CN109666762A - 干巴菌单拷贝基因的特异性扩增引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了干巴菌单拷贝基因的特异性引物及其应用，属于分子生物学技术领域，所述特异性引物包括2892F和3125R；所述2892F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3125R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明中，所述引物2892F、3125R为单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物；所述干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物能够用于干巴菌的鉴定以及土壤中干巴菌生物量的测定，为干巴菌生长机理等的研究提供重要的参考价值。

Description

干巴菌单拷贝基因的特异性扩增引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及干巴菌单拷贝基因的特异性引物及其应用。

背景技术

单拷贝基因(Single copygene)又称单拷贝核基因，是指基因组中拷贝数目较少，只有1个或几个拷贝的核基因，大多数是属于生物体内组成型表达的持家基因。单拷贝核基因主要编码蛋白质，其序列含有系统发育信息，非常保守，大部分是以点突变的方式存在，进化速率属于中等水平，它的基因结构适合系统发育分析。特别是，在基因组中这些基因只有1个或很少的拷贝，比较容易确定他们之间的同源关系；并且这些基因没有复杂的内部重复和明显的核苷酸偏向性，比较适合用来进行序列比对和分析。这些特征使得单拷贝核基因特别适合于研究中层分类阶元系统发育关系。单拷贝核基因是分子系统学中一种极有价值的分子标记，在构建生命树的主干及主干和末梢之间的中间分枝中将起极其重要的作用。

单拷贝核基因的应用十分广泛，在动物、植物、真菌和细菌领域均有研究，其中主要的研究方法有：1.PCR扩增法。2.gDNA克隆法。gDNA克隆法是将DNA片段与特定的载体进行连接，然后转入宿主细胞，最终可以筛选出重组子后再对其进行扩增的方法。3.cDNA克隆法等。cDNA克隆法具有明显的优点，运用此方法不但可以得到基因序列，还可以研究基因的结构和功能。

干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)是一种野生食用菌，属担子菌门(Basidiomycota)、革菌科(Thelephoraceae)、革菌属(Thelephora)，能与多种松科植物共生，是一种外生菌根真菌。干巴菌口味鲜美且独特，深受人们喜爱，有研究表明干巴菌具有潜在的药用价值，已经从干巴菌中分离得到具有抗氧化性以及抗癌活性物质。干巴菌目前还不能进行人工培育，均来自野外，价格高昂，具有巨大的经济价值。由于核酸在生物体中的含量十分稳定，在代谢上也非常稳定，受其他外界条件的影响较小。利用核酸测定能够较为快速、准确的测定土壤中干巴菌的生物量，但是目前尚没有干巴菌单拷贝核基因的特异性引物的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种干巴菌单拷贝基因的特异性引物及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物，所述特异性引物包括2892F和3125R；所述2892F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3125R的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明提供了所述的特异性引物在干巴菌鉴定中的应用。

优选的，利用所述特异性引物对待鉴定的菌株的基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物，对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现扩增条带，则说明所述待鉴定菌株为干巴菌；若无扩增条带，则说明所述待鉴定菌株不是干巴菌。

优选的，所述扩增条带位于Marker条带中250bp条带与100bp条带之间，靠近250bp条带。

优选的，所述PCR扩增的体系包括如下组成：

PCR扩增MIX 22.5μl，引物2892F 1μl，引物3125R 1μl，模板DNA 10μl；

所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性2min；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

本发明还提供了所述的特异性引物在检测土壤中干巴菌的生物量中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物能够特异性的扩增干巴菌基因组中的单拷贝基因e_gw1.16.180.1获得234bp的扩增产物；无其他非特异性扩增；所述干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物能够用于干巴菌的鉴定以及土壤中干巴菌生物量的测定，为干巴菌生长机理等的研究提供重要的参考价值。

附图说明

图1为用引物2892F/3125R扩增3份生长干巴菌的土壤基因组DNA样品的结果图，其中Y为阴性对照；a,b,c,为生长干巴菌的土壤样品；M为2000marker；

图2为不同引物扩增不同菌种样品基因组DNA的结果，y为阴性对照，T、Q、G分别为生长铜绿菌、青头菌、干巴菌的土样用2892f/3125r扩增的结果，t、q、g分别为生长铜绿菌、青头菌、干巴菌的土样用真菌通用引物ITS4/ITS5扩增结果，M为2000marker。

具体实施方式

本发明提供了干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物，所述特异性引物包括2892F和3125R；所述2892F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为5’-TACCCCGTCCAACACAAACT-3’；所述3125R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为5’-TGATCCTTCCTCAACGCCTT-3’。本发明中，所述特异性引物能够特异性的扩增干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1，扩增效率高，特异性好，无非特异性扩增。

