CN109371152A

CN109371152A - 十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物、使用方法及其应用

Info

Publication number: CN109371152A
Application number: CN201811315629.XA
Authority: CN
Inventors: 吉万全; 王艳珍; 王斯文; 陈春环; 王长有; 杜欣; 朱晨; 王小华; 莫启波; 张荣琦
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2019-02-22

Abstract

本发明公开了一种十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物、使用方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。本发明利用基因数据库信息，通过筛选、设计、合成以及PCR扩增验证，筛选得到42个SSR分子特异性标记引物对和114个EST‑STS分子特异性标记引物对，上述标记均可在十倍体长穗偃麦草中扩增出特异条带，在十倍体长穗偃麦草、普通小麦及部分同源种属材料间有显著差异，且为十倍体长穗偃麦草分子标记辅助育种工作提供理论支撑。

Description

十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物、使用方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物、使用方法及其应用。

背景技术

十倍体长穗偃麦草[syn.Agropyronelongatum ssp.ruthenicumBeldie；Elytrigiapontica(Podp.)Holub；Lophopyrumponticum(Podp.)Thinopyrumponticum(Podp.)Barkworth和Dewey，2n＝10x＝70]，具有抗病性强、分蘖多、大穗多花、抗寒、抗旱、抗倒伏、耐盐碱、高蛋白等优良特性，是小麦重要的近缘优异基因供体之一。研究表明，长穗偃麦草对小麦叶锈病、秆锈病、条锈病、白粉病、条纹花叶病和赤霉病)等具有高度的抗性。

在长穗偃麦草中有多种抗病基因：其中有抗秆锈病基因Sr24、Sr25、Sr26、Sr43，抗条锈病基因Yr69、YrTp1和YrTp2、抗白粉病基因Pm51，抗叶锈病基因Lr19、Lr24、Lr29和抗小麦条纹病毒基因Cmc2。长穗偃麦草被用来育成了大批抗大麦黄矮病毒的中间材料。其中Sr24、Sr25、Sr26、Sr43、Lr19、Lr24、Lr29、Cmc2八个抗病基因均已成功转移到小麦品种中，已在世界各地广泛推广种植。前人研究表明，十倍体长穗偃麦草的衍生后代小偃68和小偃7430对小麦秆锈病表现为近免疫。郑琪等认为十倍体长穗偃麦草中可能携带多个抗秆锈病基因，同一抗病基因的剂量效应或者不同抗病基因的加性效应可能使得十倍体品系对秆锈病表现出高抗的特性。鲍印广等的研究发现位于2A染色体的PmSn0224可能是不同于该染色体上其他抗白粉病基因的一个源于长穗偃麦草的新的抗白粉基因。赵兰飞等构建了第一张长穗偃麦草7E染色体的精细遗传图谱，同时对长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7(Fhblop)进行了精细定位，定位于标记Xcfa2240和XsdauK66之间的1.7cM范围内，为小麦赤霉病抗性改良和抗病机制研究提供新的策略。

土壤盐碱化是导致农作物产量大幅降低的重要因素之一，世界上19.5％的耕地都被土壤盐碱化严重影响，因此从小麦的近缘物种中将耐盐基因导入到小麦中，进而解决小麦的耐盐性问题。许多研究者也已通过杂交育种或转基因技术得到了耐盐植株。二倍体长穗偃麦草的2E和5E染色体上具有耐盐的主效基因，而十倍体长穗偃麦草作为耐盐碱的重要小麦近缘种属，也需要得到充分的重视和利用。目前，十倍体长穗偃麦草染色体组成虽无定论，但科研工作者们的染色体组成争议主要集中在十倍体长穗偃麦草染色体中是否含有St组染色体，以及该St组染色体是否被重组。因为着丝粒区域的环境对基因表达十分不利，所以在着丝粒区域的基因在进化中与常染色质区域有着不同的分子进化机制，也就是不同部位的协同进化。在异源多倍体植物形成和进化的过程中，必然会伴随着“基因组冲击”，会在基因组水平和表观遗传方面发生很多变异，这也就意味着十倍体长穗偃麦草在形成和进化过程中，St染色体组已发生了进化或重组，也可认为St和J形成了一个新的染色体组JSt染色体组。

