CN110904262A

CN110904262A - 一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法

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Publication number: CN110904262A
Application number: CN201911290279.0A
Authority: CN
Inventors: 宋晓霞; 陈明杰; 赵妍; 宋春艳; 谭琦; 章炉军
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-16
Also published as: CN110904262B

Abstract

一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，包括下列步骤：步骤1：确定第一种香菇的细胞质类型，使用的rrnL部分基因上游引物为Seq No.1，rrnL部分基因下游引物为Seq No.2；步骤2：确定第二种香菇的细胞核类型，使用的上游引物为Seq No.3，下游引物为Seq No.4；步骤3：以测定的细胞质和细胞核序列作为分子标记，采用原生质体制备单倍体、单单杂交和回交等技术创制栽培菌株的核质杂交种。本发明为香菇新品种的培育提供有益帮助。

Description

一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法

技术领域

本发明属于食用菌分子鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定香菇菌株细胞核类型的方法、一种鉴定香菇菌株细胞质类型的方法和一种创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法。

背景技术

菌种是香菇生产三大要素(菌种、培养料和栽培管理)中最重要的基础生产资料，是影响香菇产量及质量构成的关键因子。我国拥有丰富的野生种质资源，引以为傲的砍花法阶段所用的菌种也是各地的野生菌种，但在引进纯菌种技术和日本菌种之后，日本菌种一直作为我国香菇新菌种培育亲本的主要来源，甚至我国栽培菌种与广布野生种已属于不同的类群。 2003年，日本专门修改《种苗法》，对中国香菇凡带有日本原菌种DNA特征的，赋予海关查验后按侵犯知识产权处理。假如现在我国栽培菌种都属于日本菌种的后裔，那将来在全球香菇贸易中，我国香菇产业受到的影响很难想象。当务之急是首先明晰中国香菇栽培菌种的来源，如果与假设一样，就需寻找一个新的突破口对我国的香菇种质资源进行改良和创新。

香菇同日本的Shiitake一样都是俗称，它的学名为Lentinula edodes(Berk.)Pegler，主要分布在东亚。但随着交配反应和分子数据的引入，L.edodes的分类情况越来越复杂，其中最受大家认可的是Hibbett基于ITS(Internal transcribed spacer)数据得出的结论：香菇是个复合种，学名为L.edodes sensu lato。它包括四个形态种：分布于东亚的狭义香菇L.edodes sensu stricto，分布于东南亚的砖红香菇L.lateritia，分布于新西兰的新西兰香菇L.novaezelandiae 和分布在东亚西南部高海拔地区的一个未被描述的形态种。其中，狭义香菇和砖红香菇各包括两个分支，狭义香菇的一个分支分布在东亚的北部，一个分支分布在东亚的南部。从地理分布来看，中国香菇具有狭义香菇的两个分支和未被描述的形态种，日本仅有分布在东亚北部的狭义香菇一个分支。

为了方便，狭义香菇标为A类群(东亚北部的分支为A1，东亚南部的分支为A2)，未被描述的形态种标为B类群。我们团队在前期工作中利用ITS1/5.8S/ITS2多态性和线粒体基因组分别对中国香菇野生和栽培种细胞核和细胞质进行了分型，结果发现中国栽培和野生香菇菌种的细胞核和细胞质中均存在A1型，在野生种中还存在A2和B型。追溯我国砍花法时期的栽培区域，这个区域多属于A2型分布区域，少为B型分布区域，而现在所用的细胞核和细胞质都为A1型的栽培菌种与我国东北部、日本的野生种分布区域一致。考虑到我国栽培菌种的亲本来源，很难排除我国现在栽培菌种都是日本菌种的后裔。甚至许多由细胞核A2 或B型分布区的野生种与日本优良菌株杂交而来的栽培种中也没有细胞核A2和B型遗传物质的影子。看来担心的结果还是呈现了，我国现有栽培菌种的细胞核均为日本菌种的后裔，广布野生型细胞核并没有转移到栽培种中。

考虑到香菇选育时主要衡量菌种的农艺性状和栽培特性，而生物的性状主要以细胞核效应为主，其次为细胞质和核质互作效应，这可能就是野生型细胞核没有转移到栽培种中的原因，野生型细胞核A2或B型所呈现的农艺性状与现有的选育标准可能不一致。那仅将栽培种中的细胞质进行替换而保持细胞核不动，这种技术称为异源细胞质育种技术，就是建立在细胞质不同遗传效应的基础上，将栽培种的细胞核通过置换回交等方法导入异种或属的细胞质中，进而培育出异源细胞质品种，也称为核质杂交种。目前该技术已经在植物中广泛应用。在真菌上，仅集中在细胞质遗传效应研究上：细胞质可以影响菌丝在培养基和木屑中的生长速度、后代表型、孢子后代线粒体类型等等。香菇上刘靖宇等也发现细胞质不同可以影响香菇菌种的菌落形态和出菇期，特别是栽培种与野生种杂交的后代上，但尚无将中国野生型香菇导入栽培种获得核质杂交种的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，：

