CN111424103A - 一种油菜花色性状检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜花色性状检测方法，包括步骤：(1)取油菜叶片，提取DNA，采用扩增引物扩增LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D序列；(2)对扩增产物进行测序分析。根据测序分析的结果，可以完全区分红花、橙色、土黄、黄色和白色油菜，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。

Description

一种油菜花色性状检测方法

技术领域

本发明涉及一种油菜花色性状检测方法，属农业生物技术领域。

背景技术

油菜除种子榨油之外，尚具有多种功能，如菜用、观赏用、饲料用、蜜用、肥用等。在乡村振兴战略背景下，作为观赏或油-赏兼用型彩色油菜品种在美丽乡村建设中具有广阔的应用前景。彩色油菜种植，通过吸引游客观赏油菜花，加上当地特色农产品和农家乐消费，可以促进一二三产融合发展；同时，还可以充分有效地利用冬闲田，减少冬季土地抛荒的现象。因此，在这种情况下，彩色油菜即使不收获籽粒，在适当的时间作为绿肥翻耕，也可以适时腾茬，种植水稻等其他作物；还可以增加地力，促进其他作物产量增加。

近年来，由于种植彩色油菜的附加效应崛起，尤其是许多地区的旅游景点，结合当地的文化底蕴和地理背景，多地引进和种植彩色油菜，如江西婺源、云南罗平以及浙江开化、青田等部分梯田观光区。为了满足观赏者的求鲜心理和种植者对彩色油菜的需求，部分研究者也利用各种不同方法培育出不同颜色的油菜花品种。本团队近年相继培育出紫色、红色、橙色、白色和不同深浅的黄色系彩色油菜品系，大大丰富了彩色油菜色彩方面的内涵。

彩色油菜在开花之前，与普通黄色油菜差异较小。此外，植株包括油菜形态容易受到环境的影响而发生改变，因此，若采用表型进行判定其后期是否为红色花瓣时误判率极高。因此，无法对不同颜色的彩色油菜在苗期进行鉴定。此外，由于不同研究者采用的不同的亲本，也可能培育出颜色类似的彩色油菜花，容易造成产品拥有者发生知识产权纠纷。因此，必需采用可靠、准确的方法加以区分不同色彩的彩色油菜花。

在植物界中，表型鉴定是最初、最原始的判定方法。但是因其准确率低，容易造成误判。此外，其判定效率低，例如，彩色油菜花如果苗期生长比较相近，则必须要等待开花时才能够鉴定，在苗期鉴定则无能为力。因此，表型鉴定不常作为区分不同品系的关键依据。近年来，随着生物技术的迅速发展，利用基因型或分子标记鉴定作物不同材料或品种则是最为常用的方法。其不受环境的影响，而且，在苗期就可以进行鉴定，无需等到开花或者其他生育期进行表型鉴定。大大提高了作物不同品种区分的效率。基因型或分子标记对作物不同种质或品种鉴定的关键之处在于拥有合适的分子标记或基因加以应用。

获得油菜特异的分子标记或基因方法有许多中，例如采用AFLP、QTL定位、同源基因克隆方法等。每种材料由于来源等情况并不一致，因此，只要找到合适的方法，开发新的特异分子标记或基因，能够区分不同颜色的彩色油菜即可用于彩色油菜种质来源的鉴定。由于本团队培育的红色和橙色油菜花为萝卜和油菜远缘杂交，因此，通过常规的QTL方法进行定位花瓣色素基因存在很大困难，因为亲本在构建群体上存在巨大困难。因此，本发明采用同源基因克隆方法，开发了一种可以区分红色、橙色、黄色和白色的分子标记加以不同彩色油菜种质的鉴定。

发明内容

为了克服本领域的上述缺陷，本发明提供了一种油菜花色性状检测方法，根据该方法，可以完全区分红花、橙色、土黄、黄色和白色油菜，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。

一种油菜花色性状检测方法，其特征在于，包括步骤：

(1)取油菜叶片，提取DNA，采用扩增引物扩增LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D序列；