利用远缘杂交、染色体工程等多种手段将十倍体长穗偃麦草中的多种类型优良基因导入到普通小麦中，创制携带十倍体长穗偃麦草优异性状的小麦新种质，丰富小麦育种的遗传基础，挖掘抗病资源，创制丰富的种质材料，是进行小麦遗传改良的有效途径和重要方向。在十倍体长穗偃麦草遗传物质向普通小麦转移的过程中，十倍体长穗偃麦草遗传物质的准确鉴定与追踪已成为本领域亟待研究的重要工作。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物、使用方法及其应用，主要目的是筛选引物，准确鉴定十倍体长穗偃麦草。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物，所述分子特异性标记引物包括42个SSR引物对和114个EST-STS引物对；

所述SSR引物对的名称分别为：Xwmc166、Xcfd0156、Xgwm314、Xgwm271、Xcft3374、Xcfd190、Xcfd219、Xcfd31、Xcfd39、Xcfd71、Xcwm532、Xcfd156、Xgdm0136、Xgpw5195、Xgpw7244、Xgwm518、Xgpw5195-1B、Xwmc522、Xwmc533、Xwmc85-1B、Xwmc631、Xwmc702、Xwmc817、Xwmc93、Xgwm264-1B、Xwmc471、Xwmc473、Xgwm0249、Xgwm0265、Xwmc734、Xwmc397、Xgpw4095、Xgpw5237、Xmag1932、Xmag1809、Xmag834、Xmag3056、Xmag1441、Xmag3137、Xmag3284、Xmag1682及Xmag3318；

所述EST-STS引物对的名称分别为：CJ569451、BE498572、BE426274、BF291740、BE406901、BE497107、CD490579、BG262410、BM134486、BE425354、BE443071、BE637935、BE490643、BE471127、BE403153、BF293581、BF201704、BE403214、BE426257、BE352611、BE497177、BE499900、BE445925、BE403867、BF291549、BF473049、BG607666、BQ166400、SWES231、CD453617、CD373543、CD373500、CD452643、CD491981、CD452846、BF484028、BF474569、BF429122、BE590695、BE490237、BE407068、BE499071、BG264080、BQ171235、BQ159493、BQ167013、CD452736、BQ159475、CD454353、CD454198、BF485285、BF484133、BE499843、BE404437、BE398399、BE423141、CD373513、CD454706、BM135247、BE443103、BG604819、BE406996、BE499327、BE406901、BF291787、BE443796、BE497584、BE495292、BQ162235、BE404332、BQ169707、BQ160526、CD490485、CD373475、BF473348、CD454575、BQ169491、BF291730、BM137713、CD452844、BE637806、CD453612、BE606250、BF429203、CD454173、BE446061、BE404973、CD373484、BE444811、BE591142、BE444644、BG604865、CD491981、BF482781、BF482530、BE591737、BE637663、BG274576、BE591127、BQ168298、BG606097、BE495150、BF291549、BE405518、BE495786、BG262410、BE405749、BE518255、BE443691、BF202706、BF485078、BE490599、BE606392及BE638039。

另一方面，本发明实施例提供了上述十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物在鉴定十倍体长穗偃麦草中的应用。

又一方面，本发明实施例提供了上述的十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物的使用方法，包括以下步骤：

(1)采用CTAB方法提取待鉴定叶片全基因组DNA作为PCR扩增模板；

(2)以权利要求1所述的42个SSR引物对和114个EST-STS引物对中的任意一个引物对作为所述PCR的扩增引物，在S1000型热循环仪上进行PCR反应，获得扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示出清晰条带的鉴定为十倍体长穗偃麦草DNA。