包括下列步骤：

步骤1：确定第一种香菇的细胞质类型

将香菇的菌丝加入容纳有裂解液的离心管中，在混匀仪上混匀，得到菌丝裂解液，然后以所述菌丝裂解液为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：菌丝裂解液1μL、rrnL部分基因上游引物0.5μL、rrnL部分基因下游引物0.5μL、PCR Magic Mix 3.0 12.5μL、无菌ddH₂O10.5 μL；PCR反应流程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸7min；

rrnL部分基因上游引物为：5’-ATTGTCTCGGTGGTTTGGCA-3’，rrnL部分基因下游引物为：5’-CGCTTTTTAAGTTCCCCGATG T-3’；

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T VectorCloning Kit 载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取5个克隆子进行测序；

rrnL部分基因分析及细胞质类型确定：用DNASTAR Lasergene v7.1.0中的SeqMan软件合并同一菌丝的rrnL部分基因，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基；将获得的 rrnL部分基因与4个线粒体基因组的rrnL相同位置的基因进行同源比对，所用软件为MEGA v7.0，构建的系统发育树为邻接树；若该rrnL部分基因与哪个线粒体的rrnL相同位置的基因同源性高，则认为该菌丝与同源性高的线粒体基因组属于同一个基因组类型；

步骤2：确定第二种香菇的细胞核类型

将香菇的菌丝加入含有裂解液的离心管中，在混匀仪上混匀，得到菌丝裂解液，然后以所述菌丝裂解液为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：菌丝裂解液1μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、PCR Magic Mix 3.0 12.5μL、无菌ddH₂O 10.5μL；PCR反应流程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸7min；

上游引物为通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物为通用引物ITS4：5’-TCCTCCGCT TAT TGA TATGC-3’；

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNAGel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T VectorCloning Kit 载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取10个克隆子进行测序；

ITS2序列分析及细胞核类型确定：用DNASTAR Lasergene v7.1.0中的SeqMan软件合并同一菌株完全相同的ITS序列，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基；用MEGA v 7.0软件提取出每个ITS序列中的ITS2序列，然后再用MEGA v 7.0软件将获得的ITS2序列与细胞核类型的共有序列进行比对，构建邻接树；若获得的ITS2序列与某一类型的共有序列同源性高，则认为该ITS2序列属于该类型；最终将同一菌株的所有ITS2序列都进行类型确定，即可确定该菌株最终的细胞核类型；

步骤3：创制香菇栽培菌株核质杂交种

将不同的单核菌丝配对在PDA培养基上进行单单杂交，通过在菌落两端挑取菌丝，在显微镜下观察，如果有锁状联合结构形成，则认为配对的单核菌丝间是可交配的，筛选出可交配的两个栽培单核菌丝，其细胞质和细胞核都为A1型、细胞质类型为mt-A2或mt-B型的野生单核菌丝；然后分别将细胞质类型为mt-A2或mt-B型的野生单核菌丝与一个栽培单核菌丝进行正交，获得细胞质为mt-A2或mt-B型、细胞核分别来源于野生单核菌丝和一个栽培单核菌丝的双核菌丝；然后将该双核菌丝进行单核化、rrnL和ITS2序列测定，筛选到一个细胞核来源于栽培菌株而细胞质为mt-A2或mt-B型的单核菌丝；然后继续将该单核菌丝与栽培菌株的另一个单核菌丝进行正交即可获得一个栽培菌株的核质杂交种，即两个细胞核来源于栽培菌株，而细胞质来源于mt-A2或mt-B型的野生菌株。

优选的技术方案为：为了进一步稳定该核质杂交种的遗传物质，可再进行一次回交。

优选的技术方案为：步骤1中，在确定第一种香菇的细胞质类型时，NC_018365.1和MF774812.1的线粒体类型为A1型，KY217797.1的线粒体类型为A2型，MF774813.1的线粒体类型为B型。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明为香菇新品种的培育提供有益帮助。

附图说明

图1为三个菌株的ITS2序列与共有序列同源比对。

图2为三个菌株与4个线粒体基因组的rrnL部分序列比对。

图3为L808的核质杂交种获得路径。

图4为L808菌株与获得的两个L808核质杂交种。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法

一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，

a、线粒体基因组(mitogenome)可以作为细胞质分型的分子标记。目前，中国香菇菌株的细胞质类型(mitogenome type,mt)主要分为mt-A1，mt-A2和mt-B型，其中的rrnL基因可以作为三者分型的一个分子标记。因此，我们将NCBI上分别属于三种细胞质类型的4个香菇线粒体基因组(NC_018365.1，KY217797.1，MF774812.1和MF774813.1)的rrnL全基因下载下来，然后用MEGA v7.0软件进行同源比对，提取出多态性较高的区域，然后用 NCBI数据中的Primer designing tool软件设计出一对扩增片段为600bp左右的rrnL部分基因引物：上游引物为5’-ATT GTC TCG GTG GTT TGG CA-3’，下游引物为5’-CGC TTT TTA AGT TCCCCG ATG T-3’。