(2)对扩增产物进行测序分析。

进一步地，步骤(1)所述扩增引物的DNA序列为：

H15：GCTTCTTTCCTTACCTTTCTCTGT

H16：CTTCATGTGCTTCTCGGTTTTAC。

进一步地，步骤(1)扩增反应条件是95℃1min；95℃20s，58℃20s，72℃1min，36个循环，72℃5min。

结果判定方法：1、未产生扩增产物的，则油菜花色为白色。2、若扩增产物的序列与SEQ ID NO：2相同，则油菜花色为红色。3、若扩增产物的序列与SEQ ID NO：3相同，则油菜花色为橙色。4、若扩增产物的序列与SEQ ID NO：4相同，则油菜花色为土黄色。5、若扩增产物的序列与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6相同，则油菜花色为黄色。

本发明以彩色油菜为材料，提取DNA，采用扩增引物(H15、H16)进行PCR扩增，所得的PCR产物经过测序后可发现不同花瓣颜色的彩色油菜BnaA03g45610D基因序列存在显著差异。利用这些差异可以区分不同颜色的彩色油菜。例如，黄色花基因从32到51位点碱基缺失，其余色彩的油菜均包含这一区段；位点204、216、280存在特异SNPs，可与其他彩色油菜进行区分。红色油菜在位点237、268、368、724-725、762、840、1020、1032、1035、1083存在特异SNPs，均可作为区分其他花瓣颜色油菜种质的特异SNP标记。橙色和土黄色分别在位点181、1235-1236、1288和1356等存在特异SNPs，可用这些特异SNP标记将区分橙色和土黄色油菜。因此，根据这些SNP标记可以通过测序或者荧光定量PCR加以全部区分开来。

附图说明

图1是试验材料(黄色、红色、橙色、土黄和白色油菜)。

图2种2～5分别是红色、橙色、土黄、黄色油菜花BnaA03g45610D基因序列比较，6为参考序列。浅色背景代表基因在不同材料间有序列差异。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。

1、试验材料

采用黄色、红色、橙色、土黄和白色油菜为材料(于2017年10月份种植)。油菜红花(红156、红185，红191)，橙色花(橙905和橙906)浙油51、浙油50和B57于2019年10月份种植。

2、试验方法

2.1 DNA提取

使用CTAB法提取油菜的基因组DNA。

2.2不同花色甘蓝型油菜中LDOX/ANS基因的克隆

利用拟南芥中的LDOX/ANS基因(Gene ID：AT4G22880)序列在甘蓝型油菜数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中进行比对，发现甘蓝型油菜中LDOX/ANS基因存在四个拷贝，分别为BnaA01g12530D，BnaA03g45610D，BnaC01g14310D和BnaC07g37670D。根据这四个基因的序列设计四对引物(如表1所示)，用于克隆不同花色油菜中LDOX/ANS基因的DNA序列。使用高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase(购自北京全式金生物技术有限公司)进行PCR扩增，PCR反应条件为95℃1min；95℃20s，58℃20s，72℃1min，36个循环；72℃5min。将克隆得到的产物连入pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司)中，构建测序中间载体，进行序列测定。

表1基因克隆引物

实施例1：不同花色甘蓝型油菜中LDOX/ANS基因序列的分析

对测序结果采用sequencher软件进行扩增的不同拷贝的序列分析，序列比对使用的DNAMAN软件。

测序结果显示：红色、橙色和黄色油菜花品系中的LDOX/ANS基因四个不同拷贝的基因序列有差异。

LDOX/ANS基因的四个拷贝为：BnaA01g12530D、BnaA03g45610D、BnaC01g14310D、BnaC07g37670D。结果显示：BnaA01g12530D基因在不同花色材料中的序列均与甘蓝型油菜基因组数据库中的参考序列一致(SEQ ID NO：1)；BnaA03g45610D基因在白色花材料中未扩增出条带，在其他四种花色油菜中的序列各不相同，其比对结果如图2所示(红色材料SEQID NO：2，橙色材料SEQ ID NO：3，土黄材料SEQ ID NO：4，黄色材料SEQ ID NO：5，参考序列SEQ ID NO：6)；BnaC01g14310D基因在不同花色材料中的序列均与甘蓝型油菜基因组数据库中的参考序列一致(SEQ ID NO：7)；BnaC07g37670D基因在不同花色材料中的序列分为两组，其中红、橙、黄、白一组(SEQ ID NO：8)，土黄一组(SEQ ID NO：9，与参考序列一致)。从以上不同拷贝基因测序的结果可以看出，LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D拷贝在不同花色中的序列各不相同，具有区分花色的特征，而其他拷贝序列差异和花色并无明显关联。

