CN104726563A

CN104726563A - 与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记及应用

Info

Publication number: CN104726563A
Application number: CN201510079032.XA
Authority: CN
Inventors: 曲存民; 李加纳; 卢坤; 付福友; 王瑞; 徐新福; 张凯
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN104726563B

Abstract

本发明属于植物分子遗传学技术领域，具体涉及与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记及应用。本发明的目的是为今后色泽主效QTL的精细定位及克隆提供一种新选择。本发明公开了与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记SWUA09-355，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了扩增所述分子标记的引物以及获得所述分子标记的方法。本发明定位了一种与种皮色泽性状紧密连锁的SSR分子标记SWUA09-355，该主效QTL在不同环境中可解释41.38％-64.17％的表型变异。

Description

与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明属于植物分子遗传学技术领域，具体涉及与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记及应用。

背景技术

甘蓝型油菜属于十字花科，在世界油料作物中占有重要地位，是继大豆油和棕榈油之后的第三大植物油来源，也是植物蛋白饲料的重要来源之一。在油菜遗传育种中，黄籽性状之所以会引起国内外育种家们的高度关注，主要是因为在相同的遗传背景下，与黑籽相比，黄籽甘蓝型油菜品系具有种皮薄，含油量和蛋白质含量高，皮壳率、木质素、纤维素和多酚含量低，品质良好等一系列优点(Rahman et al.,2001；Theander et al.,1977)。研究结果表明，一般的甘蓝型油菜的黄籽品系纤维素含量比黑籽低5％(Theanderet al.,1977)，而含油量和蛋白质含量分别高2.5％和2.6-5％(Daun and DeClercq,1988；Shirzadegan and Rbbelen,1985)。另外，黄籽油菜在压榨后，油质清澈透明，毛油中色素少，易于脱色加工，经榨取后的饼粕中蛋白质含量高、木质素和纤维素含量低，有毒物质或抗营养物质(主要包括硫苷、植酸、单宁和芥子碱等)少等，提高了饼粕的饲用价值(Meng et al.,1998；Tang et al.,1997)。近年来，随着菜籽油逐渐被用于生物柴油原料油(Sensoz et al.,2000)，且黄籽菜油比黑籽菜油更易于合成高质量的生物柴油，制作成本也比较低。因此，自20世纪80年代以来，国内外都将甘蓝型黄籽油菜选育作为油菜育种的重要主攻方向，油菜黄籽性状研究越来越成为一个世界性的热点问题。

在探讨甘蓝型油菜种皮色泽的遗传机理方面，研究学者已经做了大量工作，并取得了很大进展。相对于芸薹属作物中的白菜型油菜和芥菜型油菜来说，甘蓝型油菜黄籽基因的来源不同，且黄籽性状存在多基因遗传、异源四倍性、母性效应，并且易于受环境条件如光照、温度、成熟度和收获时间等诸多因素的影响(Van Deynze et al.,1995)，其遗传模式也较为复杂。到目前为止较为统一的观点认为甘蓝型油菜黄籽种皮色泽受3对独立基因控制(Henderson and Pauls,1992；Rahman,2001；Rahman et al.,2010)。同时，还有少数学者提出甘蓝型油菜黄籽性状受2对独立遗传的显性基因控制(Aleksandra et al.,2007；张永泰et al.,2011)。Somers(2001)和Liu(2005)则认为黄籽性状主要由单个主基因控制，该基因对黑籽表现为部分显性，并与两个上位基因互作(Liu et al.,2005；Somerset al.,2001)。张艳等(2009)以人工合成的黄籽甘蓝型油菜No.2127-17为研究对象，认为No.2127-17的种皮颜色至少由4对主基因控制：部分显性黄籽基因Y，黑籽基因B、C和D，其中黑籽基因D对Y基因为显性上位，Y基因对黑籽基因B和C为显性上位性(Zhang et al.,2009)。

另外，在甘蓝型油菜中，像开花期、株高、千粒重、角果数、含油量等诸多性状一样，种皮色泽也是多基因控制的数量性状。随着分子标记技术的出现和发展，通过构建连锁遗传图谱和关联分析对上述相关性状进行了QTL(quantitative trait locus，数量性状基因座)定位分析(Chen et al.,2010；Delourme et al.,2006；Francki et al.,2010；Hasan et al.,2008；Mei et al.,2009；Qiu et al.,2006；Smooker et al.,2011)，国内外在油菜黄籽基因定位和连锁标记筛选方面做的工作较多,也先后报道定位了多个黄籽性状QTL，某些主效QTL可控制粒色的40－60％变异，并找到了一些连锁标记(Badani et al.,2006；Chen et al.,2010；Francki et al.,2010；Qiu et al.,2006；Rahman et al.,2010；Smooker et al.,2011；Xiaoet al.,2007；Zhang et al.,2011)。尽管针对于甘蓝型油菜黄籽性状的定位开展了大量研究，一些与黄籽性状紧密连锁的分子标记被检测和转化为SCAR标记，但由于甘蓝型油菜黄籽基因来源不同，并存在多基因遗传、异源四倍性、母性效应，易于受环境条件等诸多因素影响(Deynze et al.,1995；Shirzadegan,1986)，目前为止在甘蓝型油菜中还未见相关性状QTL被克隆。因此，甘蓝型油菜黄籽性状的遗传机理较为复杂，目前为止也没有明确的一种遗传模式，其连锁标记也缺乏一定的通用性，也就限制了在育种中的辅助选择。

