JP2019146580A - 官能化直鎖ｄｎａカセットの製造および植物における量子ドット／ナノ粒子媒介送達 - Google Patents

官能化直鎖ｄｎａカセットの製造および植物における量子ドット／ナノ粒子媒介送達 Download PDF

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Abstract

【課題】無傷の細胞壁を有する植物細胞に官能化直鎖核酸カセット分子を非侵襲的に送達するためのナノ粒子を用いた方法の提供。【解決手段】細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程；細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程；ならびに細胞壁を含む前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。【選択図】なし

Description

優先権の主張
本出願は、2010年7月7日に出願された「官能化（finctionalized）直鎖DNAカセットの
生産及び植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達」についての米国仮特許出願シリア
ル番号61/362,222の出願日の利益を主張する。
技術分野
本発明は、無傷の細胞壁を有する植物細胞に官能化直鎖核酸カセット分子を非侵襲的に
送達するナノ粒子を用いた方法に関する。
ナノ粒子は、特定の動物細胞にDNAを送達するために利用されている独特の性質を有す
る。特定のDNA被覆ナノ粒子が細胞壁を有していない細胞とインキュベートされた場合、
細胞はナノ粒子を取り込み、DNAにコードされた遺伝子を発現し始めることが見出されて
いる。3-5 nmのサイズ範囲内の半導体ナノ粒子（例えば、量子ドット（「QD」））はまた
、細胞内に分子を送達するための担体として使用されてきた。DNAおよびタンパク質は、Q
D表面に付着した特定のリガンドに結合させることができる。例えば、Patolsky, et al.
(2003) J. Am. Chem. Soc. 125:13918参照のこと。カルボン酸またはアミン被覆された量
子ドットは、チオール基を含む分子に架橋することができ（例えば、Dubertret et al. (
2002) Science 298:1759; Akerman, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:
12617; Mitchell, et al. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:8122を参照）、または標準的
なバイオコンジュゲーションプロトコルを用いて、N-ヒドロキシスクシニミル（N-hydrox
ysuccinimyl）（「NHS」）のエステル基を含む分子に架橋することができる。例えば、Pi
naud, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Bruchez, et al. (1998) Science 2
81:2013を参照のこと。量子ドットの表面に分子を付着するための代替的な方法は、ビオ
チン化タンパク質、オリゴヌクレオチド、または抗体へのストレプトアビジン被覆量子ド
ットの結合を介して行われる。例えば、Dahan, et al. (2003) Science 302:442; Pinaud
, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Wu, et al. (2003) Nature Biotechnol.
21:41; Jaiswal, et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:47; and Mansson, et al. (20
04) Biochem. Biophys. Res. Commun. 314:529を参照のこと。
植物への外来核酸分子の送達は、植物の細胞壁の存在のために困難なものとなっている
。現在の方法は、植物の形質転換のための侵襲的な送達に依存している。植物細胞では、
細胞壁は、外因的に適用される分子の送達に対する障壁となっている。多くの侵襲的な細
胞送達方法、例えば、微粒子銃送達（遺伝子銃）、マイクロインジェクション、エレクト
ロポレーション、およびアグロバクテリウム媒介形質転換は、細胞壁に囲まれた植物細胞
への遺伝子および小分子の送達を達成するために採用されているが、タンパク質の送達は
、マイクロインジェクションすることによってのみ達成されている。植物細胞への核酸分
子のナノ粒子送達が所望される場合には、細胞壁は、植物のプロトプラストに粒子を添加
する前に取り除かれる。例えば、Torney, et al. (2007) Nature Nanotechnol. 2:295300
を参照のこと。
さらに、アグロバクテリウム媒介形質転換のような従来の植物形質転換技術は、組換え
プラスミドの使用を必要とする。そのため、これらの従来技術は、付着された外来遺伝子
と共に、望ましくはないが、宿主ゲノムへ細菌ベクターバックボーン配列を組み込むとい
う結果となる。例えば、Kohli et al. (1999) Plant J. 17:591601; およびMeza et al.
(2002) Nucleic Acids Res. 30(20):455666を参照のこと。移植片におけるベクターバッ
クボーン配列の存在は、微粒子銃転移手順において全く無駄である。さらに、ベクターバ
ックボーン配列は、二次構造を形成する際の組換えホットスポットなどのATリッチな配列
を提供することで、非正統的組換えを促進する傾向がある。Muller et al. (1999) J. Mo
l. Biol. 291:2946。ベクターバックボーン配列は、さらに隣接する植物ゲノムDNAに相同
な新しい長さの「フィラー」DNAを生成し得、これは環境に逃げ得る。Kohli et al. (199
8) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:72038; Pawlowski and Somers (2000) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 95:1210610; Svitashev etal. (2002) Plant J. 32:43345。
粒子衝突（particle bombardment）を用いて導入遺伝子カセットでの形質転換は、組織
培養において、ならびに稲（イネ）およびポテト（ジャガイモ）において成功したに限ら
れている。Fu etal. (2000) Transgenic Res. 9:119; Loc et al. (2002) Mol. Breeding
9:23144; Romano et al. (2003) Transgenic Res. 12:46173; and Agrawal et al. (200
5) Mol. Breeding 16:24760。これらの微粒子銃技術は、単純な統合パターンを有するト
ランスジェニックイネおよびポテトの大きな割合を生成することが示唆されている。ベク
ターバックボーン配列を欠いている直鎖遺伝子構築物の2つのグループ（GUSおよびbar、
ならびに1Ax1およびbar）が、エリート小麦（Triticum aestivum L.）の品種EM12に粒子
衝撃により独立して導入され、低コピー数の導入遺伝子の組み込みを伴う遺伝的に安定し
たトランスジェニック植物が回収された。Yao et al. (2006) J. Exp. Botany 57(14):37
3746。微粒子銃衝撃による形質転換頻度は0.2〜0.6の間であることが観察された。前出。
3つの可能な要素（すなわち、導入遺伝子の統合の前に鎖状体化する（concatemerization
）量を減らすこと、導入遺伝子再配列の発生を制限すること、および統合イベント時に異
なる導入遺伝子間の相同な相互作用を防止すること）が簡単なハイブリダイゼーションパ
ターンで表される単純な無傷ジェニック座を生成するために一緒に作動することが示唆さ
れている。Agrawal et al. (2005), supra。前掲。
粒子衝突およびWhiskers（商標）（米国特許番号5464765および5302523を参照のこと）
は、制限酵素で消化されたDNA断片とともに、この時点で無傷の細胞壁を有する植物細胞
に直鎖DNAカセットを送達する唯一の経路である。
細胞壁を有する植物細胞に対象とする（of interest）分子を導入するための、ナノ粒
子および直鎖化核酸分子の使用のための方法および組成物が、本明細書中に記載される。
本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定的に形質転換された遺伝的に改変された繁殖
力のある植物を生産するために使用し得る。いくつかの実施形態では、官能化直鎖核酸カ
セット分子の特徴的な性質により、望ましくない核酸配列（例えば、限定はしないが、ベ
クターバックボーン配列）無しに、対象とする特定の遺伝子配列を送達することが可能に
なる。
実施形態では、いくつかの異なるタイプのナノ粒子が、細胞壁を有する植物細胞を形質
転換するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、官能化直鎖核酸カ
セット分子でPEG化され得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、量子ドットのような半
導体ナノ粒子（「QD」）または金ナノ粒子であり得る。他の実施形態では、官能化直鎖核
酸カセット分子は、直鎖状プラスミドDNAであり得る。代替的な実施形態では、官能化直
鎖核酸カセット分子は、ホスフィノトリシン-N-アセチルトランスフェラーゼ（PAT）およ
び/または黄色蛍光タンパク質（YFP）をコードする配列を含んでもよい。
また、細胞壁を有する植物細胞に対象とする分子を導入するための方法が開示され、こ
こで、この方法は、細胞壁を有する植物細胞に提供する工程；少なくとも1種類の対象と
する官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子の表面を被覆する工程；細胞壁を有する植物
細胞および対象とする官能化直鎖核酸カセット分子（群）で被覆されたナノ粒子を、互い
に接触して配置する工程；およびナノ粒子および官能化直鎖核酸カセット分子（群）の細
胞壁を含む植物細胞への取り込みを可能にする工程を含み得る。特定の実施形態では、対
象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、対象とする遺伝子を含む、ビオチン化された直
鎖化した二本鎖DNA分子であり得る。さらなる実施形態では、対象とする官能化直鎖核酸
カセット分子は、対象とする遺伝子を含む、化学的に改変されていない二本鎖DNA分子で
あり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、量子ドットストレプトアビジンナノ粒子で
あり得る。官能化直鎖核酸カセット分子は、異なる官能基を利用して様々な試薬を用いて
ナノ粒子に結合させてもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質および
/または他の分子、例えば、互換性のある官能基（functional groups）を有する殺虫剤で
表面を官能化されて(functionalized)いてもよい。いくつかの実施形態では、複数のタイ
プの分子がナノ粒子の表面に結合されていてもよい。したがって、特定の実施形態では、
細胞透過性の農薬および直鎖化された核酸カセット分子が、例えば、生体分子の標的送達
