | 20 | - | 20 | 0:20 | ||
| LA | F2 | 379 | 291 | 88 | 3:1 | 0.64 | 0.50 |
| MJ | F2 | 214 | 154 | 60 | 3:1 | 1.05 | 0.30 |
또한, 과실의 착과방향성은 핵심집단인 C. annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens 4개의 Capsicum 종에서도 상향형(Erect)과 하향형(Pendant)의 분리가 발생했다(표 2).
| Species | Fruit orientation | Total | |
| Pendant | Erect | ||
| C. annuum | 139 | 57 | 196 |
| C. baccatum | 21 | 4 | 25 |
| C. chinense | 20 | 1 | 21 |
| C. frutescens | 2 | 12 | 14 |
실시예 3.
up
유전자 위치에 대한 목표 지역의 localization
수평적 하향형과 수평적 상향형의 표현형은 하향형과 상향형으로 간주하였으며, 제시한 유전적 연구는 과실의 착과방향성이 단일 또는 하나의 주요 유전자에 의해 조절된다고 제시되었다. 그러나 Cheng과 그들의 동료들의 연구(Cheng et al., 2016, Scientific reports, 6;1-11)에서 서술한 것처럼, 완벽한 질적 형질은 아니였다. 따라서 본 발명자는 유전자의 맵핑 전에, 다른 부모 집단들에서 QTL적 접근을 사용하여 관련된 분석을 하고자 하였으며 다양한 패널(panel)을 사용한 Super GWAS를 통해 공동 위치된 지역을 찾고자 하였다.
PD 집단에서, 우리는 물리적 위치가 염색체 12번에서 203-208 Mbp인 곳에서 표현형 변이가 49.1% (LOD: 20.9)에서 51.4% (LOD: 22.5)인 두 개의 QTL을 확인하였다(도 3B). 또한, LOD 값이 5.7과 6.4(도 3C)인 두 개의 높은 피크가 있었으며 FC 집단에서는 세 개의 QTL들이 염색체 12번의 물리적 위치 97.6-229.8 Mbp 사이에 있다는 것을 확인하였다. 상기 세 개의 QTL들은 7.2-10.5% 표현형 변이를 가지고 있었다(도 3C). MJ 집단에서는 열 개의 QTL들이 염색체 12번의 물리적 위치 57.7-242Mb 사이에서 관찰되었으며 표현형 변이는 최대 LOD 값의 8.1-39.6% (R2)로 확인되었다(도 3D, 표 3).
| Population | Chromosome | QTL Position | LOD | Additive | Dominant | R2 |
| PD | 12 | 165.81 | 20.9 | 0.5004 | 0 | 49.1 |
| PD | 12 | 168.71 | 22.5 | 0.5156 | 0 | 51.4 |
| FC | 12 | 113.41 | 5.7 | -0.1824 | 0 | 9.6 |
| FC | 12 | 119.71 | 4.2 | -0.1634 | 0 | 7.2 |
| FC | 12 | 180.61 | 6.4 | -0.2 | 0 | 10.5 |
| MJ | 12 | 78.21 | 4.9 | 0.1454 | -0.4901 | 17.75 |
| MJ | 12 | 89.51 | 5.4 | 0.1735 | -0.473 | 25.0 |
| MJ | 12 | 102.91 | 7.4 | 0.2187 | -0.5277 | 38.7 |
| MJ | 12 | 116.81 | 8.4 | 0.0911 | -0.6013 | 16.1 |
| MJ | 12 | 127.91 | 7.4 | 0.087 | -0.6285 | 12.4 |
| MJ | 12 | 138.51 | 11.6 | 0.0343 | -0.6746 | 8.1 |
| MJ | 12 | 146.31 | 13.8 | 0.0739 | -0.7257 | 11.0 |
| MJ | 12 | 153.81 | 10.1 | 0.03 | -0.6113 | 10.3 |
| MJ | 12 | 159.71 | 9.7 | 0.111 | -0.5718 | 39.6 |
| MJ | 12 | 171.71 | 7.9 | 0.0722 | -0.536 | 19.2 |
QTL 맵핑에서, GWAS 수행을 위한 핵심집단 고추 256개 식물체(표 2)의 SNP 데이터를 사용하였다. 그리고 후속 분석을 위해, Minor allele frequency > 0.05, SNP coverage > 0.6, inbreeding coefficient > 0.8의 필터링(filtering) 기준이 적용되었고, 176,951개의 고품질의 SNPs를 획득하였다. 그리고 염색체 12번에서 무작위적으로 -log10(p) 값 > 26인 Bonferroni correction을 넘는 모든 거짓 양의 값의 결과들을 제외하고, 205-214 Mbp에서 과실의 착과방향성과 관련된 열 네개의 높고 뚜렷한 SNPs를 확인하였다(도 3A).