发明内容

本发明的目的是为今后色泽主效QTL的精细定位及克隆提供一种新选择。

本发明的技术方案是与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记SWUA09-355，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

分子标记SEQ ID NO.1：

TTCTTTCCCTGCAGTGGTTCCAGCTGGAGAAGAGACTGAGCTCCTTGTTGCTCTCAAGAACGATGGTATTACCGATTCTCTTTCGTTTTTTCTTTCTGTTGCCTGTAAAAATCTTGTAAATTGACTCTCTCTCTCTCTCTCTGTGTGACATAACAGGCAAATCTAGCGTAGGTGTGATGGGGATTAGGG

分子标记SEQ ID NO.2：

TTCTTTCCCTGCAGTGGTTCCAGCTGGAGAAGAGACTGAGCTCCTTGTTGCTATCAAGAACGATGGTATACCGATTCTCTTTCGTTTTTTTTTTTTCTGTTGCCTGTAATAATCTTGTAAATTGACTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGACATAACAGGCAAATCTCACGTAGGTGTGATGGGGATTAGGG

本发明还提供了扩增所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

引物对为SWUA09-355F和SWUA09-355R。

SWUA09-355F，SEQ ID NO.3：TTCTTTCCCTGCAGTGGTTC

SWUA09-355R，SEQ ID NO.4：CCCTAATCCCCATCACACCT

本发明还提供了获得所述分子标记的方法，包括如下步骤：

(1)甘蓝型油菜黄籽品系GH06和黑籽品系中油821为亲本杂交，后代通过“一粒传法”连续自交9代构建重组自交系为作图群体；

(2)提取两个亲本GH06与ZY821及重组自交系群体叶片基因组DNA；

(3)整合近几年公开发表的甘蓝型油菜的遗传图谱信息，将公开发表的SSR、SRAP、RAPD和IBP引物及根据甘蓝型油菜基因组信息自主开发的SSR引物，利用两个亲本基因组DNA进行扩增，扩增产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定、染色和显色后，根据目的条带的分子量大小进行判别，筛选多态性引物；

(4)筛选出的多态性引物对高世代重组自交系群体各株系进行基因型分析，利用作物软件Joinmap 4.0进行遗传连锁图谱的构建，选用“Kosambi’s”作图函数计算标记间的遗传距离，将LOD最小值设为“3.0”，用“Group”命令进行分组；选用“Map”命令构建连锁图谱；QTL分析软件Windows QTL Cartographer 2.5及复合区间作图(Composite intervalmapping,CIM)法对重组自交系群体多个环境中的种皮色泽表型数据进行了QTL初级定位和效应检测；进行CIM分析时，选用1cM的步长(walking speed)，按照假定检测10和Zmapqtl模型3，选取参数1000次回归，显著水平0.01，最终将一个影响种皮色泽性状的主效QTL定位在A09连锁群上两个标记SWUA09-30-H081N08.7区间内，针对对该区间加密及标记的筛选最终确定SSR标记SWUA09-355与种皮色泽紧密连锁；扩增该标记的其引物对为SWUA09-355F和SWUA09-355R，该引物对具有如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的核苷酸序列。

具体的，步骤(3)中扩增程序如下：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃复性1min，10个循环，每循环退火温度降低0.5℃；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min，25个循环；72℃延伸5min。

具体的，步骤(3)中所述扩增反应体系如下：2.5μL 10×含Mg²⁺的Easy Taq PCR缓冲液，10mmol/L的dNTPs 0.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，50～100ng基因组DNA，5U/μL的Easy Taq酶0.25μL，ddH₂O双蒸水补足至25μL。

具体的，步骤(3)中的扩增产物稀释2.5倍后采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳，上样量2.0μL；10％非变性聚丙烯酰胺凝胶包括10％聚丙烯酰胺、0.04％过硫酸铵、0.1％TEMED(TEMED即N,N,N',N'-四甲基乙二胺)；电泳缓冲液为0.5×TBE(TBE即Tris-硼酸缓冲液)，250V电泳1h；电泳完成后用硝酸银染色显带。