实施例2：LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D拷贝在不同花色中序列的验证

取红色、橙色、黄色和白色油菜花品系叶片(2018年10月份种植)。其中黄色油菜花采用浙油51、浙油50、B57多个品种进行验证。

以彩色油菜为材料，提取DNA，根据表1中所提供的引物进行PCR扩增，所得的PCR产物经过测序后可发现不同花瓣颜色的彩色油菜BnaA03g45610D基因序列存在显著差异(图2)。利用这些差异可以区分不同颜色的彩色油菜。例如，黄色花基因从32到51位点碱基缺失，其余色彩的油菜均包含这一区段；位点204、216、280存在特异SNPs，可与其他彩色油菜进行区分。红色油菜在位点237、268、368、724-725、762、840、1020、1032、1035、1083存在特异SNPs，均可作为区分其他花瓣颜色油菜种质的特异SNP标记。橙色和土黄色分别在位点181、1235-1236、1288和1356等存在特异SNPs，可用这些特异SNP标记将区分橙色和土黄色油菜。因此，该基因可以完全区分红花、橙色、土黄、黄色和白色油菜。

实施例3：LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D拷贝在不同花色中序列的验证

对2019年10月份种植的红花油菜红156、红185和红191(花瓣均为红色的不同株系)；橙色油菜取样两种，编号为橙905和橙906(花瓣均为橙色的不同株系)；黄色油菜材料取样3种，分别为浙油51、浙油50和B57(花瓣均为黄色的不同品种)。克隆测序结果显示，红色油菜中的BnaA03g45610D基因序列与SEQ ID NO：2序列完全一致；橙色油菜中的BnaA03g45610D基因序列与SEQ ID NO：3序列完全一致；黄色油菜中浙油51和B57与SEQ IDNO：5序列完全一致，浙油50序列与参考序列SEQ ID NO：6完全一致。由此可见，LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D拷贝具有区分不同花色的特征。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

湖州市农业科学研究院

<120> 一种油菜花色性状检测方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1661

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜BnaA01g12530D(Brassica napus L)

<400> 1

cttcacacat tcactaacca ccggtagctc tacacttctt aatccgttag ttaatttctt 60

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agttggtaac tgagaaaaag gatgaagtct gagtctgaaa c 1661

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<211> 1352

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜BnaA03g45610D(Brassica napus L)

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜BnaA03g45610D(Brassica napus L)

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agggcaaatg ggtcattgca aaatgtgttc ctgactccat tgtgatgcac attggagata 960

cgttggagat tcttagtaat ggcaagttta agagtatact tcaccgtggg ttggtgaata 1020

aggagaaggt aagaatctct tgggctgtgt tttgtgagcc acccaaggat aagatcgttc 1080

tcaagccgtt gccggagatg gtgagtgctg agactccggc taagtttcct ccaaggacat 1140

ttgctcaaca tattgagcat aagttgttta gaaggaacga acaagaggag ttggtgcctg 1200

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tagagcctga ccgtctagag aaagaagttg gcggtttaga agaacttctc ctccaaatga 780

