CN108977572A

CN108977572A - 基于小麦品种中麦895遗传背景的抗白粉病基因标记及应用

Info

Publication number: CN108977572A
Application number: CN201811030824.8A
Authority: CN
Inventors: 郝元峰; 徐小婷; 何中虎; 贾奥琳
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2038-09-05
Also published as: CN108977572B

Abstract

本发明公开了基于小麦品种中麦895遗传背景的抗白粉病基因标记及应用。本发明提供的检测小麦染色体6B的SNP AX‑94973433位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性中的应用；所述SNP AX‑94973433位点为位于小麦染色体6B上的序列4所示核苷酸序列的第19位。本发明所提供的引物对和分子标记可用于小麦抗白粉病分子育种和抗白粉病基因的克隆。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

基于小麦品种中麦895遗传背景的抗白粉病基因标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及基于小麦品种中麦895遗传背景下的抗白粉病基因的KASP标记及应用。

背景技术

小麦是最重要的粮食作物之一，其高产和稳产是世界粮食安全的重要保障。随着人口增长、耕地减少和全球气候恶化，小麦高产和稳产显得更为重要。

小麦白粉病是世界范围内的重要真菌病害。近年来，随着高产半矮秆小麦品种的推广及氮肥的大量使用，白粉病流行频率和严重程度不断增加。在我国，80年代以后白粉病在主要冬麦区逐渐从次要病害跃升为主要病害，且常年发生。据统计，2013-2017年小麦白粉病的平均发病面积为713万公顷，而且近两年的发病面积均高达800万公顷。这是由于当前我国小麦主栽品种白粉病抗性普遍偏弱且品种专化性较强，而白粉病小种呈递增趋势。有研究表明，我国大多数品种对当前流行的白粉病小种E20不具有抗性。培育和种植抗病品种是目前最经济、有效、环保的防治方法。因此，抗白粉基因的研究具有重要意义。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种，具备叶片功能期长、分蘖能力强、灌浆速度快等特性。2009年9月通过国家黄淮麦区南片审定。在2013-2015年三年品种比较试验和大田示范中，中麦895表现出高产广适、抗病抗倒、灌浆后期耐高温等特点。中麦895在田间成株期表现中抗白粉病。扬麦16是我国黄淮麦区和长江中下游冬麦区主推品种之一。

SNP芯片是小麦基因定位克隆和分子育种的重要工具。目前小麦常用的商业化SNP芯片有9K、90k、35K、820K、660K、50K育种芯片等，高密度的SNP标记已逐渐取代SSR、STS、EST等一系列分子标记，而来源于芯片的数量庞大的SNP标记可以高效、准确的转化为可用于育种材料检测KSAP(竞争性等位基因特异性PCR，Kompetitive allele-specific PCR)标记。

发明内容

本发明一个目的是提供检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质的用途。

本发明提供了检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性中的应用；

所述SNP AX-94973433位点为位于小麦染色体6B上的序列4所示核苷酸序列的第19位。

上述应用中，所述SNP AX-94973433位点的基因型为GG或AA或GA。

本发明提供了检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质在选育高白粉病抗性小麦中的应用；所述SNP AX-94973433位点为位于小麦染色体6B上的序列4所示核苷酸序列的第19位。

上述应用中，所述检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质如下1)或2)：

1)成套引物，所述成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成；

2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。

上述应用中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；

所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列；

或，所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。

本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性的方法。

本发明提供的方法，为检测待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG还是AA，根据基因型判断所述待测小麦的白粉病抗性；

所述根据基因型判断待测小麦的白粉病抗性为如下1)或2)：

1)若所述待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG，则所述待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若所述待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为AA，则待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

2)染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG的待测小麦的抗白粉病性高于染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为AA的待测小麦；

或本发明还提供了一种选育高白粉病抗性的小麦的方法，为检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG还是AA，选育基因型为GG的待测小麦，得到高白粉病抗性的小麦。

上述方法中，所述检测待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG还是AA还是GA的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)用上述成套引物对所述待测小麦基因组DNA进行PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行基因分型。

上述方法中，所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测小麦染色体6B的SNPAX-94973433位点的基因型为GG；若所述PCR产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为AA。

本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性的物质。

本发明提供的物质，为上述检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质。所述引物组K_AX-94973433中，每条引物单独包装。