作为优选，所述PCR扩增体系为10μL，具体如下：

作为优选，所述PCR的扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；

72℃终延伸10min，12℃保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用基因数据库信息，通过筛选、设计、合成、以及PCR扩增验证，筛选出42个SSR分子特异性引物对和114个EST分子特异性引物对；上述标记均可在十倍体长穗偃麦草中扩增出特异的条带；本发明提供的上述156个特异性引物对在普通小麦、普通小麦与近缘物种十倍体长穗偃麦草的衍生后代材料间具有显著差异；为十倍体长穗偃麦草分子标记辅助育种工作提供理论依据，可快速有效追踪十倍体长穗偃麦草的遗传物质，同时也有利于将十倍体长穗偃麦草的优良基因和优良性状向受体普通小麦品种转移，加快了育种进程，提高了新品种的选育效率。

附图说明

图1是本发明实施例2提供的利用BE406996扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

(1.中国春；2.7182；3.长穗偃麦草；4.中间偃麦草；5.拟鹅观草；6.华山新麦草；7.滨麦；8.黑麦。)

图2是本发明实施例2提供的利用BE499071扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图3是本发明实施例2提供的利用BF485078扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图4是本发明实施例2提供的利用CD452846扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图5是本发明实施例2提供的利用BE490237扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图6是本发明实施例2提供的利用BE426257扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图7是本发明实施例2提供的利用BE638039扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图8是本发明实施例2提供的利用Xmag1932扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；

图9是本发明实施例2提供的利用Xmag834扩增的目的产物的凝胶电泳图谱。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

缩略语和关键术语定义：

SSR：SSR又被称作微卫星，是由2-6个核苷酸为基本单元组成的简单重复序列，在真核生物的基因组中广泛存在；此种标记对DNA质量要求中等、多态性高、易用PCR检测、实验周期短、重复性好、不使用放射性同位素等优点，已广泛应用于遗传学及鉴定外源物质的研究上。

EST：EST即表达序列标签，指从一个随机选择的cDNA克隆，进行5'端和3'端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA部分序列；EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记(如AFLP、RAPD、SSR等)相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息时特别有用。

STS：STS标记即序列标签位点，是一种基于特异PCR扩增原理的标记，被定位于染色体的特定位置上；STS标记根据RFLP标记的末端插入序列来设计引物进而转化而成。STS标记具有可靠性高、快速、经济、不使用放射性同位素、实验周期短等特点。该技术目前已广泛的应用于外源遗传物质的鉴定和追踪。

实施例1

利用序列数据库查找比对十倍体长穗偃麦草和小麦低同源序列，遵循引物设计原则，利用Primer5.0设计EST引物和SSR引物，结合小麦近缘物种进行验证，得到的特异标记总计156个，其中SSR标记42个，EST-STS标记114个，上述特异性引物的筛选验证工作是由本发明独立完成，上述156对特异引物在染色体的位置和核苷酸序列如表1所示。

表1.十倍体长穗偃麦草156对特异性引物生物信息

注：1-42为SSR分子标记，43-156为EST-STS分子标记；本领域技术人员可根据上述引物对名称从PCR引物网站(http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)或者URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)中获取上述156对引物的详细信息，如染色体位置和核苷酸序列。

实施例2

(1)DNA提取用CTAB方法(稍作修改，Saghai-maroof et al.1984)提取植株全基因组DNA，分别获得8种待鉴定样品DNA；具体提取过程如下：

A将2颗灭菌的钢珠放入2mL灭菌的离心管中，剪取适量幼嫩叶片放入离心管中，随后液氮冷冻10min；

B取出离心管，放在高通量组织研磨仪上震荡2min，直至叶片呈粉末状；

C加入60℃预热的CTAB微量提取液1000μL，混匀，再加入400ul三氯甲烷，颠倒、混匀，吸出钢珠，60℃水浴10min，取出离心管并冰浴10min；

D 10000rpm离心5min,吸取700μL上清液到1.5mL的离心管中，加入相同体积的异丙醇，缓慢颠倒数次，静置10min；

E 10000rpm离心5min，倒掉上清液，加入200μL的70％乙醇冲洗，离心，倒去酒精，重复3次；

F.放在超净工作台中，风干12h，加入500μL1×TE(100mMTris-Hcl，10mM EDTA，PH＝8.0)溶解。

G.DNA充分溶解后，加入1.8μLRnaseA(10mg·u^-1)，混匀，37℃水浴30min。

H.加入500μL苯酚/氯仿/戊乙醇(25:24:1)，混匀，8000rpm，4℃离心10min。

I.吸取上清液转移至另一灭菌的离心管中，加入50μLNaOAc(3mol·L^-1PH＝5.2)，混匀，再加入1mL的无水乙醇(-20℃)，混匀，沉淀后离心，倒掉上清液。