agataaacta ttacccgaaa tgccctcagc ctgagctagc acttggcgtg gaagctcaca 840

cagatgtaag cgctttgacc ttcattctac acaacatggt tccggggttg cagcttttct 900

acgagggcaa atgggtcatc gcaaaatgtg ttcctgattc cattgtgatg cacattggag 960

atacgttgga gattcttagt aatgggaagt ttaagagtat acttcaccgt gggttggtga 1020

ataaggagaa ggtaagaatc tcttgggctg tgttttgtga gccacccaag gataagatcg 1080

ttcttaagcc gttgccggag atggtgagtg ctgagactcc ggctaagttt cctccaagga 1140

catttgctca acatattgag cataagttgt ttagaaggaa cgaacaagag gagttggtgc 1200

ctgagacaaa agatttgaag gcatatatat gtttaaagat tgtgtaatta atatatgtgt 1260

tagtaaaacc gagaagcaca tgaag 1285

<210> 7

<211> 1682

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<400> 7

accatcatct accgttgacc attaagtgtg tcactgactc acttaccttt tcttcttcac 60

acattcacta actaccggta gttatgcact tagtaatttg ttaattaatt tcttaatgaa 120

aaaaattatt tttgctataa gaatgccttt gcacatttca tttacttgca acaattccaa 180

aagagagggt aagaagaaaa acaaaacaaa gtcctttctc ttaattaaaa ttactctgtt 240

ttttccctgt ttcaattttc tttgcttact ctgtttttcg tgtctgttat agctttacaa 300

gaagtacaag aagatggtgg cagttgaaag agttgagagc ttagcaaaaa gcggaatcaa 360

ctccatccca aaagaataca tccgtccaaa agaagagctc gagagcatca acgacgtgtt 420

ccaagaagag aagaaagaag acggtccaca agtccccacc atcgatctcc aagacatcga 480

gtcagaagac gaaaccatcc gtgagaaatg catagaggag ctcaagaagg cggctatgga 540

ttggggagta atgcatttga tcaaccatgg tgtaccggtt gaactaatgg agcgtgtgaa 600

gaagtcagga gaagagttct tcggtttgcc cgttgaagag aaggagaagt atgcaaacga 660

tcaagccaag ggaaagattc aagggtatgg aagcaagttg gctaacaacg cgagtggaca 720

gcttgagtgg gaagattact tcttccatct tgtttatcct gaagacaaga gagatctatc 780

actttggcct aagacaccaa ctgattacat gtaagctttt tgattgcttt actttacaaa 840

acacacacac atcttggttt ggttatgtga tgatactccc tagttcacaa aaagataaat 900

tttctatatt ttttattttg ttacacaaat acaattttct agagttttaa agtaattgtg 960

tatttttaga aaacattaat taaaataaag aaaataataa atttaatctt aacatttatt 1020

atattcaaat aaagtgaaac tctagaaaat tcatttttca tggaggaaat tatatgattt 1080

aacatctttg gttgcttgta gtgaagctac gagtgagtac gctaagtgtc ttcgtttgct 1140

agcaacaaaa gtcttcaagg ctctctctat cgccctaggc ttagagcctg accgtctaga 1200

gaatgaagtg ggcggtatag aagagcttct gctccaaatg aagatcaatt actacccaaa 1260

atgccctcag cctgagctag cacttggcgt ggaagctcac accgatgtaa gcgctttgac 1320

cttcattcta cacaacatgg ttccgggttt gcagcttttt tacgagggta aatgggtcat 1380

tgcaaaatgt gttcctgatt cgattgtgat gcacattgga gatacgttgg agattcttag 1440

caatgggaag tttaagagta tacttcaccg tggattggtg aacaaggaga aggtaaggat 1500

ttcttgggct gtgttttgtg aaccaccaaa ggaaaagatt gtgcttaagc cattgccgga 1560

gatggtgagt gttgagtctc cggctaagtt tcctccaagg acgtttgctc agcatattga 1620

gcataagttg ttcaggaatg agcaagagga gttggtaact gagaaaaagg atgaagtctg 1680

ag 1682

<210> 8

<211> 1225

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<400> 8

atggttgaag tggaaagagt cgagaattta gcaaagagcg gaatcaaatc gatcccaaaa 60

gaatacatcc gtccaaaaga agagctggag agcatcaacg acgttttcca agaagagaag 120

aaagaagacg gccctcaagt ccccaccatc gacttacaaa acatcgagtc cgaagacgaa 180

acgctccgtg agaaatgcac agaggagctc aagaaggctg ctatggactg gggagtgatg 240

catctgatca accacggcgt accggttgac ctgatggagc gtgtgaagaa agcaggagaa 300

gagttcttcg gtttgcccgt ggaggagaag gagaagtatg caaacgatca agccaccggt 360

aagatccaag ggtatggaag taaattagct aacaacgcga gtggacagct agagtgggaa 420

gactacttct tccatcttgt ttatcctgaa gacaagagag atctctcact ttggcccaag 480

acaccaagtg attatgtgta agttttgatt gcttttggtt aagacaaagt cacaaaacca 540

attctttgtt ttggttattt aacttttttt gttgataatt gtagagaagc cacgagtgag 600

tacgctaagt gtcttcgttt gctagcaaca aaggttttca aagctctctc tatcggtcta 660

ggcttagagc ctgaccgtct agagaaagaa gttggtggtt tagaagagct tcttctacaa 720