确定某一菌株的细胞质类型时，只需利用这对引物将该菌株的rrnL部分基因进行PCR 扩增、测序，然后与4个香菇线粒体基因组(NC_018365.1，KY217797.1，MF774812.1和MF774813.1)的rrnL基因进行同源比对，即可确定该菌株的细胞质类型。

rrnL部分基因PCR扩增和测序的具体流程如下：

菌丝裂解液制备：挑取少量菌丝于含30μL Phire Plant Direct PCR Kit裂解液的0.2mL离心管中，在Eppendorf混匀仪小精灵上混匀1min(1650r/min)。

PCR反应体系和条件：总反应体系25μL(菌丝裂解液1μL；rrnL部分基因上下游引物各0.5μL；北京天恩泽基因科技有限公司的PCR Magic Mix 3.0 12.5μL；无菌ddH₂O 10.5 μL)。94℃预变性5min，25个循环(94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min)， 72℃终延伸5min。

上游引物为5’-ATT GTC TCG GTG GTT TGG CA-3’，下游引物为5’-CGC TTT TTAAGT TCC CCG ATG T-3’

PCR结果检测及测序：扩增结束后，取4μL PCR反应产物在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T Vector Cloning Kit载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，最终经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取5个克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

rrnL部分基因分析及细胞质类型确定：用DNASTAR Lasergene v7.1.0中的SeqMan软件合并同一菌丝的rrnL部分基因，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基。将获得的 rrnL部分基因与4个线粒体基因组(NC_018365.1，KY217797.1，MF774812.1和MF774813.1) 的rrnL相同位置的基因进行同源比对，所用软件为MEGA v 7.0，构建的系统发育树为邻接树(No.of Bootstrap Replications为1000；Model/Method为Kimura 2-parameter model)。若该 rrnL部分基因与哪个线粒体的rrnL相同位置的基因同源性高，则认为该菌丝与同源性高的线粒体基因组属于同一个基因组类型。其中，NC_018365.1和MF774812.1的线粒体类型为A1 型，KY217797.1的线粒体类型为A2型，MF774813.1的线粒体类型为B型。

b、目前，中国香菇的细胞核类型主要分为A1、A2、B1和B2型，由于ITS2序列可以区分它们(Song et al.2018)，所以标为ITS2-A1、ITS2-A2、ITS2-B1和ITS2-B2。Song etal.2018 还筛选出了不同类型的共有序列以供分型所用。因此，在确定某一菌株的细胞核类型时，只需测定其ITS序列，通过注释提取出ITS2序列后与不同类型的共有序列相比即可。

菌丝裂解液、PCR反应体系、PCR结果检测和测序流程同上面rrnL序列的一样，所用引物、PCR反应流程和测定的克隆数不同。所用引物为ITS1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3’)和ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)，PCR反应体系和条件：总反应体系 25μL(菌丝裂解液1μL；rrnL部分基因上下游引物各0.5μL；北京天恩泽基因科技有限公司的PCR Magic Mix 3.0 12.5μL；无菌ddH₂O 10.5μL)。94℃预变性5min，25个循环(94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min)，72℃终延伸5min。

PCR结果检测及测序：扩增结束后，取4μL PCR反应产物在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T Vector Cloning Kit载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，最终经蓝白斑筛选，每个菌株挑取10个克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

ITS2序列分析及细胞核类型确定：用DNASTAR Lasergene v7.1.0中的SeqMan软件合并同一菌株完全相同的ITS序列(不一样的序列标为不同的名字)，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基。根据Hibbett et al.(1995)的注释结果，用MEGA v 7.0软件提取出每个ITS序列中的ITS2序列，然后再用MEGA v 7.0软件将获得的ITS2序列与公布的每个类型的共有序列进行比对，构建邻接树。若获得的ITS2序列与某一类型的共有序列同源性高，则认为该ITS2序列属于该类型。最终将同一菌株的所有ITS2序列都进行类型确定，即可确定该菌株最终的细胞核类型。

c、在创制香菇栽培菌株核质杂交种，细胞核的提供者为我国现有的优良栽培菌株(可根据农艺性状和育种目标需求进行选择)，细胞质提供者为我国中南部、云贵高原等地的野生菌株。可根据1和2的步骤分别确定准备杂交的栽培菌株和野生菌株的细胞质和细胞核类型。最终筛选出将要用于杂交的亲本来源：栽培菌株(两个细胞核为ITS2-A1，细胞质为mt-A1) 和野生菌株(细胞核类型不用测定，细胞质为mt-A2或mt-B)。