を容易にするために、ナノ粒子の表面に同時に官能化され得る。
さらに、植物へ形質を移入するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、本
方法は、植物細胞を提供する工程；植物における形質を発現させるための手段によりナノ
粒子の表面を被覆する工程；植物細胞、および植物内で形質を発現させるための手段で被
覆されたナノ粒子を互いに接触して配置する工程；ナノ粒子、および植物内で形質を発現
させるための手段を植物細胞へ取り込ませて、形質転換植物細胞を産生する工程；形質転
換植物細胞から植物全体を再生する工程;ならびに植物を繁殖させる工程を含み得る。い
くつかの実施形態では、本発明の方法に従って移入し得る形質は、雄性不稔、除草剤耐性
、害虫抵抗性、および細菌性病害、真菌症、および/またはウイルス性病害に対する抵抗
性：から選択された形質を含むが、これらに限定されない。
また、植物の植物体への（in planta）変換のために使用され得る本発明の方法が開示
される。いくつかの実施形態では、植物は、シロイヌナズナ属の植物、例えば、シロイヌ
ナズナから選択し得る。特定の実施形態では、植物体への形質転換により形質転換された
植物は、コロンビア生態型のシロイヌナズナ植物から選択し得る。
さらに、遺伝的に改変された（GM）植物細胞およびそれらを生成するための方法が開示
され、ここで、その植物細胞は、本発明の方法を介して導入され1つ以上の核酸を有する
。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの対象とする遺伝子及び選択マーカーを含む
プラスミドが、本発明に係るナノ粒子を介して、細胞壁を有する植物細胞に導入され得る
。さらなる実施形態では、少なくとも1つの対象とする遺伝子および/または選択マーカー
を安定的に組み込んだ安定した形質転換体が選択され得る。代替的な実施形態では、少な
くとも1つの対象とする遺伝子を含む植物細胞が、対象とする分子を含む他の細胞を生成
するために増殖され得る。他の実施形態では、対象とする分子を含む植物細胞は、対象と
する分子を含む植物全体を再生するために使用し得る再生可能な細胞であり得る。
さらに組織培養で使用するために対象とする分子を含む再生可能な植物細胞を生成する
方法が開示される。組織培養は、再生可能な細胞と実質的に同一の遺伝子型を有する植物
を再生し得る。そのような組織培養における再生可能な細胞は、例えば、胚、プロトプラ
スト、分裂細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根の先端、花、種子、ポッド、または茎で
あり得る。さらに、いくつかの実施形態は、本発明の組織培養物から再生した植物を提供
する。
さらに、所望の形質または対象とする核酸分子を含む安定化した植物系統を生成するた
めの方法が開示され、ここで、所望の形質または対象とする核酸分子は、植物の細胞壁を
横切ったナノ粒子の取り込みにより最初に導入され得る。安定化した植物系統を生成する
方法は、当業者に周知であり、自殖、戻し交配、ハイブリッド生産、集団への交配（cros
ses to populations）などの技術が含まれ得るが、これらに限定されない。したがって、
細胞壁を横切ってナノ粒子の取り込みにより植物細胞（またはその先祖）に最初に導入さ
れた、所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物および植物細胞がまた、開示され
る。細胞壁を横切るナノ粒子の取り込みによって植物またはセル（またはその先祖）に最
初に導入された、所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物細胞は、第一世代（F1
）のハイブリッド細胞、種子、および/または所望の特性を有する植物を生産するために
、他の、異なる、植物細胞との交雑で使用し得る。
上述の例示的態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態が、以下の説
明を参照することにより明らかになる。
図１は、非直鎖プラスミドpDAB3831の図を含む。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図２は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。 図３は、デンドリマー形質転換シロイヌナズナゲノム由来のホスフィノトリシンNアセチルトランスフェラーゼ（PAT）DNA配列とNCBIデータベースからのPAT配列との間の配列のアラインメントを含む。 図４は、形質転換シロイヌナズナゲノム由来の黄色蛍光タンパク質（YFP）DNA配列とNCBIデータベースからのYFPの配列との間の配列アラインメントを含む。
配列表
配列番号：1は、プラスミドpDAB3831から4.6 kbpの完全な発現カセットを増幅するため
に使用されるフォワードプライマー配列：
/5Biosq/TGAAAGTGTACATCAACGAA
を示す。
配列番号2は、プラスミドpDAB3831から4.6 kbpの完全な発現カセットを増幅するために
使用されるリバースプライマー配列：
/5Biosq/CCGCAACTATTTCAACAC
を示す。
配列番号：3は、YFP遺伝子を増幅するために使用したフォワードプライマー配列：TGTT
CCACGGCAAGATCCCCTACGを示す。
配列番号：4は、YFP遺伝子を増幅するために使用されるリバースプライマー配列：TATT
CATCTGGGTGTGATCGGCCAを示す。
配列番号：5は、PAT遺伝子を増幅するために使用したフォワードプライマー配列：GGAG
AGGAGACCAGTTGAGATTAGを示す。
配列番号：6は、PAT遺伝子を増幅するために使用されるリバースプライマー配列：AGAT
CTGGGTAACTGGCCTAACTGを示す。
I. いくつかの実施形態の概要
非侵襲的な遺伝子導入を可能にする本発明の方法は、望ましい形質を有する遺伝子組み
換え植物を生成するために非常に役立ち得る。非侵襲的な遺伝子導入は、このような栽培
植物に、望ましいインプット、アウトプット、および農業的形質を組み込むなどの分野の
ために、細胞内の分子部位を特異的に標的化し、編集することを容易にし得る。記載され
ている方法はまた、現在技術が制限されている、植物の一過性形質転換、木もしくは野菜
作物に形質移入し、病害抵抗性を付与するための技術の拡大のための非GMOの選択肢とし
て有用であり得る。
最近の特許出願（米国特許出願第60/978,059）は、種々のナノ粒子の有効荷重（nanopa
rticle-pay-loads）を使用して、とりわけ、環状プラスミドDNAを送達する、ナノ粒子に
基づくDNA送達の非侵襲的な手段を示し、シロイヌナズナ植物のT1種子における導入遺伝
子の安定的な組み込み明確に示す。そこで作製された環状プラスミドDNAを含有するトラ
ンスジェニック植物は、所望の除草剤耐性の表現型を示し、少なくとも4回同時にグルホ
シネートアンモニウムの電磁界レベルを噴霧した場合、高いレベルの耐性を示した。米国
特許出願第60/978,059は、とりわけ、環状プラスミドDNAを用いて正に帯電した金ナノ粒
子によるシロイヌナズナの形質転換を実証した。本研究は、とりわけ、植物の安定した遺
伝的形質転換のための官能化直鎖核酸カセット分子の使用について記載する。
米国特許出願第60/978,059は、とりわけ、正に帯電したナノ粒子媒介プラスミドDNA送
達を記載した。しかし、直鎖プラスミドベースの送達を使用して導入遺伝子の安定したゲ
ノムへの組み込みを実証したことは、現在までに報告されていない。本開示は、植物にお
ける安定した形質転換のためのナノ粒子媒介官能化直鎖核酸カセット分子の使用について
記載する。分子解析は、本発明の方法によってpat遺伝子およびyfp遺伝子で形質転換され
たトランスジェニックT1シロイヌナズナ植物において、YFPと共にPATの発現を示した。T1
トランスジェニック植物は繁殖力があり、種子を産生する。これらの種子を増殖させても
よいし、分離分析は、分子およびタンパク質の分析とともに行うことができる。
植物における単純なDNA組み込みイベントの生成を可能にする方法が開示され、それに
よってその後の遺伝子移入の努力を効率化する。官能化直鎖核酸カセット分子の使用は、
例えば、プラスミドに比べて遺伝子形質転換での利点を提供する。例えば、官能化直鎖核
酸カセット分子は、ベクターバックボーン配列または選択マーカー遺伝子を含んでいなく
てもよい。II. 条件
以下説明およびの表では、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲
を含む明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が
提供される：
戻し交配：本明細書で使用される「戻し交配」という用語は、栽培者がハイブリッド後
代を両親のいずれかと（例えば、F1ハイブリッドの第一世代をF1ハイブリッドの親の遺伝
子型のいずれかと）繰り返し交配させるプロセスであり得る。
胚：本明細書で使用される「胚」という用語は、成熟した種子の中に含まれている小さ
な植物を指すことがある。
ナノ粒子：本明細書で使用される用語「ナノ粒子」は、少なくとも1つのナノスケール
次元、例えば、100nm未満の微細な粒子を指すことがある。本発明での使用に適したナノ
粒子は、1nm〜0.84(mの大きさを有し得る。ナノ粒子の一つのクラスは、「量子ドット」
（QD）である。量子ドットは、1nm - 10 nm、例えば、2〜4 nmのメジアン径を有し得る。
ナノ粒子の他の種類には、金ナノ粒子、金被覆されたナノ粒子、多孔性ナノ粒子、メソ多
孔性ナノ粒子、シリカのナノ粒子、ポリマーナノ粒子（例えば、デンドリマー）、タング
ステンのナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア（nanocores）、ナノスフ
ェア、ナノロッド、磁気ナノ粒子、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに
限定されない。
利用可能なナノ粒子の中でも、発光半導体ナノ結晶（量子ドット）は、生体イメージン
グおよびセンシングにおける多くの実証された適用例を提供する。それらの有用性は、大
きなタンパク質のそれに匹敵する独特の光物理的特性およびサイズの組み合わせに由来す
る。親水性CdSeのZnS量子ドットの流体力学半径は、5nm（分子リガンドと交換したナノキ
ャップの場合）からブロック共重合体内にカプセル化されたナノ結晶の20nmまで様々であ
る。単一の量子ドットは、強化された結合活性を有する多官能化量子ドットバイオコンジ
ュゲートを提供するために、いくつかの生体分子（例えば、抗体、ペプチド、および核酸
分子）に結合させることができる。さらに、それらの化学および光分解に対する強い抵抗
性は、特定の生物学的プロセスの長期の蛍光モニタリングを潜在的に可能にし得る。Nie
およびEmory（1997）Science 275:1102-6。金属親和性自己組織化およびビオチンアビジ
ン結合に基づく複数の非共有結合方式により、更なる精製を必要とせずに同じ複合体内に
同時に適用し得、細胞内環境でさえ安定している多機能量子ドットバイオコンジュゲート
が提供される。Yezhelyevら、(2008) J. Am. Chem. Soc. 130(28):900612。平均10個のYF
PおよびQDあたり名目上50の細胞透過性ペプチド（CPP）を利用することによって、少なく
とも300 kDaの分子量および150オングストロームの空間的な広がりを有するタンパク質荷
物（cargo）の細胞内送達を達成し得る。前掲。QD-b-PEコンジュゲートの送達される荷物
は、より大きな範囲のサイズおよび分子量を有し（例えば、コンジュゲートあたり平均2.