실시예 4.
up
유전자의 Fine-mapping과 마커 확인
PD와 FC 및 MJ의 QTL 분석과 핵심집단의 GWAS 분석결과, 염색체 12번 200-250 Mbp에서 과실의 착과방향성을 조절하는 유전자와 관련된 지역을 공통되게 확인하였다. 따라서, 379개의 식물체로 구성된 LA-F2 집단 중 335개의 식물체를 사용하여 예측되는 up 유전자 지역을 목표로 하여 Dempsey v.1.0 표준유전체 서열을 바탕으로 하여 유전체 수준(genome wide)으로 프라이머를 설계하였다. 또한, 특정 프라이머로 증폭된 지역의 서열분석을 통해 발견한 SNPs를 바탕으로 하여 6개의 과실의 착과방향성과 관련된 HRM 마커를 개발하였다(표 4). 개발된 6개의 HRM 마커들은 우성 동형접합, 이형접합, 열성 동형접합의 유전형을 구분할 수 있는 마커로 확인되었다(도 4). 표 4의 'Sequence position on chromosome12 Dempsey'는 정방향 프라이머(F)의 5' 첫 번째 염기의 위치를 의미한다.
| Marker name | Primer Sequence (5'→3') (서열번호) |
Sequence position on chromosome12 Dempsey | Amplicon size (bp) |
| DLMT218_191 | F: GGATTCTCGGGGTATTACAGG (1) | 218193136 | 192 |
| R: TGTACCCTCCCCAGGTAGTAAG (2) | |||
| UP199_462 | F: CTTTGGACCCCATTCTGATG (3) | 219677187 | 189 |
| R: TTTCTTAAACCCGGATAAGCTG (4) | |||
| UP199_942 | F: CGACGACCATCGTGTCTAAG (5) | 220233699 | 230 |
| R: CCTCATTCCCTGCATTTTGT (6) | |||
| UPKI541 | F: GCATGTCCCAACACTTTGTG (7) | 220775872 | 210 |
| R: TACCAAATGCACCACACCTAAG (8) | |||
| Kidus13-1 | F: ATGGCTATATGGGGATCAATCT (9) | 221725211 | 250 |
| R: AGTGCTTTTGCAAGTATGAAGT (10) | |||
| RSM_+28KB | F: GTCATAGAAAAATGGCTTGC (11) | 221727694 | 249 |
| R:TTGAGAAGAGGTGTGATGAGATAAG (12) |
표 4에서 각 마커는 증폭산물인 amplicon 내에 다음과 같은 SNP 염기[상향/하향]를 포함하고 있다: DLMT218_191, T/C 및 A/T; UP199_462, G/A; UP199_942, G/A; UPKI541, G/A, T/C, C/T 및 C/A; Kidus13-1, A/G, G/T 및 T/C; RSM_+28KB, T/C.
Dempsey v.1.0 표준유전체 서열을 바탕으로 하였을 때, 염색체 12번의 218 Mbp 지역에 위치한 DLMT218_191 마커와 221 Mb지역에 위치한 RSM_+28 Kb 마커 사이의 물리적 거리는 약 3.53 Mb로 확인되었으며 유전적 거리는 각각 0.6 cM, 4.18 cM로 확인하였다. 두 마커 사이 지역에서 프라이머를 무작위(random)하게 설계하여 서열분석 후 SNP를 찾아 4개의 마커를 개발하였으며 이 4개의 마커들은 부모 집단인 LP97, A79에서 다형성을 보였다. 최종적으로, up 유전자의 위치를 DLMT218_191 마커와 UPKI541 사이로 좁혔으며 두 마커 사이의 물리적 거리는 약 2.58 Mbp이며 유전적 거리는 0.6 cM, 0.9 cM을 확인하였다. 또한 DLMT218_191과 UPKI541 마커 사이 구간에서 2개의 완전 연관된 UP199_462와 UP199_942 0 cM 마커를 개발하였다(도 5 및 도 6).
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Molecular marker for predicting fruit orientation in pepper and
uses thereof
<130> PN21061
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ggattctcgg ggtattacag g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
tgtaccctcc ccaggtagta ag 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ctttggaccc cattctgatg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tttcttaaac ccggataagc tg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
cgacgaccat cgtgtctaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
cctcattccc tgcattttgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gcatgtccca acactttgtg 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
taccaaatgc accacaccta ag 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
atggctatat ggggatcaat ct 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
agtgcttttg caagtatgaa gt 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
gtcatagaaa aatggcttgc 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ttgagaagag gtgtgatgag ataag 25
Claims (5)
- 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 프라이머 세트 조성물.
- 제1항의 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측용 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인 고추 착과의 방향성 예측용 키트.
- 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 착과의 방향성 예측방법. - 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 고추 착과의 방향성 예측방법.
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| Cheng, J. et al., Scientific Reports (2016) volume 6, Article number:33293 * |
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