在本发明中，所述单拷贝基因e_gw1.16.180.1的确定方法如下：将干巴菌、褐环乳牛肝菌、灵芝、黑孢块菌、双色蜡蘑、双孢蘑菇的蛋白质序列数据进行同源聚类，确定6个物种同源基因家族，并且从所述同源基因家族中筛选单拷贝基因。在本发明中，所述干巴菌基因组和转录组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，所述褐环乳牛肝菌(Suillusluteus)、灵芝(Ganoderma lucidum)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、双色蜡蘑(Laccariabicolor)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的蛋白序列优选的从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别下获得。所述同源聚类优选的利用OrthoMCL软件的标准参数流程(BLASTP E-value<1e-5)进行。本发明中所述的单拷贝基因e_gw1.16.180.1的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述单拷贝基因e_gw1.16.180.1编码的蛋白的ID为3091405；所述单拷贝基因e_gw1.16.180.1的转录本ID为3091500。

本发明提供了所述的特异性引物在干巴菌鉴定中的应用。本发明利用所述特异性引物对待鉴定的菌株的基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物，对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现扩增条带，则说明所述待鉴定菌株为干巴菌；若无扩增条带，则说明所述待鉴定菌株不是干巴菌。本发明中，所述扩增条带优选的位于Marker条带中250bp条带与100bp条带之间，靠近250bp条带。本发明中所述扩增产物的大小为234bp，具体序列如SEQID NO:7所示，具体如下：TACCCCGTCCAACACAAACTCCACGTACAAGCCTATAGTTCGGACCGATCGACATTTCAACCACCTGAAAATTCCCAGGAAACTCCAAGGAGAACTCCCCTACACATCGAAACCCAAGGCCATAAAACCCCAGCGGAAGGCCATGTACACGCAGCGGAGAGCAGTAGTCTTGGAAACAGAGGAGAAGAAGGCCATTACTCTACTACAACAAGCAAAGGCGTTGAGGAAGGATCA。本发明对所述菌株的基因组DNA的来源和提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的来源和提取方法即可。本发明中，所述PCR扩增的体系包括如下组成：PCR扩增MIX，22.5μl，引物2892F，1μl，引物3125R，1μl，模板DNA，10μl。所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性2min；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

本发明还提供了所述的特异性引物在检测土壤中干巴菌的生物量中的应用。本发明中，优选的提取土壤样品中的基因组DNA，然后利用所述特异性引物对所述土壤样品中的基因组DNA进行扩增，根据扩增产物的量来确定土壤样品中干巴菌的生物量。本发明中，所述扩增体系和程序优选的和干巴菌鉴定中的扩增体系和程序一致，在此不再赘述；所述扩增产物的量的确定采用本领域常规的方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.材料

生长干巴菌的土壤样品都是在云南省武定县采集到的(见表1)。采集方法：在每个干巴菌生长地，用5点法取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃(生长干巴菌的土壤样品为含有干巴菌的真菌混合样品)。

表1样品采集信息

2方法

2.1DNA提取

DNA提取使用凯杰公司的DNA Isolation Kit(货号为：12888-50)进行DNA提取。取表1所列真菌土壤样品约300mg(野外采集的生长干巴菌的土壤样品)，转入PowerBeadTμbes provided研磨管(加入土壤样品前加入60μl C1溶液)中，轻轻混匀；70℃孵育5min，涡旋3-4s，然后70℃孵育5min，涡旋3-4s，最后70℃孵育5min；使用TissμePreP研磨仪器速度为4，研磨10min，1000g离心30s；取上清液加入250μl的C2到2ml的离心管中混匀5s，4℃孵育5min，1000g离心1min；取600μl的上清液和200μlC3到2ml的离心管中混匀，4℃孵育5min，1000g离心1min；取新的2ml的离心管加入1200μl的C4和750μl的上清液混匀，每次取675μl的混合溶液到MB Spin Colμmn中1000g离心30s，倒掉离心管中液体，重复2次，直到所有混合液全部转入MB Spin Colμmn中为止，倒掉离心管中所有液体；加入500μl的C5，1000g离心30s，倒掉离心管中液体，1000g离心1min；将MB Spin Colμmn放入新的2ml的离心管中，加入100μl C6到白色过滤膜上，1000g离心30s，收集液体放到-20℃备用(所得的液体为土壤真菌DNA混合液体)。