5ストレプトアビジン-b-PE）、送達されるアセンブリは、潜在的に103 kDaを超える分子
量および500オングストロームに近い全体寸法を有する。高いb-PE価を有するコンジュゲ
ートが使用された場合、分子量およびサイズは大幅に増加し得る。
核酸分子：センスおよびアンチセンス鎖の両方のRNA、cDNA、ゲノムDNA、人工染色体（
ACE）、ならびに上記の合成フォームおよび混合ポリマーを含むことができるポリマー形
態のヌクレオチド。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ま
たはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態を指す。本明細書で使用される「
核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。特に指定のない限り
、核酸分子は、通常、長さが少なくとも10塩基である。この用語は、DNAの一本鎖および
二本鎖形態を含む。核酸分子は含めるかまたは天然に存在するヌクレオチド、ならびに天
然および/または非天然のヌクレオチド結合によって互いに結合された改変ヌクレオチド
の両方を含み得る。
作動可能に連結された：第1の核酸配列は、第二の核酸配列と機能的な関係にあるとき
、第1の核酸配列は、第二の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーター
がコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターがコード配列に作動
可能に連結されている。組換えにより産生された場合、同じリーディングフレーム内で2
つのタンパク質コード領域を結合するために必要ならば、作動可能に連結された核酸配列
は連続していてもよい。しかし、核酸は、作動可能に連結されるために連続している必要
はない。
PEG化：本明細書で使用される用語「PEG化」は、ナノ粒子の表面が生体適合性の改善の
ためにポリエチレングリコール（PEG）で修飾されているナノ粒子（例えば、金ナノ粒子
、及び量子ドット）を指すことがある。PEG化ナノ粒子は、特定の細胞および組織への強
化された送達効率のために、様々なターゲティングリガンド（例えば、ペプチド及び抗体
）でさらに被覆されていてもよい。PEGは、例えば、立体安定化効果を介してタンパク質
の非特異的吸着を低減することによってその被覆されたナノ粒子の血液循環時間を延長す
るために、様々な薬物、リポソーム、および高分子ミセルを有するナノ粒子に結合されて
きた。
量子ドット：本明細書で使用される用語「量子ドット」（QD）（時々、ナノクリスタル
としても知られる）は、3つの空間方向のすべてにおいて、伝導帯の電子、価電子帯の正
孔、または励起子（伝導帯の電子および価電子帯の正孔の結合されたペア）の動きを閉じ
込める半導体ナノ構造を指すことがある。閉じ込めは、例えば、静電ポテンシャル（外部
電極、ドーピング、歪み、不純物などによって生成される）、異なる半導体材料との間の
インタフェースの存在（例えば、コアシェルナノシステムにおける）、半導体表面（例え
ば、半導体ナノ結晶）の存在、またはそれらの組み合わせが原因である可能性がある。量
子ドットは、量子化された離散的なエネルギースペクトルを有し得る。対応する波動関数
は、量子ドット内に空間的に局在化し得るが、結晶格子の多くの周期にわたって延びてい
てもよい。量子ドットは、小さな有限な数（例えば、1〜100のオーダー）の伝導帯電子、
価電子帯ホール、または励起子（すなわち、有限の数の電気素量）を含む。
量子ドットは、II-VI、III-VI、またはIV-V物質の周期群で構成された結晶であり得る
半導体材料の特別なクラスである。それらの大きさは、例えば、直径2-10ナノメートル（
10-50原子）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、量子ドットは、セレン化カド
ミウム硫化亜鉛コア・シェル（CdSe/ZnS）製であり得、バルク物質のものから性質的に発
散した有用な範囲の電気的および光学的特性を有していてもよい。その高い量子収率、高
いモル吸光係数、および退色に対する高い耐性のために、量子ドットナノ粒子は、インビ
ボおよびインビトロでの造影剤として研究されている。
グリホサートに対する耐性：グリホサートの投与に対する耐性は、グリホサートのその
用量で生き残る植物の能力（すなわち、植物は殺され得ない）を指す。場合により、耐性
植物は、一時的に黄色、またはそうでなければ、いくつかのグリホサート誘発傷害（例え
ば、過剰な分げつおよび/または増殖阻害）を示すが、回復し得る。
安定化：本明細書で使用される用語「安定化」は、同じ種類の近交系植物の第1世代か
ら次の世代に再現性をもって受け継がれる植物の特性を指すことがある。
導入遺伝子：本明細書で使用される用語「導入遺伝子」は、外因性核酸配列を指す場合
がある。一例では、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）；工業的
又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子;または望ましい農業形質をコードする遺
伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列であり、ここでそ
のアンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入
遺伝子（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された調節配列を含み得る。いくつか
の実施形態では、ナノ粒子媒介形質転換により導入される対象とする官能化直鎖核酸カセ
ット分子は、導入遺伝子を含む。しかし、他の実施形態では、対象とする官能化直鎖核酸
カセット分子は、内因性核酸配列（但し内因性核酸配列の追加のゲノムコピーが望まれる
）；または宿主生物における標的核酸分子に対してアンチセンス配向である核酸配列を含
む。
取り込み：本明細書中で使用される「取り込み」という用語は、細胞壁や細胞膜を横切
る、ナノ粒子（例えば、量子ドット、または金ナノ粒子）のような粒子の移動（transloc
ation）を指すことがあり、ここで、移動は、粒子が取り込まれる細胞以外の何かによっ
て粒子に与えられる運動量のみの結果としては発生しない。単に粒子に与えられる運動量
の結果として細胞壁または細胞膜を横切って粒子の移動を起こす装置または方法の非限定
的な例は、微粒子銃、遺伝子銃、マイクロインジェクション、および/またはインペール
フェクション（impalefection）技術である。
III. 植物細胞の安定な形質転換のためのナノ粒子を用いた核酸分子送達
A. 概要
本発明は、例えば、遺伝的形質転換および安定したトランスジェニック植物の開発のた
めの官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子媒介転送を使用して植物を形質転換するため
の新しい方法を記載する。特定の実施形態に係る方法は、他の形質転換法と比較した場合
、トランスジェニック生物の急速な生成だけでなく、所望のゲノム改変のためのいくつか
の可能性もまた提供する。本発明の実施形態は、ナノ粒子媒介直鎖化プラスミドDNAの送
達を介して生成された最初に報告された安定した形質転換植物につながっている。開示さ
れる遺伝子組み換えの方法は、植物の遺伝的形質転換の伝統的な方法から逸脱し、微粒子
銃送達に依存せず、そしてトランスジェニック作物を生成するために非常に役立ち得る。
トランスジェニック植物は、典型的には、アグロバクテリウム媒介または粒子衝撃形質
転換によって生成される。対象とする遺伝子に加えて、トランスジェニック植物は、多く
の場合、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与する、例えば、ベクターバックボーン
配列および選択マーカー遺伝子を必ず含む。選択マーカー遺伝子およびベクターバックボ
ーン配列が、DNA転移手順において余分でありかつ望ましくないので、ベクターフリート
ランスジェニック植物の生成が有利である。いくつかの実施形態の方法により可能となる
ベクターバックボーン配列の除去は、相同組換えの量および組み込みプロセスに対する組
換えエレメントの影響を制限し得る。
本発明の実施形態では、直鎖核酸カセットの非侵襲ナノ粒子媒介送達によるトランスジ
ェニック植物の直接生成が今や、例えば、フローラルディップ法を介して達成され得る。
このような方法は、それがなければ当該分野で利用可能であるものよりも、所望の植物の
変換を行うための簡単な方法を提供し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ベクタ
ーフリーかつマーカーフリーなトランスジェニック植物を生成するために用いることがで
きる。いくつかの実施形態では、形質転換法は、組織培養とは無関係であるので、性的に
植物を再生するためにより便利で実用的であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、非侵襲的に非アグロバクテリウム互換
性植物および/またはそれらの組織培養懸濁細胞を形質転換する能力を提供し得る。この
ような方法は、多大な機会を提供し得る。望ましいインプットおよび農業形質は、同じ形
質転換手順で複数の遺伝子送達が必要とし得る。いくつかの実施形態において、本発明の
方法は、複数の核酸分子の送達を可能にする一方で、もしできるなら煩わしいかもしれな
い対象とする全ての遺伝子を含む大きなプラスミドを構築する必要性を排除する。
B. 核酸分子
特定のタンパク質またはRNA産物（例えば、干渉RNA（「RNAi」））をコードする遺伝子
の単離および特徴付けを可能にした分子生物学的手法の出現により、植物生物学の分野で
科学者たちは、例えば、特定の方法で細胞の形質を変えるために、外来遺伝子、またはネ
イティブもしくは内因性遺伝子の追加または改変されたバージョン（おそらく異なるプロ
モーターによって駆動される）を含めるために、細胞のゲノムを操作することに強い興味
を抱いてきた。このような外来の追加の遺伝子および/または改変された遺伝子は、本明
細書中で「導入遺伝子」と総称される。導入遺伝子は、例えば、対象とするタンパク質を
コードし得、またはRNAiに転写され得る。過去15〜20年間で、トランスジェニック細胞を
産生するためのいくつかの方法が開発されており、特定の実施形態では、本発明は、細胞
の形質転換されたバージョン、および細胞壁を有する植物細胞に1以上の官能化直鎖核酸
カセット分子を、細胞壁を横切るナノ粒子の取り込みを介して導入することによってそれ
らを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は合成直鎖状DNAカセ
ットに含まれていてもよい。
細胞の形質転換は、調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、終結配列
、またはその組み合わせ）の制御下にある、または作動可能に連結されている遺伝子を含
む核酸分子を含み得る。したがって、核酸分子は、1つ以上のこのような機能的に連結さ
れた遺伝子/調節エレメントの組み合わせを含み得る。
実施形態では、対象とする核酸分子は、官能化直鎖核酸カセット分子であり得る。直鎖
核酸カセット分子は、例えば、そこに含まれる発現カセットの切り出しのために、少なく
とも一つの制限エンドヌクレアーゼによる環状プラスミドの消化により、生成され得る。
制限エンドヌクレアーゼは、プラスミドのヌクレオチド配列内の1つまたは複数の認識部
位でプラスミドを切断する。したがって、プラスミドが少なくとも一つの特定の制限エン
ドヌクレアーゼで消化して、1つ以上の特定の直鎖核酸カセット分子の生成を可能にする
ように設計し得る。あるいは、与えられたプラスミドのヌクレオチド配列は、1つ以上の
特定の直鎖核酸カセット分子の生成を可能にする1つ以上の特定の制限エンドヌクレアー
ゼの認識部位を探索し得る。環状プラスミドまたは直鎖核酸分子内の特定の場所で開裂す
る制限部位を選択することにより、得られる直鎖核酸カセット分子が前駆体の核酸分子か
ら１つ以上の配列を欠如するように生成できる。例えば、無関係な（extraneous）核酸配
列（例えば、ベクターバックボーン、選択マーカー（例えば、細菌選択マーカー）、およ
び標的細胞のゲノムDNAと相同である不要な核酸配列）を欠いた直鎖核酸カセット分子が