本发明的有益效果：

本发明定位了一种与种皮色泽性状紧密连锁的SSR分子标记SWUA09-355，该主效QTL在不同环境中可解释41.38％-64.17％的表型变异。本发明通过区间分子标记引物加密及筛选最终确定一种SSR标记与甘蓝型油菜种皮色泽性状紧密连锁。由于甘蓝型油菜黄籽基因来源不同，并存在多基因遗传、异源四倍性、母性效应，易于受环境条件等诸多因素影响，甘蓝型油菜黄籽性状的遗传机理较为复杂，本发明的连锁标记能够适用于不同的群体材料和其它遗传来源的甘蓝型油菜，具备一定的通用性和广适性，能够进行甘蓝型油菜黄籽性状的辅助选择，为甘蓝型黄籽主效基因的图位克隆奠定了基础。

附图说明

图1为重组自交系群体种皮色泽表型变异在6个不同环境中的频率分布图，结果表明甘蓝型油菜种皮色泽表型数据呈连续性近似正态分布，说明种皮色泽属于典型的数量性状。

图2甘蓝型油菜第9连锁群种皮色泽主效QTL区间分析示意图，此图包括6个不同环境在A09连锁群上检测到的QTL区间。

图3WinQTL 2.5软件扫描的在甘蓝型油菜第9连锁群A09上种皮色泽主效QTL基因位点的分析图，此图包括6个不同环境中检测的QTL位点，LOD≥2.5。

图4利用SSR分子标记SWUA09-355对黄籽品系GH06和黑籽品系ZY821及重组自交系群体中极端黄籽株系和黑籽株系进行基因型分析电泳图。图中P1和P2分别代表亲本GH06和ZY821，1-23号为黄籽株系，24-46号为黑籽品系。

图5甘蓝型黄籽品系亲本GH06和黑籽品系亲本ZY821及重组自交系黄黑籽种子图。图中P1和P2分别代表亲本GH06和ZY821，1-23号为黄籽株系(yellow)，24-46号为黑籽品系(black)。

图6利用SSR分子标记SWUA09-355对甘蓝型油菜F_2:3群体黄黑籽分别进行基因型分析电泳图；数字是代表株系编号。

图7甘蓝型油菜F_2:3群体黄黑籽单株种子图；数字是代表株系编号。

图8利用SSR分子标记SWUA09-355对不同来源的甘蓝型油菜进行基因型分析电泳图；甘蓝型油菜F_2:3群体黄黑籽单株编号1-96。

具体实施方式

实施例1甘蓝型油菜重组自交系作图群体的构建及性状测定

本实施例中所用的作图群体为甘蓝型油菜黄籽品系GH06和黑籽品系ZY821杂交后代通过“一粒传法”连续自交构建的重组自交系群体。利用近红外分析仪获得该群体7个不同环境的表型数据，通过分析软件SPSS 13.0对数据进行分析表明，不同环境中的种皮色泽均呈连续性的近似正态分布，变异范围较宽，证明甘蓝型油菜种皮色泽属于典型的数量性状(图1)。

实施例2提取基因组DNA

根据Doyle(1990)等的CTAB方法稍作改良，提取甘蓝型油菜两个亲本GH06和ZY821及重组自交系群体叶片基因组DNA，具体操作步骤如下：

A)将约0.1g左右新鲜叶片放入2ml离心管中，并放入4颗钢珠用于粉碎叶片组织。

B)为了防止粉碎过程中被氧化，加入100μL含有2％β-ME(巯基乙醇)的2×CTAB提取缓冲液。

C)将装好材料的2ml离心管置入美国SPEX GENO 2010高通量组织研磨机粉碎叶片组织，速度为1250rpm，时间为55s。

D)粉碎完成后，加入700μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，剧烈震荡使其迅速混匀，然后置于65℃保温45min，期间摇动3-4次。

E)加入800μL氯仿/异戊醇(24︰1)，轻轻颠倒使其充分混匀，乳化抽提10min，12000rpm离心15min；吸取上清液转移至另一个离心管中，重复乳化一次。

F)将上清液转移到另一个离心管中，加入2/3体积的异丙醇沉淀DNA。

G)用移液枪吸出沉淀(DNA)，转移到盛有1ml 75％乙醇的1.5ml离心管，颠倒摇匀几次，充分洗涤沉淀。倒出后，重复洗涤一次，为了洗涤充分可以放置4℃漂洗过夜。