制备原生质体单核菌丝的方法获得栽培菌株的两个单核菌丝、A2或B型细胞质野生菌株的一个单核菌丝。参照1和2的步骤分别测定每个单核菌丝的rrnL和ITS2序列，然后确定每个单核菌丝的细胞核和细胞质类型。

将不同的单核菌丝配对在PDA培养基上进行单单杂交，通过在菌落两端挑取菌丝，在显微镜下观察，如果有锁状联合结构形成，则认为配对的单核菌丝间是可交配的，最终筛选出可交配的两个栽培单核菌丝(细胞质和细胞核都为A1型)、细胞质类型为mt-A2或mt-B型的野生单核菌丝。然后分别将细胞质类型为mt-A2或mt-B型的野生单核菌丝与一个栽培单核菌丝进行正交，获得细胞质为mt-A2或mt-B型、细胞核分别来源于野生单核菌丝和一个栽培单核菌丝的双核菌丝。然后继续参照王丽宁等(2014)的方法，将该双核菌丝进行单核化、rrnL和ITS2序列测定，最终筛选到一个细胞核来源于栽培菌株而细胞质为mt-A2或 mt-B型的单核菌丝。然后继续将该单核菌丝与栽培菌株的另一个单核菌丝进行正交即可获得一个栽培菌株的核质杂交种(两个细胞核来源于栽培菌株，而细胞质来源于mt-A2或mt-B型的野生菌株)。为了进一步稳定该核质杂交种的遗传物质，可再进行一次回交。

1.亲本来源

前期，我们已经测定了44个栽培菌株和44野生菌株的细胞核类型进行了确定，另外也对其中的20个栽培和野生菌株的细胞质类型进行了确定。本实施例的选取工作是在这一工作上的延伸。通过研究，我们选取栽培菌株L808、野生菌株EFISAAS5053(采自贵州)和YAASM363(采自云南)作为细胞核和细胞质来源。

2.亲本细胞核和细胞质类型确定

在前期研究中，我们已经从ITS2序列和全基因组重测序角度明确了栽培菌株L808、野生菌株EFISAAS5053和YAASM363的细胞核和细胞质类型。但为了说明本发明中的鉴定流程，将已公布的ITS序列拿来做示范，另外的rrnL部分序列是新测定的。

2.1L808有两条ITS序列(KY49478和KY494479)，EFISAAS5053有两条ITS序列(KY494554和KY494555),YAASM363有两条ITS序列(KY494598和KY494599)，通过注释提取出它们的ITS2序列：L808-c1-ITS2(来自KY494478)，SeqNo.5；L808-c2-ITS2 (来自KY494479)，SeqNo.6；EFISAAS5053-c1-ITS2(来自KY494554)，SeqNo.7； EFISAAS5053-c2-ITS2(来自KY494555)，SeqNo.8；YAASM363-c1-ITS2(KY494598)， SeqNo.9；YAASM363-c2-ITS2(KY494599)，SeqNo.10。

将上面的ITS2序列与，ITS2-A1-Hap1、ITS2-A1-Hap3、ITS2-A2-Hap2、ITS2-B1-Hap6 进行同源比对，构建邻接树：其中YAASM363-c1-ITS2明显属于ITS2-B2型； YAASM363-c2-ITS2和EFISAAS5053-c1-ITS2明显属于ITS2-A2类别；L808-c1-ITS2、 L808-c2-ITS2和EFISAAS5053-c2-ITS2明显不属于ITS2-A2、ITS2-B1和ITS2-B2型，应该属于ITS2-A1型。因此，L808的两个核都属于ITS2-A1型；EFISAAS5053一个细胞核属于 ITS2-A1型、一个属于ITS2-A2型；YAASM363一个核属于ITS2-A2、一个属于ITS2-B2型。

2.2三个菌株的rrnL部分序列如下：

L808-partial rrnL，SeqNo.11；EFISAAS5053-partial rrnL，SeqNo.12；YAASM363-parital rrnL，SeqNo.13.

4个线粒体基因组的rrnL部分序列如下：

NC_018365.1-partial rrnL(mt-A1)，SeqNo.14；MF774812.1-partial rrnL (mt-A1)，SeqNo.15；KY217797.1-partial rrnL(mt-A2)，SeqNo.16； MF774813.1-partial rrnL(mt-B)，SeqNo.17。

将三个菌株的rrnL部分序列与4个线粒体基因组的rrnL部分序列进行同源比对(图2)： L808的细胞质明显属于mt-A1型；YAASM363的细胞质明显属于mt-B型；EFISAAS5053的细胞质明显与mt-A1和mt-B不同，属于mt-A2型。

3.单核菌丝获得及交配性确定

获得的L808的两个单核菌丝L808P65和L808P78，获得的EFISAAS5053的一个单核菌丝EFISAAS5053P1，YAASM363的一个单核菌丝YAASM363P1。经测定，EFISAAS5053P1 的ITS2序列即EFISAAS5053-c2-ITS2，细胞核类型为mt-A1型；YAASM363P1的ITS2序列即YAASM363-c1-ITS2，细胞核类型为mt-B型。