生成され得る。あるいは、無関係な核酸配列を欠いている直鎖核酸カセット分子を合成し
得る。
直鎖核酸カセット分子は、連続的な熱循環システムを用いて合成し得る。PCT国際公開W
O 2008/045288を参照のこと。連続的サーマルサイクラーは、小さな管を使用するのでは
なく、異なる温度帯を繰り返し通過する一定のまたは連続した流体の流れを使用して、DN
Aを増幅する。PCR反応混合物は、PCR反応混合物が非混和性であるキャリア流体に注入さ
れ、その後キャリア流体は複数の温度ゾーンを通過し、PCR反応混合物内でのDNAの増幅を
促進する。サンプル中に存在する特定のDNA配列は、それが温度帯から周期的に通過する
際に、増幅される。PCR産物ゲルろ過カラムで精製し、その後精製し得る。
核酸分子は、異なる官能基を有する様々な試薬を用いてナノ粒子に結合させ得る。ナノ
粒子への核酸分子の結合体化のための様々な化学反応を表1に示す。
対象とする直鎖核酸カセット分子が１または複数の遺伝子を含む実施形態において、そ
の遺伝子（単数または複数）は優性または劣性対立遺伝子であってもよい。例えば、その
遺伝子（単数または複数）は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌抵抗性の抵抗性、真菌抵
抗性、ウイルス性病害抵抗性、雄の妊性、雄性不稔、栄養価の増大、および産業利用とし
てこのような形質を与えてもよい。これらの形質および他の形質を付与する遺伝子は、当
該技術分野において知られ、任意の遺伝子は、本発明の方法に従って、細胞壁を含む細胞
に導入してもよい。
直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター：マーカー遺伝子
直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクターは、マーカーを含む形質
転換細胞がネガティブ選択（すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖
阻害）、またはポジティブ選択（すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物に
ついてのスクリーニング）のいずれかによって回収されるようにする例えば調節エレメン
トに作動可能に連結された少なくとも１つの遺伝子マーカーを任意に含むことができる。
形質転換のための多数の選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり
、例えば、限定されないが、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的
に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に非感受性であり得る変化した標的を
コードする遺伝子を含む。また、特定のポジティブ選択方法は当該技術分野において知ら
れている。しかしながら、いくつかの実施形態では、直鎖核酸カセット分子は、マーカー
遺伝子を含まない。
ある種の核酸分子を用いた植物の形質転換に適していてもよい１つの選択可能なマーカ
ー遺伝子は、カナマイシンへの抵抗性を付与する、場合により植物調節シグナルの制御下
でネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子である。例えばFral
eyら, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803を参照されたい。使用してもよ
い別の選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。例えば、Vanden Elzenら, (198
5) Plant Mol. Biol., 5: 299を参照されたい。
本発明の方法に用いてもよい追加的な選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のもの、
例えば、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトラン
スフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマ
イシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与するものを含む。Hayfordら, (1988) Plant
Physiol. 86: 1216; Jonesら, (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86; Svabら, (1990) Plant
Mol. Biol. 14: 197; およびHilleら, (1986) Plant Mol. Biol. 7: 171を参照されたい
。他の選択可能なマーカー遺伝子はグリホセート；グルホシネート；またはブロモキシニ
ルなどの除草剤への抵抗性を付与してもよい。Comaiら, (1985) Nature 317:741-744; Go
rdon-Kammら, (1990) Plant Cell 2:603-618; およびStalkerら, (1988) Science 242:41
9-423を参照されたい。
本発明の方法に用いてもよい他の選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のものではな
いものを含む。これらの遺伝子は、例えば、限定されないが、マウスジヒドロ葉酸還元酵
素；植物５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素；および植物アセト乳酸合
成酵素を含む。Eichholtzら, (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67; Shahら, (1986)
Science 233:478; およびCharestら, (1990) Plant Cell Rep. 8:643を参照されたい。
植物の形質転換に適したマーカー遺伝子の他の種類は、抗生物質などの毒性物質への抵
抗性についての形質転換細胞の直接的な遺伝的選択よりも形質転換されたと仮定される植
物細胞のスクリーニングを必要とする場合がある。これらの遺伝子は、特定の組織におけ
る遺伝子発現の空間分布を定量または可視化するために特に有用であり、遺伝子発現の調
査のためにそれらが遺伝子または遺伝子制御配列に融合され得るため、しばしば「レポー
ター遺伝子」と称される。形質転換細胞をスクリーニングするために通常使用される遺伝
子としては、限定されないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）；β−ガラクトシダーゼ
；ルシフェラーゼ；およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられ
る。Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeriら, (1989) EMBO J. 8:343
; Konczら, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131; およびDeBlockら, (1984) E
MBO J. 3 : 1681を参照されたい。近年、植物組織の破壊を必要としないＧＵＳ活性を可
視化するためのこれらのインビボ法が利用可能になっている。Molecular Probes publica
tion 2908 (1993) Imagene Green(商標), 1-4頁; およびNalewayら, (1991) J. Cell Bio
l. 115: 151a。
より最近になって、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、
ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、およびＹＦＰ）が、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現の
ためのマーカーとして利用されている。Chalfieら, (1994) Science 263: 802を参照され
たい。したがって、蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の突然変異は、いくつかの実施
形態において、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。
ナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター：プロモーター
直鎖核酸カセット分子に含まれる遺伝子は、必要に応じて、調節エレメント、例えばプ
ロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動してもよい。プロモーターのいくつかの
種類は、単独またはプロモーターとの組み合わせで使用され得る他の調節エレメントと同
様に、形質転換の技術分野において今や周知である。
プロモーターは、転写の開始点より上流であってもよく、ＲＮＡポリメラーゼおよび／
または転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与してもよいＤＮＡの領域で
ある。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり
得る。発生調節下のプロモーターの例としては、葉；根；種子；繊維；木部導管；仮導管
；または厚壁組織などのある種の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが挙
げられる。このようなプロモーターは、「組織優先的」と称される。ある種の組織におい
てだけ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と称される。「細胞型」特異的プ
ロモーターは、１または複数の器官、例えば根または葉における維管束細胞でのある種の
細胞型において主に発現を駆動する。「誘導可能な」プロモーターは、環境制御下にある
場合があるプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターによる転写に影響し得る環
境条件の例としては、限定されないが、嫌気性条件または光の存在が挙げられる。組織特
異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導可能なプロモーターは、「非構成的」プロ
モーターの種類を構成する。「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であ
ってよいプロモーターである。
１．誘導可能なプロモーター
誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
る。場合により、誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可
能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る
。誘導可能なプロモーターにより、転写速度は誘導剤に反応して増加する。
任意の誘導可能なプロモーターは、本発明の実施形態において用いることができる。Wa
rdら, (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366を参照されたい。例示的な誘導可能なプロ
モーターは、限定されないが、銅に反応するＡＣＥＩ系由来のもの（Mettら, (1993) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4567-4571）；ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に
反応するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Hersheyら, (1991) Mol. Gen Genetics 227:
229-237; およびGatzら, (1994) Mol. Gen. Genetics 243: 32-38）；ならびにＴｎ１０
由来のＴｅｔ抑制因子（Gatzら, (1991) Mol. Gen. Genetics 227: 229-237）を含む。特