2.2从干巴菌基因组中筛选单拷贝基因

本发明中的干巴菌基因组和转录组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。同时，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别下载褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)、灵芝(Ganoderma lucidum)、黑孢块菌(Tuber melanosporum)、双色蜡蘑(Laccariabicolor)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的蛋白序列，利用OrthoMCL软件的标准参数流程(BLASTP E-value<1e-5)对上述五个物种和干巴菌的蛋白序列进行同源(ortholog)聚类，确定6个物种同源基因家族。从上述同源的基因家族中筛选6个物种的单拷贝基因家族作为候选基因(见表2):

表2候选单拷贝基因列表

编号	蛋白ID	基因ID	转录本ID
				1	3091405	e_gw1.16.180.1	3091500

2.3引物

用Primer3(http://primer3.ut.ee/)对干巴菌基因组中筛选的e_gw1.16.180.1单拷贝基因进行引物设计，设计的引物为：2892F/3125R(见表3)。

验证引物特异性所用真菌通用引物ITS4/ITS5，以菌液为模板做PCR扩增时，所用007S载体的通用引物M13F/M13R(见表4)。

上述引物委托昆明硕擎生物科技有限公司合成，得到PCR扩增用引物。

表3特异性引物序列信息

表4通用引物序列信息

M13F	5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：3)
		M13R	5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(SEQ ID NO：4)
ITS4	5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO：5)
		ITS5	5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(SEQ ID NO：6)

2.4验证引物的特异性

分别用g1、g2、g3生长干巴菌的土壤样品提取得到3份混合真菌DNA样品作为模板，用引物2892F、3125R和ITS4、ITS5进行PCR反应，扩增反应体系为：金牌MIX(购自昆明硕擎生物科技有限公司)22.5μl，2892F 1μl，3125R 1μl(和ITS41μl、ITS51μl)，DNA 10μl。扩增条件为：98℃预变性2min；然后98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；最后72℃延伸5min。取2μl PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，GeneFinderTM染色，紫外透射仪检测，结果如图1和图2所示，图1中y为阴性对照；a为干巴菌样品g1；b为干巴菌样品g2；c为干巴菌样品g3；M为2000marker；图2中，y为阴性对照，T、Q、G分别为生长铜绿菌、青头菌、干巴菌土样用2892F/3125R扩增的结果，t、q、g分别为生长铜绿菌、青头菌、干巴菌的土样用真菌通用引物ITS4I/TS5扩增的结果，M为2000marker。

由此可见，用本发明所述的特异性引物扩增干巴菌基因组DNA样品，能够扩增出234bp大小的片段，且扩增条带为单一条带。将PCR扩增产物送到公司(昆明硕擎生物科技有限公司)测序，测序所得到的峰图良好，均无杂峰出现，拼接后得到干巴菌e_gw1.16.180.1基因序列片段。将2892F、3125R这对引物在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中查询，没有与此对引物序列相同的引物。以上说明该引物为特异性扩增干巴菌的引物。

2.5挑克隆方法验证单拷贝基因

准备PCR回收产物，取25μl PCR产物和5μl 10*loading buffer混匀，2％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物回收时做割胶回收。具体回收步骤按照从云南晨绿生物科技有限公司购买的天根DNA纯化回收试剂盒操作。回收的DNA片段两端需要加入腺嘌呤，反应体系为：回收产物10μl，dNTP 1μl，10*LaTaqPCR Buffer 2μl，LaTaq 1μl，混匀，反应条件为：72℃反应30min，-20℃保存备用。

配800ml的LB液体培养基，100ml的LB固体培养基，120℃灭菌10min，固体培养基温度到50℃，按千分之一的比例加入氨苄青霉素混匀，倒平板备用。每100ml LB培养基配比为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，固体培养基每100ml加1.2g琼脂糖。

把两端加上腺嘌呤的DNA片段与朔擎生物有限公司的007S载体链接，反应体系为：加入腺嘌呤的切胶回收产物4μl，PClone 007S Vector 1μl，10*ToPo mix 1μl，ddH₂O 4μl。反应条件为：室温5min。

把上述步骤的产物导入到TaKaRa E.coli JM109感受态细胞中，具体步骤如下：1.准备工作：(1)把水浴锅调至42℃；(2)准备复苏培养基(不加氨苄青霉素的LB培养基)。(3)开摇床，调节温度至37℃。2.取感受态细胞(Takara)置于冰上溶解。3.把感受态细胞直接加入到连接产物中，用枪慢慢吸打混匀，然后置于冰上30min。4.把加入了感受态细胞的连接产物放到42℃水浴锅中90sec，立即放置冰上5min。5.然后再全部转移至加入1ml的复苏LB培养基(不加入氨苄青霉素)的1.5ml的EP管中，在摇床上180rpm，37℃，培养1h。6.涂板：每管取160～200μl加到准备好的平板上，用涂布器涂匀，放置37℃30min之后，把培养平板翻过来，培养基那一面朝上，培养11～12h。