上述中，所述小麦白粉病的病原菌为小麦白粉病流行小种。

所述基因分型鉴定采用PHERAstarplus荧光酶标仪；具体可通过酶标仪使用FAMVIC ROM光束扫描和Kluster Caller分型软件对采用K_AX-94973433引物组时的PCR扩增产物进行分型检测。

采用K_AX-94973433引物组时的PCR扩增的程序：95℃15min；95℃20s、65-57℃1min(每个循环降1.0℃)、9个循环；95℃20s、57℃60s、32个循环。

上述待测小麦为单株或群体，具体可为中麦895和扬麦16构建的DH群体，或表1所示的107份小麦品种；或小麦品种“中麦895”与其它小麦品种的杂交后代。

以上任一所述的白粉病具体可为当下白粉病菌流行小种E09和/或E20引起的白粉病。

上述引物组合、上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的实验证明，本发明利用小麦660K SNP芯片分析中麦895和扬麦16的双单倍体群体(Doubled Haploid,DH)在染色体6BL上定位到一个稳定表达的QTL，由父本中麦895提供抗性效应，最高可解释表型变异13.5％。本发明开发了与QPm.caas-6BL紧密连锁的KASP标记，不仅为辅助选择育种提供了良好工具，而且为图位克隆该位点的抗白粉病基因创造了有利条件，该分子标记可用于小麦白粉病成株抗性分子育种和白粉病成株抗性基因的克隆。

附图说明

图1为K_AX-94973433引物组对抗病亲本、感病亲本、DH群体的扩增结果。

图2为K_AX-94973433引物组对抗病亲本、感病亲本、107份品种的扩增结果。

图3为利用660K芯片中的SNP标记构建的6BL遗传连锁图及SNP标记在遗传连锁图中的位置。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

最大严重度(maximum disease severities，MDS)：发病面积占叶片总面积的百分数；MDS越小，抗性越大。

中麦895(Triticumaestivum)记载于如下参考文献：高产矮秆抗倒广适小麦新品种中麦895，何中虎，阎俊，张勇，中国种业，2014年06期。中麦895审定编号为国审麦2012010。

扬麦16(Triticumaestivum)(原名扬00-126)记载于如下参考文献：优质小麦新品种扬麦16特征特性与高产栽培技术，陆成彬，程顺，张伯桥等，现代农业科技，2006年05期；2005年获得国家植物新品种权保护证书,品种权号为CNA20030436.4,公告号为CNA000663G。

小麦品种“京双16”，可从国家作物种质资源库获得。京双16记载于如下参考文献：冬小麦新品种京双16号特征特性及栽培技术要点，王婉怡，北京农业科学，1984年08期。

石4185记载于如下参考文献：冬小麦新品种冀审石4185，付大平，蔡欣，作物杂志，1998年05期。

供试材料：中麦895和扬麦16分别是我国黄淮麦区和长江中下游冬麦区主推品种之一，农艺性状优良。本研究以扬麦16为母本，中麦895(抗白粉病)为父本，采用小麦玉米杂交技术，构建DH群体，含174个家系。

田间成株期抗性鉴定：2016-2017年度种植于高邑、石家庄、新乡、郑州和杨凌，2017-2018年度种植于新乡和高邑，进行白粉病成株抗性田间鉴定，采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长1.5m，行宽0.2-0.3m，每行播种50粒种子，每个18行加2行亲本作对照；为了确保发病充分，将京双16和石4185混合种植于试验区作为诱发行。待感病对照京双16发病至最大严重度，对其倒二叶严重度进行调查，即叶片上白粉病孢子堆面积占总叶片面积的百分数，通常发病最重时期为每年的5月15号左右。

田间数据分析：选用国际通用SAS统计软件PROC CORR模型计算MDS的Pearson相关系数、PROC MIXED命令进行方差分析，进而明确表现型数据的有效性。方差分析表明(表1)，该群体后代表现型(MDS)在不同株系、不同环境及基因型与环境互作间差异均达到极显著水平(P<0.01)，条锈病最大严重度(MDS)的广义遗传力为0.84，说明该群体田间表现型数据的有效性。

遗传图谱构建：构建遗传图谱前，先对所获得的遗传数据进行筛选。首先，除去单株标记缺失率高于20％的单株。然后，除去非多态性、缺失数据大于10％及最小等位基因频率小于30％的标记。下一步用IciMapping V4.0的BIN-Mapping功能对剩余的多态性标记进行优化处理，以用于遗传图谱构建。利用JoinMap V4.0和MSTmap Online进行遗传图谱的构建。