J.用-20℃预冷的70％乙醇冲洗2～3次，放到超净工作台风干12h，加入100μL 1×TE溶解备用。

(2)EST、SSR引物选取利用数据库信息，设计、最后筛选得到了156对分子特异性引物(引物对的序列如实施例1所示)，包括42对SSR引物和114对EST-STS引物，上述特异性引物由北京奥科鼎盛公司合成；

(3)利用表1中的每一对特异引物分别对8种待鉴定物种分别进行PCR扩增，每一种特异引物经过扩增后获得8种目的产物；

上述PCR扩增过程具体如下：

在S1000型热循环仪(Bio-Rad美国)上进行PCR扩增反应。

扩增体系为10μL：

扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45sec，

60℃退火45sec，

72℃延伸2min，

循环35次；

72℃延伸10min；

12℃保存。

(4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

A制胶、电泳：用无水乙醇将玻璃板擦干净、晾干，利用夹子固定玻璃板，将40ml聚丙烯酰胺胶母液(Acr:Bis＝37.5:1，w/w)、400μL 10％的过硫酸铵、40μL TEMED混匀，倒入玻璃板中，插入梳子，静置，凝固后拔下梳子，冲洗样孔，放入电泳槽中。在PCR扩增产物中加入2μL 5×Loading dye buffer，混匀，依次向点样孔中加样5μL，在160V恒压下电泳2.5-3.0h；

B银染、显影：电泳结束将聚丙烯酰胺凝胶放入0.1％的硝酸银溶液中，摇床轻摇5min，放入蒸馏水中漂洗30s，之后放入显影液(1.5％氢氧化钠、0.4％甲醛)中，摇床震荡，直至显出清晰的条带，记录，拍照。

每一组特异引物获得一张电泳图(每张电泳图上显示8个待鉴定物种，如普通小麦7182、中国春、十倍体长穗偃麦草、中间偃麦草、拟鹅观草、华山新麦草、滨麦及.黑麦)，在获得的156张凝胶电泳图谱上，十倍体长穗偃麦草均出现特异性亮带(不同bp片段)，该结果验证了本申请设计的156对特异引物可以用以鉴定十倍体长穗偃麦草。由于实验附图具有156张，数量太多，无法一一展示，仅挑选亮带最明显或特异性较高的电泳图作为本实施例2的实验过程图，具体如图1-图9所示，从图中可以看出，至少在十倍体长穗偃麦草泳道出现了较亮或DNA分子较多的亮带，其可充分证明本实施例2设计的156个引物对具有较高的特异性。本发明利用基因数据库信息，从PCR引物网站(http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml)或者URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)筛选出可见用于鉴定十倍体长穗偃麦草的42个SSR分子特异性标记引物对和114个EST-STS分子特异性标记引物对，上述标记均可在十倍体长穗偃麦草中扩增出特异的条带，本发明的提供的上述156个特异性引物对在十倍体长穗偃麦草、普通小麦及中国春等间有显著差异。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物，其特征在于，所述分子特异性标记引物包括42个SSR引物对和114个EST-STS引物对；

2.权利要求1所述的十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物在鉴定十倍体长穗偃麦草中的应用。

3.权利要求1所述的十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)采用CTAB方法提取待鉴定叶片全基因组DNA作为PCR扩增模板；

4.如权利要求3所述的十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物的使用方法，其特征在于，

所述PCR扩增体系为10μL，具体如下：

5.如权利要求3所述的十倍体长穗偃麦草分子特异性标记引物的使用方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；

72℃终延伸10min，12℃保存。