用200μl移液枪挑取单克隆，放入到加入1ml LB扩大培养基(加入氨苄青霉素)中，每个平板挑取30个单个菌落，在摇床上180rpm，37℃，培养3～4h。然后用培养的菌液做PCR扩增，所用引物是007S载体通用引物M13F，M13R(如表2)，PCR扩增体系为：金牌MIX(昆明硕擎生物科技有限公司)22.5μl，M13F 1μl，M13R 1μl，DNA 1μl。扩增条件为：98℃预变性2分钟；然后98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35次循环；最后72℃延伸5分钟。取2μl PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，电泳的电压为90V，电泳的电流为78mA，GeneFinderTM染色，紫外透射仪检测，检测结果有条带的把PCR反应产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。

测序结果用BiOEdit软件进行比对，比对结果显示所挑取的30个单克隆插入的DNA片段序列完全相同。以上方法可说明基因e_gw1.16.180.1为单拷贝基因，引物2892F、3125R为单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 干巴菌单拷贝基因的特异性扩增引物及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taccccgtcc aacacaaact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatccttcc tcaacgcctt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 7

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taccccgtcc aacacaaact ccacgtacaa gcctatagtt cggaccgatc gacatttcaa 60

ccacctgaaa attcccagga aactccaagg agaactcccc tacacatcga aacccaaggc 120

cataaaaccc cagcggaagg ccatgtacac gcagcggaga gcagtagtct tggaaacaga 180

ggagaagaag gccattactc tactacaaca agcaaaggcg ttgaggaagg atca 234

<210> 8

<211> 3530

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcagattcgt tgacgttgtg accggctgtc cttttccacg tctcgtttcc gtttaatgcc 60