に有用な誘導可能なプロモーターは、植物が通常は反応しない誘導剤に反応するプロモー
ターであってもよい。このような例示的な誘導可能なプロモーターは、ステロイドホルモ
ン遺伝子由来の誘導可能なプロモーターであり、その転写活性はグルココルチコステロイ
ドホルモンによって誘導され得る。Schenaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
8: 0421。
２．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る、
または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
様々な構成的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示
的な構成的プロモーターは、限定されないが、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターなどの
植物ウイルス由来のプロモーター（Odellら, (1985) Nature 313: 810-812）；イネアク
チン遺伝子由来のプロモーター（McElroyら, (1990) Plant Cell 2: 163-171）；ユビキ
チン（Christensenら, (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632、およびChristensenら, (
1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689）; ｐＥＭＵ（Lastら, (1991) Theor. Appl. Gene
t. 81: 581-588）; ＭＡＳ（Veltenら, (1984) EMBO J. 3:2723-2730）；トウモロコシＨ
３ヒストン（Lepetitら, (1992) Mol. Gen. Genetics 231: 276-285、およびAtanassova
ら, (1992) Plant Journal 2(3): 291-300）；ならびにＡＬＳプロモーター、Ｘｂａ１／
ＮｃｏＩ断片５’からセイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子（または
前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片と類似のヌクレオチド配列）を含む。国際ＰＣＴ公開第ＷＯ
９６／３０５３０号を参照されたい。
３．組織特異的または組織優先的プロモーター
組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
る。場合により、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可
能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る
。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した対象とする遺伝子を用いて形質転換され
た植物は、特定の組織において導入遺伝子のタンパク質産物を排他的または優先的に産生
され得る。
任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを、本発明の実施形態において利用す
ることができる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、限定されないが
、例えば、ファゼオリン遺伝子由来のプロモーターなどの根優先プロモーター（Muraiら,
(1983) Science 23: 476-82、およびSengupta-Gopalanら, (1985) Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 82: 3320-4）；例えばｃａｂまたはｒｕｂｉｓｃｏ由来のプロモーターなど
の葉特異的および光誘導プロモーター（Simpsonら, (1985) EMBO J. 4(11): 2723-2729、
およびTimkoら, (1985) Nature 318: 579-82）；例えば、ＬＡＴ５２由来のプロモーター
などの葯特異的プロモーター（Twellら, (1989) Mol. Gen. Genetics 217: 240-5）、例
えば、Ｚｍ１３由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター（Guerreroら, (1993)
Mol. Gen. Genetics 244: 161-8）および例えば、ａｐｇ由来のプロモーターなどの小胞
子優先的プロモーター（Twellら, (1993) Sex. Plant Reprod. 6: 217-24）を含む。
導入遺伝子によって生成されるタンパク質の、葉緑体；空胞；ペルオキシソーム；グリ
オキシソーム；細胞壁；もしくはミトコンドリアなどの細胞内コンパートメントへの輸送
、またはアポプラストへの分泌は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子のシグナル
配列から５’および／または３’領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結す
ることによって達成してもよい。その遺伝子の５’および／または３’末端での標的化配
列は、例えば、タンパク質合成およびプロセシング中に、コードされたタンパク質がどこ
で最終的にコンパートメント化され得るかを決定することができる。代わりに、そのよう
な細胞内コンパートメント標的化タンパク質は、所望の細胞内コンパートメントに対象と
する核酸分子で被覆されたナノ粒子を指向するために直接ナノ粒子に連結してもよい。
シグナル配列の存在は、細胞内小器官もしくは細胞内コンパートメントのいずれか、ま
たはアポプラストへの分泌にポリペプチドを指向してもよい。多数のシグナル配列が当該
技術分野において知られている。例えば、Beckerら, (1992) Plant Mol. Biol. 20: 49;
Close, P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993), Knoxら, (1987) Plant
Mol. Biol. 9: 3-17; Lernerら, (1989) Plant Physiol. 91: 124-9; Fontesら, (1991)
Plant Cell 3: 483-96; Matsuokaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 834;
Gouldら, (1989) J. Cell. Biol. 108: 1657; Creissenら, (1991) Plant J. 2: 129; K
alderonら, (1984) Cell 39: 499-509; Steifelら, (1990) Plant Cell 2: 785-93を参照
されたい。
外来タンパク質遺伝子および農学的遺伝子
本発明の実施形態によるトランスジェニック植物は、商業的な量で外来タンパク質を生
成し得る。したがって、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術は、従来の方
法で収穫される複数のトランスジェニック植物を生産する。次に、外来タンパク質は対象
とする組織から、またはバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパ
ク質抽出は、例えば、HeneyおよびOrr, (1981) Anal. Biochem. 114: 92-6で検討されて
いる既知の方法によって達成され得る。
本発明のいくつかの態様において、外来タンパク質の商業的生産のために提供される植
物材料は、植物、植物組織、または植物細胞であってもよい。いくつかの態様において、
対象とするバイオマスは植物種子であってよい。より高レベルの発現を示すトランスジェ
ニック植物について、遺伝子地図は、例えば、組み込まれたＤＮＡ分子の近似の染色体位
置を同定する従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲおよびＳＳＲ分析を介して作成してもよい。この点
に関する例示的な方法について、GlickおよびThompson, Methods in Plant Molecular Bi
ology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269: 284 (1993)を参照されたい。染
色体位置に関する地図情報は、例えば対象のトランスジェニック植物の所有権の保護、ま
たはバイオセーフティ評価において有用であり得る。認可されていない繁殖が行われ、他
の生殖質との交雑物が作製され得る場合、組み込み領域の地図は、疑われる植物について
の同様の地図と、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうかを決定するために比較
され得る。地図の比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲおよび配
列決定を含み得、その全ては従来型の技術である。
同様に、農業的遺伝子は、形質転換された細胞またはそれらの後代において発現され得
る。より具体的には、植物は、農業的目的での種々の表現型を発現するために本発明の方
法を介して遺伝子操作され得る。この点において使用され得る例示的な遺伝子として、限
定されないが、以下に分類されるものが挙げられる。
１．有害生物または病害への抵抗性を付与する遺伝子：
Ａ）植物の病害抵抗性遺伝子。植物の防御は、植物における病害抵抗性遺伝子（Ｒ）の
産物と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物との間の特定の相互作用によ
ってしばしば活性化される。植物種は、特定の病原体株に抵抗性である植物を操作するた
めにクローン化された抵抗性遺伝子を用いて形質転換され得る。例えばJonesら, (1994)
Science 266: 789（クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）への抵抗性の
ためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）；Martinら, (1993) Science 262: 1432（
シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）病原型への抵抗性のためのトマトＰ
ｔｏ遺伝子。トマトはプロテインキナーゼをコードする）；Mindrinosら, (1994) Cell 7
8: 1089（シュードモナス・シリンゲへの抵抗性のためのＲＳＰ２遺伝子）を参照された
い。
Ｂ）例えばダイズシストセンチュウ（soybean cyst nematode）などの有害生物への抵
抗性を付与する遺伝子。例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３０５１７号；国際ＰＣＴ
公開第ＷＯ９３／１９１８１号を参照されたい。
Ｃ）バチルス・チューリンゲンシスタンパク質、その誘導体、またはそれをモデル化し
た合成ポリペプチド。例えば、Geiserら, (1986) Gene 48: 109（Ｂｔδ−エンドトキシ
ン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列）を参照されたい。さらに、δ−エンド
トキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えばＡＴＣＣ受入番号４００９８；６７１
３６；３１９９５；および３１９９８でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入することができる。
Ｄ）レクチン。例えば、Van Dammeら, (1994) Plant Molec. Biol. 24: 25（いくつか
のクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を参
照されたい）。
Ｅ）例えばアビジンなどのビタミン結合タンパク質。国際ＰＣＴ公開第ＵＳ９３／０６
４８７号（害虫に対する殺幼虫剤（larvicide）としてのアビジンおよびアビジン相同体