aagaagataa actattaccc gaaatgccct cagcctgagc tagcacttgg cgtggaagct 780

cacaccgatg taagcgcttt gaccttcatt ctacacaaca tggttcctgg tctgcagctt 840

ttctacgagg gcaaatgggt tattgcaaaa tgtgttcctg attccattgt gatgcacatt 900

ggcgatacgt tggagattct tagtaatggc aagtttaaga gtatactgca ccgtggtttg 960

gtgaataagg agaaggttag gatctcttgg gctgtgtttt gtgagccacc caaggataag 1020

atcgttctta agccgttgcc ggagatggtg agtgctgaga ctccggctaa gtttcctcca 1080

aggacatttt ctcaacatat tgagcataag ttgtttagaa aaaacgaaca agaggagttg 1140

gtgcctgaga aaaaagacga ttaagtttga gtctatatat gtaaaactac ttgttcaagt 1200

ccctctttct tttgtgtgtt tgtgt 1225

<210> 9

<211> 1226

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<400> 9

atggttgaag tggaaagagt cgagaatcta gcaaagagcg gaatcaaatc gatcccaaaa 60

gaatacatcc gtccaaaaga agagctggag agcatcaacg acgttttcca agaagagaag 120

aaagaagacg gccctcaagt ccccaccatc gacctacaaa acatcgagtc cgaagacgaa 180

acggtccgtg accaatgcat agaggagctc aagaaggtgg ctatggactg gggagtgatg 240

catctgatca accacggcgt accggttgac ctgatggagc gtgtgaagaa agcaggagaa 300

gagttcttcg gtttgcccgt ggaggagaag gagaagtacg caaacgatca agccacagga 360

aagatccaag ggtatggaag taaattagct aacaatgcta gtggacagct agaatgggaa 420

gattacttct tccatcttgt ttatcctgaa gacaagagag atctatcact ttggcccaag 480

acaccaagtg attacatgta agttttgatt gtttttggtt aagacaaagt cacaaaacca 540

tttctttgtt ttggttattt aacttttttt tgttgataat tgtagagaag ccacgagtga 600

gtacgctaag tgtcttcgtt tgctagcaac aaaggtcttc aaggctctct ctatcggtct 660

aggcttagag cctgaccgtc tagagaaaga agttggtggt ttagaagagc ttctcctcca 720

aatgaagata aactattacc cgaaatgccc tcagcctgag ctagcacttg gcgtggaagc 780

tcacaccgat gtaagcgctt tgaccttcat tctacacaac atggttcctg gtctgcagct 840

tttctacgag ggcaaatggg ttattgcaaa atgtgttcct gattccattg tgatgcacat 900

tggcgatacg ttggagattc ttagtaatgg caagtttaag agtatacttc accgtgggtt 960

ggtgaataag gagaaggtta ggatctcttg ggctgtgttt tgtgagccac ccaaggataa 1020

gatcgttctt aagccgttgc cggagatggt gagcgctgag actccggcta agttttctcc 1080

aaggacattt gctcaacata ttgagcataa gttgtttaga agaaacgaac aagaggagtt 1140

ggtgcctgag aaaaaagacg attaagtttg agtctatata tgtaaaacta cttgttcaag 1200

tccctctttc ttttgtgtgt ttgtgt 1226

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttcacacat tcactaacca ccg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtttcagact cagacttcat cct 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcttctttcc ttacctttct ctgt 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttcatgtgc ttctcggttt tac 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accatcatct accgttgacc att 23

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcagacttc atcctttttc tcagt 25

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggttgaag tggaaagagt cga 23

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acacaaacac acaaaagaaa gaggg 25

Claims (8)

1.一种油菜花色性状检测方法，其特征在于，包括步骤：

(1)取油菜叶片，提取DNA，采用扩增引物扩增LDOX/ANS基因的BnaA03g45610D序列；

(2)对扩增产物进行测序分析。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述扩增引物的DNA序列为：

H15：GCTTCTTTCCTTACCTTTCTCTGT

H16：CTTCATGTGCTTCTCGGTTTTAC。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)扩增反应条件是95℃1min；95℃20s，58℃20s，72℃1min，36个循环，72℃5min。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，未产生扩增产物的，则油菜花色为白色。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，若扩增产物的序列与SEQ ID NO：2相同，则油菜花色为红色。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，若扩增产物的序列与SEQ ID NO：3相同，则油菜花色为橙色。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，若扩增产物的序列与SEQ ID NO：4相同，则油菜花色为土黄色。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，若扩增产物的序列与SEQ ID NO：5或SEQID NO：6相同，则油菜花色为黄色。

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