tgcagcgcgc atgtactcct gtttgtcacg tttctttctt ccctccttct ccaaagctcc 120

cttctctgct atcctcatac gaatactggc ctttcgatcg tgttgctgcc tccgcctcac 180

gatctgatcc ttcctcaacg cctttgcttg ttgtagtaga gtaatggcct tcttctcctc 240

tgtttccaag actactgctc tccgctgcgt gtacatggcc ttccgctggg gttttatggc 300

cttgggtttc gatgtgtagg ggagttctcc ttggagtttc ctgggaattt tcaggtggtt 360

gaaatgtcga tcggtccgaa ctataggctt gtacgtggag tttgtgttgg acggggtagg 420

aagaccttcc gacctccgga cttcccctgt cagacgcatt ccagcccaat tgctcttatc 480

tgaaagtaat aaggaagtga ctgggttata gagcttcctc ggcatcacgg cagtccaaga 540

cctcaagaag acgatatctg gtagaatata tcgtcaaagt ggaacacgtc gtaaagaaca 600

tgattgccca ccactcatca acaccttatc ctcgaaggtt gctcggaaag caccgtctgg 660

ctttggtaag gcacgcttga cctgtccacg tatcccagaa actgtccgga cattcgcacc 720

ttcaaacttg gcaacctcta atgcgctcgt aaacatgtcc ttgacgaatg ccgtattctt 780

gaaaatcttg tatggtaccc cggtaagttt gagcttcttg actatcttga ccgagtgatc 840

aatgtcaagg acgacaccgg ttgcagacac tctgaatcct ttatactcgg gtgtcagaga 900

attgaatgcg cagaatccgg tgttaggaag agacacagga ccataaaagg tcgcgtagca 960

gtgcatgtgt tcaggggtat acttgagtaa gcgcattcga acagaatgat cgtccaaaga 1020

atagacggga ataccctgga accgcctcca tccgagggag aagatcaatg ggtcgtcggt 1080

tttcaatgtt cgcgggaacc accgatgtcg ctttaatcga acctgcacga agccaaaccg 1140

ttcttctgcc gccaacaaac ctccgacgat gatagggtac gttgggtcga agttctcaac 1200

catttcgcag gggatcccct ggacttcgat acggagatac gatcctggag ggaacccctc 1260

tatggctgtg cgcatgcctt cgtccaaagc ctggaattct tcgcgattaa gggctgattg 1320

tttagccatg tcctccttta gttcgtcgta gaatccttta gctgacgtgc ccggatcttc 1380

gtattgctca tcgaatttcc gccgcaagta ctccctttca gtaagtagag tagcactgcg 1440

ggagcgacct tcgtctatgt tgggttcaag atcctcgaaa tccccatcaa cttctgaacc 1500

ttcctcttcc tcacgttggc ctggcgagtc atccaaacct gtgataaaca gttgacggat 1560

gacacctaaa acctccacat ccttccacct ctcatccgga tcgtttgtca gccgttcttt 1620

ggtcgcgtcc agttgttcga cgatccgacc accccccggc actgggacaa agaaatcgtc 1680

ttctgtgcca agagaatccg cgtgtgttac accccgaagg atttgtgtgg gtgtcagcac 1740

cgacgaatac accaatttga accagtctat cctcggggga cgcgccacag gaccgtgttt 1800

cgtgggtgta gtagtacccg aattagattt caaccacgga gtatcactaa gaccgtcgtt 1860

tgggatatca ggattgccac tccaggggga atctcgaatg gtgaggttag cggaggtggc 1920

ctgagaaatg ccttcgccgg aatcctctga gtcactccca gcgaaatata gacgatgatc 1980

gtgctcgagt ggggatccag tagcaaggga cctcatggaa cgcctgcctg gaagatcgtc 2040

ttcgtcgatg cccctgacgt cagaggtgat atcttccata tcagaaaggt cggaatccga 2100

gctctggtag tttgaatcag atccccaatc ctcatccgtt tcaatcacca cctctctagg 2160

cgtgagcccg cttaatgaag tcccgaataa atgaatagat ttgttggaag tgacttcttg 2220

tagagtggat gaggcacctt gcagggcgaa catcatcctc tcgccttccc ccagtgggac 2280

tacgaaacac tgttgtcaaa ggtatgcgag ggagggggga gagagaaatt acagaccctc 2340

attattctcc ctcacgaaag ttccgggtac gttcacgtac actgcgtcct tgtcgtacgt 2400

cactcctccg acgccactca ttggggcgtg aatgatcaac ttctgtttct cgctcaactt 2460

ccgccgtttc tcggagtcca tattagggag aggacaaggg tcatttaacc gagttgaaga 2520

agcgatttcg aagtcgccag cgccgggaat atggatctta gaacgttgtt gcaggttggt 2580

tcctctgagg tacccgtaca gggtgattcg acggtcacat tttccctctg acagtctaac 2640

ctcttccctg ggggtaagat cctccattct gtcggcaagc agatatgggt gagagtttcg 2700

aaagacgagc ggacggaatt tcatggtggc gatgaacctt gaaagattca agatttcatt 2760

gtcaggatac cggccattga gaacgcccga gaggtagaaa agctttgccc cttgataaat 2820

ttctgtccag aatcgtttct tcagagactt ttttgtgtct cgaagggtag ataccttctt 2880

gatcaggtcc aggtgggtga gtacgccaat gacctttggg aaaccgtggg actgcagtac 2940

gttgaggaat tcaaacgttt cctaacacac ttcagtcagt taacgctaga gccgtcaacg 3000

cagctgcaat atgcaccatt tcgaacccaa aagatgcatc gaccaacagc aggactaggt 3060

cagcgacctt cccaatgtca atcatagagt tgaggtcgtt gttgcactct acgaacgtga 3120

gtctccgccg cttcccgctg acaacggtga taggcccctg gacgtggttc aaggtctgct 3180

tcgtggatct tcgaacgagg cttttgagga gtgttgtttt ccccactcca ggtgggccga 3240

caatggccac gatgacagga ggagggtcct cgtccggtgt acgattgaca agaggtacgt 3300

gaaggcgtgt ctgatctcgt tcaacagtcc ttcgggcctg cctgtctgcc ctgcgtccag 3360

atttcggagc gaatgcctga agatcagaaa gattggttaa tttgccacga gaaccgcgaa 3420

gtctgtcgta ctctttcgtt gaaaccggta ggcacctttt ccttctcact tctcttgtcc 3480

cccttagccc gggattggct cagtcggtgc ggtttgtgtt tttgttgcat 3530

Claims (6)

1.干巴菌单拷贝基因e_gw1.16.180.1的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括2892F和3125R；所述2892F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3125R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的特异性引物在干巴菌鉴定中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述特异性引物对待鉴定的菌株的基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物，对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现扩增条带，则说明所述待鉴定菌株为干巴菌；若无扩增条带，则说明所述待鉴定菌株不是干巴菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述扩增条带大小为234bp。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的体系包括如下组成：

PCR扩增MIX 22.5μl，引物2892F 1μl，引物3125R 1μl，模板DNA 10μl；

所述PCR扩增的程序如下：98℃预变性2min；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

6.权利要求1所述的特异性引物在检测土壤中干巴菌的生物量中的应用。