分别将L808P65和L808P78分别与EFISAAS5053P1和YAASM363P1两两配对，经检测：这L808P65与EFISAAS5053P1和YAASM363P1都可交配；L808P78与EFISAAS5053P1和YAASM363P1都可交配。

4.L808菌株的核质杂交种获得

经过多次原生质体制备单倍体技术、单单杂交技术和一次回交技术(图3)，即可获得两个L808核质杂交种：一个是细胞质为A2型的L808核质杂交种；一个是细胞质为B型的L808 核质杂交种(图4)。

以细胞质为mt-A2型的L808核质杂交种为例，解释具体流程：

3.1将L808P65与EFISAAS5053P1进行单单杂交，在EFISAAS5053P1一侧获得双核菌丝(细胞核为L808P65和EFISAAS5053P1的，但细胞质为EFISAAS5053P1)；

3.2将3.1中获得双核菌丝进行原生质体制备单倍体技术，获得其细胞核来源于L808P65、细胞质来源于EFISAAS5053P1的单核菌丝；

3.3将3.2中获得的单核菌丝与L808P78进行单单杂交，在3.2中获得单核菌丝一侧获得双核菌丝(细胞核来源于L808P65和L80878，细胞质来源于EFISAAS5053P1)，则该双核菌丝即为细胞质类型为mt-A2的L808核质杂交种；

3.4将3.3中获得的L808核质杂交种与L808P78进行回交，在L808核质杂交种一侧获得是遗传物质进一步稳定的L808核质杂交种。

在这一过程中，每个单核或双核菌丝的ITS2和rrnL部分序列都进行测定和分型研究，以保障最终获得L808核质杂交种的正确性。细胞质类型为mt-B的L808核质杂交种获得，将3.1-3.4中的EFISAAS5053P1替换成YAASM363P1即可。

一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，包括下列步骤：

步骤1：确定第一种香菇的细胞质类型

步骤2：确定第二种香菇的细胞核类型

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T VectorCloning Kit 载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取10个克隆子进行测序；

步骤3：创制香菇栽培菌株核质杂交种

参考文件：《利用原生质体紫外诱变技术选育耐高温香菇菌株》；《Mitogenometypes of two Lentinula edodes sensu lato populations in China》；《ITS1-5.8S-ITS2,a good marker for initial classification of shiitake culinary-medicinalLentinus edodes》。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法

<130> 20191216

<160> 17

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> rrnL部分基因上游引物

<400> 1 ATTGTCTCGG TGGTTTGGCA 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> rrnL部分基因下游引物

<400> 2 CGCTTTTTAA GTTCCCCGAT GT 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 上游引物

<400> 3 TCCGTAGGTG AACCTGCGG 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 下游引物