实施例1、抗白粉病基因的分子标记AX-94973433及其专用引物组K_AX-94973433的获得及方法的建立

一、抗白粉病基因的分子标记AX-94973433及其专用引物组K_AX-94973433的获得

QTL定位和连锁标记AX-94973433的发现：利用QTL Cartographer V2.5采用复合区间作图法(CIM)对DH群体174个株系不同环境下白粉病进行QTL定位。LOD值选取2.5作为阈值。进行大量序列分析、比对以及预实验，发现QPm.caas-6BL上游的分子标记AX-94973433物理位置相距较近，并且该标记的SNP AX-94973433位点在其条同源染色体间有特异性，因此将其转化为KASP，用于分子标记辅助育种。图3为利用660K芯片中的SNP标记构建的6BL遗传连锁图及SNP标记在遗传连锁图中的位置。

SNP AX-94973433位点为位于小麦染色体6B上的序列4所示核苷酸序列的第19位，该SNP位点的基因型为GG、AA或GA。

鉴定SNP AX-94973433位点的KASP引物为K_AX-94973433引物组，该引物组由5’末端添加特异荧光序列FAM的DNA分子、5’末端添加特异荧光序列HEX的DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成；

5’末端添加特异荧光序列FAM的DNA分子为在序列1所示的单链DNA分子的5’末端添加特异荧光序列FAM得到；

5’末端添加特异荧光序列HEX的DNA分子为在序列2所示的单链DNA分子的5’末端添加特异荧光序列HEX得到；

序列1、ACTGCTGGAGAGGATTGCG

序列2、ACTGCTGGAGAGGATTGCA

序列3、GGATTGCAGGTCCCATTATCTC

特异荧光序列FAM为F5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

特异荧光序列HEX为F5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’；

上述5’端添加特异荧光序列FAM序列1所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子扩增SNP位点基因型为G:G的片段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色；

上述5’端添加特异荧光序列HEX序列2所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子扩增SNP位点基因型为A:A的片段，携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。

上述5’端添加特异荧光序列FAM序列1所示的单链DNA分子、5’端添加特异荧光序列HEX序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子扩增SNP位点基因型为G:A的片段，PCR扩增后的产物经荧光照射照射显示绿色。

二、分子标记AX-94973433及其专用引物组K_AX-94973433鉴定白粉病的方法建立

1、基因组DNA的获得

提取174个扬麦16/中麦895(中麦895提供抗性基因)DH群体的基因组DNA，稀释得到DNA浓度为30ng/μl的模板溶液。

2、KASP扩增

以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用已获得的引物组K_AX-94973433进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

KASP标记引物工作液的制备：

分别取上游引物(序列1所示引物加特异荧光序列FAM和序列2所示引物加特异荧光序列HEX)12μL(100μM)，取下游引物(序列3所示引物)30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液备用。

PCR扩增反应体系：含有DNA模板2μL(约30ng/μL，烘干)、引物工作液0.045μL、KASP2×Master Mix 2.0μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至4.0μL。其中KASP 2×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成。

PCR扩增的程序：95℃15min；95℃20s、65-57℃1min(每个循环降1.0℃)、9个循环；95℃20s、57℃60s、32个循环。

PCR扩增产物通过酶标仪使用FAM VIC ROM光束扫描和Kluster Caller分型软件进行分型检测，得到SNP AX-94973433位点的基因型。

结果如图1所示，GA型为中麦895和扬麦16DNA混合而成的杂合对照扩增结果；AA型为扬麦16及DH群体中与扬麦16相同基因型的株系扩增结果；GG型为中麦895及DH群体中与中麦895相同基因型的株系扩增结果；清水对照为不加任何DNA扩增结果。将上述174个扬麦16/中麦895DH群体的基因型结果与原芯片基因型分型比对，有9个家系存在差异，放入原图谱位置相近，说明AX-9497343标记引物组K_AX-94973433转化成功。

因此，可以根据SNP AX-94973433位点基因型判断检测材料的白粉病成株抗性，具体方法如下：检测待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG还是AA，根据基因型判断待测小麦的白粉病抗性，