H)最后用无水乙醇洗涤沉淀，倒出乙醇，风干沉淀后，加入100μL TE溶解沉淀，溶解的DNA调整浓度后-20℃保存备用。

实施例3甘蓝型油菜分子标记连锁遗传图谱的构建及种皮色泽QTL定位

利用SSR、SRAP、RAPD和IBP四种不同的标记进行甘蓝型油菜分子标记遗传连锁图谱的构建，其中SSR标记主要包括：BrassicaDB(http://www.ukcrop.net)公布的Na-，Ol-，Ra-，Ni-引物共284对引物；Piquemal et al.(2005)发表的CB-,BRAS-,MR-和MD引物共157对；日本蔬菜茶叶研究所Satoru Matsumoto教授提供的BRMS-引物共130对(Fu et al.,2007)；Osborn实验室公开的FITO-引物共97对；加拿大NAFF公开的sR，sN，sO，nga-，BN-引物共109对；韩国Dr.Beom-Seok Park和Dr.Soo-Jin Kwon教授惠赠的KS-，H-，B-和S-引物共240对(http://brassicadb.org/brad)；Cheng et al.(2009)发表的BnGMS-引物共135对；Choi et al.(2007发表的EJU，ENA，GOL，niab-和cnu-引物共124对；及根据白菜和甘蓝基因组序列的差异性自主开发的SWU-特异性引物，其中来自A09基因组共119对(表1)。SRAP和RAPD引物主要是根据已公开发表的引物序列合成(Fu et al.,2007)。IBP引物为韩国Dr.Beom-Seok Park和Dr.Soo-Jin Kwon教授惠赠(http://brassicadb.org/brad)。

表1根据白菜和甘蓝基因组序列自主开发的A09特异性引物

利用上述标记引物构建了一张包含1089个标记位点，覆盖19个连锁群，总长度约为2775cM，标记间的平均距离为2.54cM的甘蓝型油菜高密度遗传图谱，约占甘蓝型油菜基因组94.92％。其中第九连锁群A09包含183个标记位点，标记间的平均密度为0.83cM。基于该遗传连锁图谱、重组自交系群体的基因型数据及7个不同环境中种皮色泽的表型数据，采用复合区间作图法，利用WinQTL 2.5进行QTL的分析及效应检测，不同环境中在A09连锁群上均检测到一个与种皮色泽性状相关的主效QTL，位于两个标记SWUA09-30和H081N08.7区间内(图2，表2)，其LOD值、贡献率和加性效应值较大(图3)。

表2重组自交系群体采用复合区间作图法检测到种皮色泽QTL

注：上表中^a)+:GH06等位基因的加性效应增加性状表型值；–:Zhongyou 821等位基因的加性效应增加性状表型值。

实施例4与甘蓝型油菜种皮色泽性状紧密连锁分子标记的筛选

本实施例针对定位的色泽主效QTL区间重新设计标记引物，利用黄籽亲本品系GH06和黑籽亲本品系ZY821及重组自交系群体中极端黄黑籽材料各23份(图4)进行标记引物多态性筛选，最终获得了一个与甘蓝型油菜种皮色泽性状紧密连锁的分子标记(图5)，该标记名称为SWUA09-355，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。扩增该标记的引物对序列为SWUA09-355F：5'-TTCTTTCCCTGCAGTGGTTC-3'，即SEQ ID NO.3，SWUA09-355R：5'-CCCTAATCCCCATCACACCT-3'，即SEQ ID NO.4。

实施例5SWUA09-355标记连锁性及通用性验证

利用一个F_2:3分离群体(图6)和96份甘蓝型油菜种质资源，包括杂交组合及品系材料(表2)对该标记进行了连锁性分析，结果显示：该标记与F_2:3分离群体中的黄黑籽性状完全紧密连锁(图7)，在96份种质资源中，具有相同或相似遗传背景的扩增出相同的等位基因位点(图8)，证实该标记与种皮色泽性状紧密连锁，并具备了一定的通用性，能够在甘蓝型油菜黄籽育种中进行分子标记辅助选择。

表2实施例5的96份甘蓝型油菜种质资源

注：遗传背景来源相同的，材料间的性状存在稳定性差异。

因此，综上所述内容仅是本发明的优选实施方式，以上实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，但并非限制于此。尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的实质和范围。

Claims

1.与甘蓝型油菜种皮色泽紧密连锁的分子标记SWUA09-355，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

3.获得权利要求1所述分子标记的方法，包括如下步骤：

(2)提取两个亲本GH06与ZY821及重组自交系群体叶片基因组DNA；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中扩增程序如下：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃复性1min，10个循环，每循环退火温度降低0.5℃；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min，25个循环；72℃延伸5min。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增反应体系如下：2.5μL 10×含Mg²⁺的Easy Taq PCR缓冲液，10mmol/L的dNTPs 0.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，50～100ng基因组DNA，5U/μL的Easy Taq酶0.25μL，ddH₂O双蒸水补足至25μL。

6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的扩增产物稀释2.5倍后采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳，上样量2.0μL；10％非变性聚丙烯酰胺凝胶包括10％聚丙烯酰胺、0.04％过硫酸铵、0.1％TEMED；电泳缓冲液为0.5×TBE，250V电泳1h；电泳完成后用硝酸银染色显带。