<400> 4 TCCTCCGCTT ATTGATATGC 20

<210> 5

<211> 273

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> L808-c1-ITS2

<400> 5

AATTCTCAAC TTTATAAGTT TTTACTTATT AAAGCTTGGA 40

TGTTGGAGGC TTGCAGGCGT TTGTCAGCTC CTCTTAAATT 80

TATTAGTGGG AACCCTGTTT TGTTAGTTCT AACCTTGGTG 120

TGATAATTAT CTACATTTTG GTGGAACCTT ACAATAATAA 160

AGCTCTATTG GTTTGGGTTG TTGCATTTAG TTTGCTCAAT 200

CTGTTCTATT CATTGGAGAA AAAGGGAAGT TCCGCTTTCT 240

AACTGTCTTG ATTGACTATA TATAACTTAT TTG 273

<210> 6

<211> 273

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> L808-c2-ITS2

<400> 6

AATTCTCAACTTTATAAGTTTTTACTTATTAAAGCTTGGA 40

TGTTGGAGGCTTGCAGGCGTTTGTCAGCTCCTCTTAAATT 80

TATTAGTGGGAACCCTGTTTTGTTAGTTCTAACCTTGGTG 120

TGATAATTATCTACATTTTGGTGGAACCTTACAATAATAA 160

AGCTCTATTGGTTTGGGTTGTTGCATTTAGTTTGCTCAAT 200

CTGTTCTATTCATTGGAGAAAAAGGGAAGTTCCGCTTTCT 240

AACTGTCTTGATTGACTATATATAACTTATTTG 273

<210> 7

<211> 273

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> EFISAAS5053-c1-ITS2

<400> 7

AATTCTCAACTTTATAAGTTTTTACTTATCAAAGCTTGGA 40

TGTTGGAGGCTTGCAGGCGTTTGTCAGCTCCTCTTAAATT 80

GATTAGTGGGAACCCTGTTTTGTTAGTTCTAACCTTGGTG 120

TGATAATTATCTACATTTTGGTGGAACCTTACAATAATAA 160

AGCTCTATTGGTTTGGGTTGTTGCATTTAGTTTGCTCAAT 200

CTGTTCTATTCATTGGAGCACAAGGGAAGTCCCGCTTTCT 240

AACTGTCTTGATTGACTATATATAACTTATTTG 270

<210> 8

<211> 273

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> EFISAAS5053-c2-ITS2

<400> 8

AATTCTCAACTTTATAAGTTTTTACTTATTAAAGCTTGGA 40

TGTTGGAGGCTTGCAGGCGTTTGTCAGCTCCTCTTAAATT 80

TATTAGTGGGAACCCTGTTTTGTTAGTTCTAACCTTGGTG 120

TGATAATTATCTACATTTTGGTGGAACCTTACAATAATAA 160

AGCTCTATTGGTTTGGGTTGTTGCATTTAGTTTGCTCAAT 200

CTGTTCTATTCATTGGAGAAAAAGGGAAGTTCTGCTTTCT 240

AACTGTCTTGATTGACTATATATAACTTATTTG 273

<210> 9

<211> 272

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> YAASM363-c1-ITS2

<400> 9

AATTCTCAACTTTATAAGTTTTTGCTTATTAAAGCTTGGA 40

TATTGGAGGTTTGCAGGCGTTTTGTCAGCTCCTCTTAAAT 80

TTATTAGTGGAACCCTGTTTTGTTGGTTTTCAACCTTGGT 120

GTGATAATTATCTACATTTTGGTTTGTAAATCTTACAAT 160

ATAAAGCTCTATTGGTTTGGGTTGTTGCATTTTAGTATGC 200

TCAATCTGTTCTACTCATTGGAGAAAAAGGGAAGGTCTGC 240

TTTCTAACTGTCTTCATTGACTAACTTATTTG 272

<210> 10

<211> 273

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> YAASM363-c2-ITS2

<400> 10

AATTCTCAACTTTATAAGTTTTTACTTATCAAAGCTTGGA 40

TGTTGGAGGCTTGCAGGCGTTTGTCAGCTCCTCTTAAATT 80

GATTAGTGGGAACCCTGTTTTGTTAGTTCTAACCTTGGTG 120

TGATAATTATCTACATTTTGGTGGAACCTTACAATAATAA 160

AGCTCTATTGGTTTGGGTTGTTGCATTTAGTTTGCTCAAT 200

CTGTTCTATTCATTGGAGCATAAGGGAAGTCCCGCTTTCT 240

AACTGTCTTGATTGACTATATATAACTTATTTG 273

<210> 11

<211> 602

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> L808-partial rrnL

<400> 11

ATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATATT 40

ATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAAC 80

AAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAAT 120

ACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTATC 160

TTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCAG 200

TATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAATA 240

TAATATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAAT 280

AAATAAATTAGTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTC 320

CCTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTGCCCTTTAGGGGGAG 360

GGGAGGCAGCGAAGCTGCCGATTCTTAATTATTTCATTAA 400

AGTAACAAAAATTTGTATTTACCCTTACGCTACTATACCT 440

ATCCCTCCCCTATCCCTCCCCTATCCCTTTAGGCTGGGAA 480

GGGTGGGTGGTTATCCCTTTAGGGTGCTGGGTGGGAAGGC 520

AGGGACCCTTTTTTTATATAATAATTTATAATATTAAAAA 560

AAACATAAAATTAAAAAAAGACATCGGGGAACTTAAAAAG 600

CG 602

<210> 12

<211> 624

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> EFISAAS5053-partial rrnL

<400> 12

ATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATATT 40

ATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAAC 80

AAAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAA 120

TACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTAT 160

CTTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCA 200

GTATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAAT 240

ATAATATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATAAAT 280

AAATTAGTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTCCCTA 320

CCTGCGGTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTG 360

CGGTACCTGCGGTACCTGCCCTTTAGGGGGAGGGGAGGCA 400