根据基因型判断待测小麦的白粉病抗性为如下1)或2)：

1)若待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG，则待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为AA，则待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦；

上述检测待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG还是AA的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)用成套引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行基因分型；基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色(红色)，则待测小麦染色体6B的SNPAX-94973433位点的基因型为GG；若所述PCR产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色(蓝色)，则待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为AA。

实施例2、引物组K_AX-94973433鉴定白粉病中的应用

选用表1所示的107份小麦品种和两个亲本。其中107份小麦品种为测试组，中麦895和扬麦16为对照组。

一、测试组田间表型鉴定

白粉病的病原菌为白粉病流行小种E09和/或E20；

107份小麦品种于2017年种植于北京，进行白粉病成株抗性田间鉴定，采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长1.5m，行宽0.2-0.3m，每行播种50粒种子，每个9行加1行对照，对照选用高感白粉病小麦品种京双16；为了确保发病充分，将京双16种植于试验区作为诱发行。接种大约6周后，京双16达到发病高峰，进行第一次调查；一周后，调查群体发病最大严重度(MDS)，结果如表1所示。

二、K_AX-94973433引物组检测测试组和对照组

采用实施例1的二的方法，用K_AX-94973433引物组检测107份小麦品种SNPAX-94973433位点的基因型；

若PCR扩增产物仅为显示红色，则SNP AX-94973433位点基因型为GG纯合型，则待测小麦与中麦895基因型相同，该待测小麦为或候选为抗白粉病小麦；

若PCR扩增产物仅显示蓝色，则SNP AX-94973433位点基因型为AA纯合型，则待测小麦与扬麦16基因型相同，该待测小麦不为或候选不为抗白粉病小麦(为感白粉病小麦)。

或，PCR扩增产物仅为显示红色(SNP位点为G的纯合体，基因型为G：G)的小麦的白粉病抗性大于PCR扩增产物仅显示蓝色(SNP位点为A的纯合体，基因型为A：A)的小麦。

结果如表1和图2所示；可以看出，K_AX-94973433引物组检测2份未分型，其余105份均能分型。

将其余105份用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型进行t检验，结果如表2所示，可以看出，GG纯合型的品种比AA纯合型的品种的MDS的平均值降低了29.5％，在0.01水平上有显著差异，表明GG纯合型的品种的抗白粉病程度高于AA纯合型的品种。

表1、107份小麦品种由K_AX-94973433引物组检测的基因型和MDS平均值

表2、105份小麦品种白粉病最大严重t检验

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>基于小麦品种中麦895遗传背景的抗白粉病基因标记及应用

<160>4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actgctggag aggattgcg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actgctggag aggattgca 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggattgcagg tcccattatc tc 22

<210> 4

<211> 98

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n为 a 或 g

<400> 4

actgctggag aggattgcnt gatccatgtt tgggaggtgt tgcactccgg aatgatgaag 60

gaggagaggg aggtgggaga taatgggacc tgcaatcc 98

Claims

1.检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性中的应用；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SNP AX-94973433位点的基因型为GG或AA或GA。

3.检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质在选育高白粉病抗性小麦中的应用；所述SNP AX-94973433位点为位于小麦染色体6B上的序列4所示核苷酸序列的第19位。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质如下1)或2)：

2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；

或，所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。

6.一种鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性的方法，为检测待测小麦染色体6B的SNPAX-94973433位点的基因型为GG还是AA，根据基因型判断所述待测小麦的白粉病抗性；

所述根据基因型判断待测小麦的白粉病抗性为如下1)或2)：

或一种选育高白粉病抗性的小麦的方法，为检测小麦染色体6B的SNPAX-94973433位点的基因型为GG还是AA，选育基因型为GG的待测小麦，得到高白粉病抗性的小麦；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述检测待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG还是AA的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)用权利要求5中的所述成套引物对所述待测小麦基因组DNA进行PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行基因分型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型为GG；若所述PCR产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测小麦染色体6B的SNPAX-94973433位点的基因型为AA。

9.一种鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性的物质，为权利要求1-5所述应用中的所述检测小麦染色体6B的SNP AX-94973433位点的基因型的物质。

10.根据权利要求1-5任一所述的应用或权利要求6-8任一所述的方法或权利要求9所述的物质，其特征在于：所述小麦白粉病的病原菌为小麦白粉病流行小种。