の使用）を参照されたい。
Ｆ）酵素阻害剤、例えばプロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤、またはアミラー
ゼ阻害剤。例えば、Abeら, (1987) J. Biol. Chem. 262: 16793（イネシステインプロテ
イナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）；Huubら, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 985（
タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；Sumitaniら
, (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウ
ス（Streptomyces nitrosporeus）アルファ−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）お
よび米国特許第５，４９４，８１３号を参照されたい。
Ｇ）例えばエクジステロイドまたは幼若ホルモン、それらの変異体、それらに基づく模
倣物、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの昆虫特異的ホルモンまた
はフェロモン。例えば、Hammockら, (1990) Nature 344: 458（クローン化された幼若ホ
ルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化因子のバキュロウイルス発現）を参照され
たい。
Ｈ）影響を受けた有害生物の生理機能を発現によって破壊する昆虫特異的ペプチドまた
は神経ペプチド。例えば、Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269: 9（発現クローニングは
昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡを産出する）；およびPrattら, (1989) Bioc
hem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243（アロスタチンはディプロプテラ パンタタ（Diplo
ptera puntata）において同定され得る）を参照されたい。米国特許第５，２６６，３１
７号（昆虫特異的な麻痺性神経毒をコードする遺伝子）も参照されたい。
Ｉ）天然でヘビ、スズメバチまたは任意の他の生物によって産生される昆虫特異的毒液
。例えば、Pangら, (1992) Gene 116: 165（サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子
の植物における異種性発現）を参照されたい。
Ｊ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノ
イド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質性分子の高度集積に関連する酵素。
Ｋ）生物学的に活性な分子、例えば天然または合成での、解糖系酵素；タンパク質分解
酵素；脂肪分解酵素；ヌクレアーゼ；シクラーゼ；トランスアミナーゼ；エステラーゼ；
ヒドロラーゼ；ホスファターゼ；キナーゼ；ホスホリラーゼ；ポリメラーゼ；エラスター
ゼ；キチナーゼ；またはグルカナーゼの翻訳後修飾を含む修飾に関与する酵素。国際ＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ９３／０２１９７号（カルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を参照された
い。キチナーゼをコードする配列を含むＤＮＡ分子は、例えばＡＴＣＣから受入番号３９
６３７および６７１５２で得ることができる。Kramerら, (1993) Insect Biochem. Molec
. Biol. 23: 691（タバコイモムシキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
）；およびKawalleckら, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 673（パセリｕｂｉ４−２ポリ
ユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列）も参照されたい。
Ｌ）シグナル伝達を刺激する分子。例えば、Botellaら, (1994) Plant Molec. Biol. 2
4: 757（リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンについてのヌクレオチド配列）；お
よびGriessら, (1994) Plant Physiol. 104: 1467（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮ
Ａクローンのヌクレオチド配列）を参照されたい。
Ｍ）疎水性モーメントペプチド。例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１６７７６号（
真菌性植物病原体を抑制するタキプレシンのペプチド誘導体）；および国際ＰＣＴ公開第
ＷＯ９５／１８８５５号（病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチド）を参照されたい。
Ｎ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤。例えば、Jaynesら, (1993) P
lant Sci 89: 43（青枯病菌（Pseudomonas solanacearum）に抵抗性のトランスジェニッ
クタバコ植物を提供するセクロピン−β溶解性ペプチド類似物の異種性発現）を参照され
たい。
Ｏ）ウイルス性侵襲性タンパク質またはそれら由来の複合毒素。例えば、形質転換され
た植物細胞におけるウイルス被覆タンパク質の蓄積は、被覆タンパク質遺伝子が由来し得
るウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および
／または病害の進行への抵抗性を与える。Beachyら, (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28
: 451を参照されたい。被覆タンパク質媒介抵抗性は形質転換植物に、アルファルファモ
ザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイル
スＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルスおよびタバ
コモザイクウイルスに対して与えられている。同文献。
Ｐ）昆虫特異的抗体またはそれら由来の免疫毒素。したがって、昆虫の消化管において
重要な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を不活性化し、昆虫を死滅させても
よい。Taylorら, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microb
e Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)（一本鎖抗体断片の生成を介するトラン
スジェニックタバコにおける酵素の不活性化）を参照。
Ｑ）ウイルス特異的抗体。例えば、Tavladorakiら, (1993) Nature 366: 469（組換え
抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物はウイルス攻撃から防御される）を参照さ
れたい。
Ｒ）病原体または寄生生物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、真
菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−
ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成および植物栄養素の放出
を促進する。Lambら, (1992) Bio/Technology 10: 1436を参照されたい。Toubartら, (19
92) Plant J. 2: 367（マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺
伝子のクローニングおよび特徴付け）も参照されたい。
Ｓ）植物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、Logemannら, (1992)
Bio/Technology 10: 305（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェ
ニック植物は真菌性病害への抵抗性が増大している）を参照されたい。
２．除草剤への抵抗性を付与する遺伝子
Ａ）成長点または分裂組織を阻害する、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素
などの除草剤。この分類の例示的な遺伝子は、例えば、Leeら, (1988) EMBO J. 7: 1241
、 およびMikiら, (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449によってそれぞれ記載される突
然変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。
Ｂ）例えば、突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳ
Ｐ）遺伝子（組換え核酸の導入および／または種々の形態の天然ＥＰＳＰ遺伝子のインビ
ボ突然変異誘発を介して）；それぞれａｒｏＡ遺伝子およびグリホセートアセチルトラン
スフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子；他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセス ハ
イグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス ビリジク
ロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス種由来のグル
ホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子；およびピ
リジノキシまたはフェノキシプロプリオン酸ならびにシクロヘキソン類（ＡＣＣａｓｅ阻
害剤をコードする遺伝子）によって付与されるグリホセート抵抗性。例えば、米国特許第
４，９４０，８３５号および米国特許第６，２４８，８７６号（植物にグリホセート抵抗
性を付与し得るＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列）を参照されたい。突然変異体ａｒｏ
Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受入番号３９２５６で得ることができる。
米国特許第４，７６９，０６１号（突然変異体ａｒｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列）も参
照されたい。欧州特許出願第０３３３０３３号および米国特許第４，９７５，３７４号は
、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤への抵抗性を付与し得るグルタミン合成酵素遺伝
子のヌクレオチド配列を開示している。例示的なＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧
州出願第０２４２２４６号、およびDeGreefら, (1989) Bio/Technology 7: 61（ＰＡＴ活
性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成）において
提供される。フェノキシプロプリオン酸、ならびにセトキシジムおよびハロキシホップな
どのシクロヘキソン類への抵抗性を付与する遺伝子の例は、Marshallら, (1992) Theor.