GCGAAGCTGCCGATTCTTAATTATTTCATTAAAGTAACAA 440

AAATTTGTATTTACCCTTACGCTACTATACCTATACCTCC 480

CCTATCCCTGCCCTAAAGGGAAGGCTGGGTGGTTATCCCT 520

TTAGGGTGCTGGGTGGGAAGGCAGGGACCATTTTTTTATA 560

TAATAATTTATAATATTAAAAAAAACATAAAATTAAAAAA 600

AGACATCGGGGAACTTAAAAAGCG 624

<210> 13

<211> 613

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> YAASM363-parital rrnL

<400> 13

TATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATAT 40

TATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAA 80

CAAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAA 120

TACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTAT 160

CTTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCA 200

GTATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAAT 240

ATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATAAATAAATT 280

AGTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTCCCTACCTGC 320

GGTACCTGCCCTTTAGGGGGAGGGGAGGCAGCGAAGCTGC 360

CGATTCTTAATTATTTCATTAAAGTAACAAAAATTTGTAT 400

TTACCCTTACGCTACTATCCCTATACCTCCCCTATCCCTG 440

CCCTCCCACCCTAAAGGGATAGGGGAGGGAAGGCTGGGTG 480

GTTAGGCCCCCTCCCCTAAAGGGAAGGGAGGGTGGGTGCC 520

GTACGGCGGGCAGGGACCCTTTTTTTATATAATAATTTAT 560

AATATTAAAAAAAACATAAAATTAAAAAAAGACATCGGGG 600

AACTTAAAAAGCG 613

<210> 14

<211> 597

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> NC_018365.1-partial rrnL (mt-A1)

<400> 14

ATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATATT 40

ATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAAC 80

AAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAAT 120

ACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTATC 160

TTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCAG 200

TATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAATA 240

TAATATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATAAATA 280

AATTAGTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTCCCTAC 320

CTGCGGTACCTGCGGTACCTGCCCTTTAGGGGGAGGGGAG 360

GCAGCGAAGCTGCCGATTCTTAATTATTTCATTAAAGTAA 400

CAAAAATTTGTATTTACCCTTACGCTACTATACCTATCCC 440

TCCCCTATCCCTCCCCTATCCCTTTAGGCTGGGAAGGGTG 480

GGTGGTTATCCCTTTAGGGTGCTGGGTGGGAAGGCAGGGA 520

CCCTTTTTTTATATAATAATTTATAATATTAAAAAAAACA 560

TAAAATTAAAAAAAGACATCGGGGAACTTAAAAAGCG 597

<210> 15

<211> 611

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> MF774812.1-partial rrnL (mt-A1)

<400> 15

ATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATATT 40

ATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAAC 80

AAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAAT 120

ACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTATC 160

TTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCAG 200

TATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAATA 240

TAATATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAAT 280

AAATAAATTAGTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTC 320

CCTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTGCCCTT 360

TAGGGGGAGGGGAGGCAGCGAAGCTGCCGATTCTTAATTA 400

TTTCATTAAAGTAACAAAAATTTGTATTTACCCTTACGCT 440

ACTATACCTATCCCTCCCCTATCCCTCCCCTATCCCTTTA 480

GGCTGGGAAGGGTGGGTGGTTATCCCTTTAGGGTGCTGGG 520

TGGGAAGGCAGGGACCCTTTTTTTATATAATAATTTATAA 560

TATTAAAAAAAACATAAAATTAAAAAAAGACATCGGGGAA 600

CTTAAAAAGCG 611

<210> 16

<211> 614

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> KY217797.1-partial rrnL (mt-A2)

<400> 16

ATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATATT 40

ATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAAC 80

AAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAAT 120

ACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTATC 160

TTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCAG 200

TATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAATA 240

TAATATAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATAAATA 280

AATTAGTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTCCCTAC 320

CTGCGGTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTGCGGTACCTGC 360

GGTACCTGCCCTTTAGGGGGAGGGGAGGCAGCGAAGCTGC 400

CGATTCTTAATTATTTCATTAAAGTAACAAAAATTTGTAT 440

TTACCCTTACGCTACTATACCTATACCTCCCCTATCCCTG 480

CCCTAAAGGGAAGGCTGGGTGGTTATCCCTTTAGGGTGCT 520

GGGTGGGAAGGCAGGGACCATTTTTTTATATAATAATTTA 560

TAATATTAAAAAAAACATAAAATTAAAAAAAGACATCGGG 600

GAACTTAAAAAGCG 614

<210> 17

<211> 612

<212> DNA

<213> 自然序列

<223> MF774813.1-partial rrnL (mt-B)

<400> 17

ATTGTCTCGGTGGTTTGGCACCTTTTTGTCTTAAGATATT 40

ATATAATTTATTATAATTAAAAGGAAAAATACAAACAAAC 80

AAAAAAAAAGAAAAAGAGCGTACGCTGTGTACGCAGAAAT 120

ACTAAAATTACCAAAATAAATAAAAAAGAAGGGTTTTATC 160

TTAGATATTAGATCTCAACCTCCACTAATCAATGTTTCAG 200

TATATAGTGTAATATTTAAAAAATATAATATAATATAATA 240

TAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATAAATAAATTA 280

GTAATTTTAAAAATAAAATCTTAGTGCCTCCCTACCTGCG 320

GTACCTGCCCTTTAGGGGGAGGGGAGGCAGCGAAGCTGCC 360

GATTCTTAATTATTTCATTAAAGTAACAAAAATTTGTATT 400

TACCCTTACGCTACTATCCCTATACCTCCCCTATCCCTGC 440

CCTCCCACCCTAAAGGGATAGGGGAGGGAAGGCTGGGTGG 480

TTAGGCCCCCTCCCCTAAAGGGAAGGGAGGGTGGGTGCCG 520

TACGGCGGGCAGGGACCCTTTTTTTATATAATAATTTATA 560

ATATTAAAAAAAACATAAAATTAAAAAAAGACATCGGGGA 600

ACTTAAAAAGCG 612

Claims

1.一种利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，其特征在于：

包括下列步骤：

步骤1：确定第一种香菇的细胞质类型

将香菇的菌丝加入容纳有裂解液的离心管中，在混匀仪上混匀，得到菌丝裂解液，然后以所述菌丝裂解液为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：菌丝裂解液1μL、rrnL部分基因上游引物0.5 μL、rrnL部分基因下游引物0.5 μL、PCR Magic Mix 3.0 12.5 μL、无菌 ddH₂O10.5 μL；PCR反应流程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55 ℃退火30 s，72℃延伸50s，35个循环；72 ℃终延伸7 min；

rrnL部分基因上游引物为：5’-ATTGTCTCGGTGGTTTGGCA-3’， rrnL部分基因下游引物为：5’-CGCTTTTTAAGTTCCCCGATG T-3’；

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T VectorCloning Kit载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取5个克隆子进行测序；

rrnL部分基因分析及细胞质类型确定：用DNASTAR Lasergene v7.1.0中的SeqMan软件合并同一菌丝的rrnL部分基因，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基；将获得的rrnL部分基因与4个线粒体基因组的rrnL相同位置的基因进行同源比对，所用软件为MEGA v7.0，构建的系统发育树为邻接树；若该rrnL部分基因与哪个线粒体的rrnL相同位置的基因同源性高，则认为该菌丝与同源性高的线粒体基因组属于同一个基因组类型；

步骤2：确定第二种香菇的细胞核类型

将香菇的菌丝加入含有裂解液的离心管中，在混匀仪上混匀，得到菌丝裂解液，然后以所述菌丝裂解液为模板进行PCR扩增；PCR反应体系为：菌丝裂解液1μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、PCR Magic Mix 3.0 12.5 μL、无菌 ddH₂O 10.5 μL；PCR反应流程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55 ℃退火30 s，72℃延伸50s，35个循环；72 ℃终延伸7 min；

上游引物为通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物为通用引物ITS4：5’- TCCTCCGCT TAT TGA TATGC-3’；

PCR结果检测及测序：扩增结束后，将PCR反应产物在琼脂糖凝胶电泳上检测、切胶，用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit回收特异性片段，连接至pUCm-T VectorCloning Kit载体中，然后用Ultra-Competent Cell Preps Kits转入感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个菌丝挑取10个克隆子进行测序；

ITS2序列分析及细胞核类型确定：用DNASTAR Lasergene v7.1.0中的SeqMan软件合并同一菌株完全相同的ITS序列，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的碱基；用MEGA v7.0软件提取出每个ITS序列中的ITS2序列，然后再用MEGA v 7.0软件将获得的ITS2序列与细胞核类型的共有序列进行比对，构建邻接树；若获得的ITS2序列与某一类型的共有序列同源性高，则认为该ITS2序列属于该类型；最终将同一菌株的所有ITS2序列都进行类型确定，即可确定该菌株最终的细胞核类型；

步骤3：创制香菇栽培菌株核质杂交种

将不同的单核菌丝配对在PDA培养基上进行单单杂交，通过在菌落两端挑取菌丝，在显微镜下观察，如果有锁状联合结构形成，则认为配对的单核菌丝间是可交配的，筛选出可交配的两个栽培单核菌丝，其细胞质和细胞核都为A1型、细胞质类型为mt-A2或mt-B型的野生单核菌丝；然后分别将细胞质类型为mt-A2或mt-B型的野生单核菌丝与一个栽培单核菌丝进行正交，获得细胞质为mt-A2或mt-B型、细胞核分别来源于野生单核菌丝和一个栽培单核菌丝的双核菌丝；然后将该双核菌丝进行单核化、rrnL和ITS2序列测定，筛选到一个细胞核来源于栽培菌株而细胞质为mt-A2或mt-B型的单核菌丝；然后继续将该单核菌丝与栽培菌株的另一个单核菌丝进行正交即可获得一个栽培菌株的核质杂交种，即两个细胞核来源于栽培菌株，而细胞质来源于mt-A2或mt-B型的野生菌株。

2.根据权利要求1所述的利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，其特征在于：为了进一步稳定该核质杂交种的遗传物质，可再进行一次回交。

3.根据权利要求1所述的利用细胞质和细胞核分子标记创制香菇栽培菌株核质杂交种的方法，其特征在于：步骤1中，在确定第一种香菇的细胞质类型时，NC_018365.1和MF774812.1的线粒体类型为A1型，KY217797.1的线粒体类型为A2型，MF774813.1的线粒体类型为B型。