Appl. Genet. 83: 435によって記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡ
ｃｃ１−Ｓ３遺伝子を含む。グリホセート抵抗性を付与できるＧＡＴ遺伝子は、例えば、
ＷＯ２００５０１２５１５に記載されている。２，４−Ｄ，フェノキシプロピオン酸およ
びピリジロキシオーキシン除草剤への抵抗性を付与する遺伝子は、例えばＷＯ２００５１
０７４３７に記載されている。
Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ
遺伝子）などの光合成を阻害する除草剤。例えばPrzibilaら, (1991)Plant Cell 3:169（
突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換）を参
照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８
号に開示され、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受入番号５３４３５；６７４
４１；および６７４４２で入手可能である。Hayesら, (1992) Biochem. J. 285: 173（グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現）も参
照されたい。
３．次のような付加価値のある形質を付与するまたはそれに寄与する遺伝子
Ａ）例えば、植物のステアリン酸含有量を増加させるためにステアリルＡＣＰ不飽和化
酵素のアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる、修飾された脂肪酸代
謝。Knultzonら, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 2624を参照されたい。
Ｂ）フィチン酸塩含有量の減少。フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸
塩の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離リン酸塩を増やしてもよい。例
えば、Van Hartingsveldtら, (1993) Gene 127: 87（クロコウジカビ（Aspergillus nige
r）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を参照されたい。フィチン酸塩含有量を減ら
す遺伝子を導入してもよい。例えばトウモロコシにおいて、これはクローニング、および
続く、フィチン酸の低レベルによって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得
る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡの再導入によって達成され得る。Raboyら, (1990) Ma
ydica 35: 383を参照されたい。
Ｃ）例えば、デンプンの分枝様式を変化させる酵素をコードする遺伝子を用いて植物を
形質転換することによって生じた修飾された炭水化物組成物。例えば、Shirozaら, (1988
) J. Bacteol. 170: 810（連鎖球菌突然変異体フルクトース転移酵素遺伝子のヌクレオチ
ド配列）；Steinmetzら, (1985) Mol. Gen. Genet. 20: 220（レバンスクラーゼ遺伝子）
；Penら, (1992) Bio/Technology 10: 292（α−アミラーゼ）；Elliotら, (1993) Plant
Molec. Biol. 21: 515（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Sogaardら
, (1993) J. Biol. Chem. 268: 22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；およびFisher
ら, (1993) Plant Physiol. 102: 1045（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参
照されたい。
Ｃ．ナノ粒子
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壁を含む植物細胞に対象とする官能化直鎖
核酸カセット分子を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法
は、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて被覆させたナノ粒子を細胞と接触さ
せて配置し、細胞壁を通したナノ粒子の取り込みを可能にすることを含んでもよい。特定
の実施形態において、ナノ粒子は、可逆的にまたは不可逆的に、対象とする官能化直鎖核
酸カセット分子を含み、それで被覆され、またはその他の方法でそれに結合および／また
は担持してもよい。これらおよびさらなる実施形態において、ナノ粒子は、対象となる官
能化核酸カセット分子上の基と反応する基で官能化され、対象となる官能化直鎖核酸カセ
ット分子に結合したナノ粒子を生成し得る。特定のの実施形態において、対象とする官能
化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞との接触前にナノ粒子に導入され、
または細胞壁を有する植物細胞にナノ粒子の導入と同時であってもよい。本発明の実施形
態において使用され得るナノ粒子の例は、限定されないが、量子ドット；他の半導体ナノ
粒子；正に帯電したナノ粒子；金ナノ粒子；金被覆ナノ粒子；多孔性ナノ粒子；メソ多孔
性ナノ粒子；シリカナノ粒子；ポリマーナノ粒子（例えばデンドリマー）；タングステン
ナノ粒子；ゼラチンナノ粒子；ナノシェル；ナノコア；ナノスフェア；ナノロッド；およ
び磁気ナノ粒子含む。
本発明の特定の実施形態では、ナノ粒子の表面は官能化されてもよく、それは、例えば
、ナノ粒子の表面への他の物質の標的化された取り込み、または可逆的もしくは不可逆的
な結合を可能し得る。非限定的な例として、ナノ粒子（例えば、量子ドット）の表面は、
例えば、アルカンチオレート（alkanethiolate）の自己組織化単分子膜で官能化され得、
これはさらに官能化または誘導体化し得る。さらに非限定的な例では、ナノ粒子の表面は
、それ自体が、例えば、ストレプトアビジンさらに官能化または誘導体化され得るリンカ
ーで誘導体化し得る。一つの実施形態では、ナノ粒子は、PEG化し得る。他の実施形態で
は、ナノ粒子は、1つ以上のコア（活性または不活性）、立体コート（活性または不活性
）、開裂可能な結合、および/または標的分子またはリガンドを含み得るか、またはこれ
らで多官能化され得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ストレプトアビジンQDコンジュゲートであり得
る。ストレプトアビジンＱＤコンジュゲートは、半導体材料（CdSe）のナノメートルスケ
ールの結晶（これは、その材料の光学的特性を改善するために、さらなる半導体シェル（
ZnS）で被覆されている）から作られている。それは、605 nm付近に発光極大を有する狭
い、対称的な発光スペクトルを有する。コア・シェル素材はさらに、材料が生体分子に結
合させること、およびその光学特性を保持することを可能にするポリマーシェルで被覆さ
れている。このポリマーシェルが直接ストレプトアビジンに結合されている。ストレプト
アビジンＱＤコンジュゲートは、大きい高分子または蛋白質（約15〜20 nm）のサイズで
ある。表面は、様々な水性緩衝液中のサンプルとともにインキュベートされた場合、低い
非特異的シグナルを有するように調製される。量子ドットを活性エステルカップリング反
応を介して直接ストレプトアビジンに結合し得る。これは、高特異的生物学的活性を有す
るストレプトアビジン量子ドット複合体を生じる表面（典型的には、5〜10 個のストレプ
トアビジン/量子ドット複合体）上に共有結合により結合されたストレプトアビジンを有
する材料が得られる。
本発明の実施形態によれば、細胞壁を有する植物細胞は、損傷を受けていない細胞壁全
体を含む任意の植物細胞であってもよい。細胞壁を有する細胞の例は、限定されないが、
藻類；タバコ；ニンジン；トウモロコシ；キャノーラ；ナタネ；綿；パーム；ピーナッツ
；大豆；サトウキビ；オリザ種（Oryza sp.）；シロイヌナズナ種（Arabidopsis sp.）；
およびトウゴマ種（Ricinus sp.）を含む。本発明の実施形態は、任意の組織、または、
限定されないが、胚；分裂組織細胞；カルス；花粉、例えば、半数体および２倍半数体の
小胞体；葉；葯；根；根端；花；種子；鞘；茎；および組織培養物を含めて、その中に見
出されるあらゆる箇所由来の細胞壁を含む細胞を含んでもよい。
本発明の特定の実施形態において、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、本発明
に係る細胞壁を有する植物細胞に送達され得る任意の官能化直鎖核酸カセット分子であっ
てもよい。対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、限定されないが、ＤＮＡ；ＲＮＡ
；ＲＮＡｉ分子；遺伝子；プラスミド；コスミド；ＹＡＣ；およびＢＡＣの核酸配列を含
んでもよい。対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞に、例
えば、限定されないが、ポリペプチド；酵素；ホルモン；糖ペプチド；糖類；脂肪；シグ
ナル伝達ペプチド；抗体；ビタミン；メッセンジャー；セカンドメッセンジャー；アミノ
酸；ｃＡＭＰ；薬剤；除草剤；殺菌剤；抗生物質；および／またはそれらの組み合わせと
同時に導入してもよい。
量子ドットのようなナノ粒子は、Dubertretら（2002）Science 298:1759のプロトコル
を使用して、または当業者の裁量によりそこから修正されたプロトコルによって、PEGで
官能化し得る。例えば、TOPO（トリオクチルホスフィンオキシド）で被覆されたCdSe/ZnS
量子ドットは、クロロホルム中のPEG PEで懸濁し、続いて溶剤の蒸発及び得られるPEG化
量子ドットの水での可溶化をさせ得る。
本発明の態様において、ナノ粒子は、細胞の様々な部分に取り込まれ得る。ナノ粒子が
取り込まれ得る位置の例は、限定されないが、細胞質ゾル；核；液胞膜；色素体；エチオ
プラスト；有色体；白色体；脂肪体；タンパク質プラスト；アミロプラスト；葉緑体；お
よび二重膜の管腔を含む。他の実施形態では、細胞壁を含む細胞へのナノ粒子の取り込み
は、シンプラスト的またはアポプラスト的経路を介して行ってもよい。
Ｄ．安定に形質転換された植物細胞
本発明に係る安定に形質転換された植物細胞は、ナノ粒子を媒介した形質転換によって
、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて形質転換され得る任意の植物細胞であ
ってもよい。したがって、植物細胞は、双子葉植物または単子葉植物から単離し、または
そこから培養してもよい。また、植物細胞は、植物組織または植物全体に存在してもよい
。本発明に係る双子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、アル
ファルファ；豆類；ブロッコリ；キャベツ；ニンジン；カリフラワー；セロリ；白菜；綿
；キュウリ；ナス；レタス；メロン；エンドウ；コショウ；ピーナッツ；ジャガイモ；カ
ボチャ；ダイコン；ナタネ；ホウレンソウ；大豆；スカッシュ；サトウダイコン；ヒマワ
リ；タバコ；トマト；およびスイカを含む。本発明に係る単子葉植物由来の安定に形質転
換された植物細胞の非制限的な例は、コーン；タマネギ；イネ；ソルガム；小麦；ライ麦
；キビ；サトウキビ；オートムギ；ライ小麦；スイッチグラスおよび芝草を含む。
除草剤グルホシネートアンモニウム（GLA）は、グルホシネート耐性遺伝子を発現する
トランスジェニック植物をスクリーニングするために、フィールドレベルの濃度で噴霧し
得る。本発明の方法を用いて生成したシロイヌナズナのT1苗は、グルホシネートのフィー
ルドレベルの用量の5つの連続した適用（例えば、発芽後7日を開始日として一日おきに）
に対して、除草剤耐性を示している。これらのトランスジェニック植物からのゲノムDNA
をPCRによりpatおよびyfpの存在について分析し、その結果は、patおよびyfp標的DNA配列
を示している。PCR産物の配列決定の結果は、本発明の方法を用いて生成されたT1シロイ
ヌナズナ中でのpatおよびyfp導入遺伝子の正確な配列を明らかにした。
本発明に係るトランスジェニック植物は、本発明の方法によって産生された安定に形質
転換された植物細胞から再生し得る。このような植物は、任意の方法で使用または栽培す
ることができ、ここで、対象とする核酸分子の存在が望ましい。従って、トランスジェニ
ック植物は、ナノ粒子媒介形質転換を介して官能化直鎖核酸カセット分子で形質転換し、
そして当業者に公知の任意の方法によってトリミングされ、栽培されることにより、とり
わけ、1または複数の所望の特性を有するように操作し得る。
以下の実施例は、ある特定の特徴および/または実施形態を説明するために提供される
。これらの実施例は、例示される特定の特徴または実施形態に本発明を限定するものと解
釈されるべきではない。
実施例1：植物細胞の形質転換のためのナノ粒子の調製
DNA；プラスミドDNAの調製
pDAB3831プラスミドDNA（図1）を単離し、直鎖DNA/ストレプトアビジン被覆量子ドット
による植物の形質転換のために調製した。このプラスミドは、シロイヌナズナユビキチン
10プロモーター（AtUbi10）によって駆動されるPAT選択マーカー遺伝子およびキャッサバ
葉脈モザイクウイルスプロモーター（CsVMV）によって駆動されるフィラジウム黄色蛍光
タンパク質遺伝子（PhiYFP）を含む。形質転換実験を、直鎖化DNAを用いて試験した。
pDAB3831を直鎖化するために、PCR反応を完了させた。pDAB3831を、連続サーマルサイ
クリングシステムを用いてPCR増幅した。PCT国際公開WO 2008/045288。サンプルを以下を
含むように調製した：12％ MgCl2（25mM）、0.33％ Taq DNAポリメラーゼ（5単位/μL）
、2.0％ dNTP（アデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオ
キシグアノシン三リン酸（dGTP）、およびデオキシチミジン（deothythimidine）三リン
酸（dTTP））、8.0％ テンプレート（2μg/mL）、61.66％ プルロニックF108溶液（1.5％
溶液）、4％フォワードプライマー、4％リバースプライマー、及び8％の反応緩衝液（10
倍濃度）。システムの隣接セクタを、それぞれ解離、アニーリング、および伸長のために
、95℃、59℃、および72℃の温度に設定した。PCR反応混合物を20psiで加圧容器を使用し
て、システムを介してポンピングした。反応混合物を温度制御本体に供給した後、鉱物油
を使用して、チューブの長さ全体を通してサンプルをプッシュした。反応混合物の流速を
流量弁で0.25 mL/分に制御した。サンプル中に存在する特定のDNA配列を、温度帯を通し
て周期的に渡すに従って増幅した。30サイクル後、内容物を採取した。PCR産物をゲルろ
過カラムで精製し、続いてエタノール沈殿させた。精製した産物のサンプルを、Agilent
Bioanalyzer（商標）上で、ならびにアガロースゲル電気泳動上で分析し、PCR産物のサイ
ズおよび濃度を確認した。
上記のPCRに使用したテンプレートは、DASプラスミドpDAB3831であった。フォワードプ
ライマー配列番号：1およびリバースプライマー配列番号：2を合成して、遺伝子およびそ
れらのプロモーターの両方を含む4.6 kbpの完全な発現カセット（すなわち、直鎖化され
たDNA）を増幅した。さらに、ナノ粒子の表面に直線二本鎖DNAの結合を容易にするために
、ビオチンTEG CEホスホラミダイトを使用してプライマーのリン酸基にビオチン分子を化
学的に結合させた。このホスホラミダイトは、トリエチレングリコールリンカーに基づく
伸長した15原子混合極性スペーサーアームを有する。オリゴの残りの部分からビオチン機
能を分離する伸長スペーサーアームの利点は、ストレプトアビジン分子に結合する時にす
べての可能な立体障害の影響を低減することである。フォワードプライマーを標識したと
きに、ビオチンは、DNAの先頭にある。リバースプライマーを標識したときに、ビオチン
はDNA断片の終端にある。したがって、ビオチン化（両方向）DNA断片は、ストレプトアビ
ジンで被覆されたナノ粒子に結合させることができる。ビオチン化オリゴおよび連続熱循
環システムを使用して、約20mgの直鎖状DNA断片を生成した。
直鎖DNA /ナノ粒子の複合体化
ストレプトアビジン被覆量子ドットは、Evident Technology（トロイ、ニューヨーク州
）から入手した。1 mLのストレプトアビジン被覆量子ドット（4 nmol）を0.5mgのビオチ
ン化した直鎖化プラスミドDNAとともに30分間室温でインキュベートし、直鎖状DNA/QD複
合体を形成した。
実施例2：シロイヌナズナの花芽の形質転換
植物体形質転換のための植物材料
種子の同期された発芽は、Ｔ0植物における花発生の均質性を確実するために重要であ
る。シロイヌナズナ（A. thaliana）ｃｖ．コロンビア種子は、０．１％（ｗ／ｖ）寒天
溶液中に懸濁され、４℃にて４８時間インキュベートし、層別化を完了した。６０ｍｇの
種子を計量し、１５ｍＬチューブに移した。１３ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液を添
加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行った。これは、４．６ｍｇ種子／１ｍ
Ｌの０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液（または約２３０種子／ｍＬ）の種子溶液濃度を作製す
る。６本のチューブ（７２ｍＬ溶液）を調製し、各トレイに１８（３１／２インチ）ポッ
トを含む４平面に植え付けた。種子溶液を４℃にて４８時間インキュベートし、層別化を
完了した。各ポットは、個別に、ポットあたり１．０ｍＬの層状化種子溶液で植え付けら
れた。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持し
た。ドームを植え付け日後の５日に除いた。種子を発芽させ、植物を長日条件下（１６時
間明／８時間暗）、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2秒の光度にて、一定の温度（２２℃）
および湿度（４０〜５０％）下でＣｏｎｖｉｒｏｎ（登録商標）（モデルＣＭＰ４０３０
およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔ
ｅｄ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃａｎａｄａ）において生育した。植物は
、植物を植え付けた後の１０〜１４日間、Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液、続いてＤＩ水で水を与
え、湿らせてはないが、土壌水分を保持した。植え付けの日から４週間後、花を摘み、二
番花のより均等な生育を生じさせた。植え付け後の第５週で、形質転換プロセスのために
植物を調製した。
植物体形質転換
シロイヌナズナ（A. thaliana）ｃｖ．コロンビアの直鎖ＤＮＡ／ＱＤを媒介した形質
転換は、CloughおよびBentの変更したプロトコルを用いて完了した。CloughおよびBent (
1998) Plant J. 16:735-43。２０ｍＬの懸濁液は、０．５ｍｇの直鎖ＤＮＡおよび４ｎＭ
のＰＱＤの濃度で直鎖ＤＮＡ／ＱＤ複合体溶液を用いて作製され、シロイヌナズナ植物（
大部分は、いくつかの受精した長角果（fertilized silique）を有する未成熟な花房）の
処置に使用された。植物を浸漬する前に、０．０５％（ｖ／ｖ）（２５０μＬ／５００ｍ
Ｌ）〜０．００５％の濃度にしたＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を直鎖ＤＮＡ／ＰＱＤ溶液に添
加し、十分に混合した。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、直鎖ＤＮＡ／Ｐ
ＱＤ溶液に３０秒間浸漬された。処理された植物は、それらの側に３０分間、暗くして２
２〜２４℃にて置かれた。植物は、上述される条件下、Ｃｏｎｖｉｒｏｎに移され、成熟
するまで生育させ、種子を回収した。
選択トレイ（１０．５’’×２１’’×１’’トレイ）を用いて、バルク回収種子をＴ
0植物からスクリーニングし、各トレイでは約１０，０００個の種子があった。２つの対
照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認した；Ｃｏｌ−０負の形質転換体対照
、および正の形質転換体対照としてＰＡＴ（ホスピノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ）選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアＣｏｌ−０野生
型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の４８時間、０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶
液に層状化された。選択トレイあたり１０，０００個の種子を与えるために、２００ｍｇ
の種子を０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテック
スした。次に、層状化された種子は、ＳｕｎｓｈｉｎｅミックスＬＰ５で満たされた選択
トレイ上に植え付けられ、Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液を用いて地下潅漑された。有効である選
択噴霧について、４０ｍＬの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは
重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、植物を選択のために生
育した。繁殖ドームは、植え付け後の約５日で除かれた。
実施例3：形質転換されたシロイヌナズナの分析
形質転換された植物の選択
新たに回収されたＴ1種子は、室温にて７日間乾燥させた。Ｔ1種子は２６．５×５１ｃ
ｍの発芽トレイに植え付けられ、各々は、予め４０ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）アガロース
溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存され、休眠要件を完了し、同期された種子発芽を確
認された、層状化されたＴ1種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を
受け入れた。
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでＨｏ
ａｇｌａｎｄ溶液で地下潅漑され、次に重力排水された。層状化された種子の各４０ｍＬ
アリコートは、ピペットを用いてバーミキュライトに均一に植え付けられ、４〜５日間、
湿式ドームで覆われた。ドームは、グルホシネートの発芽後噴霧を用いて、初期の形質転
換体の選択前１日に取り除かれた。
植え付け後の７日（ＤＡＰ）に、Ｔ1植物（それぞれ子葉および２−４−ｌｆ段階）は
、１塗布あたり２８０ｇ ａｅ／ｈａグルホシネートの有効速度で送達するために、Ｄｅ
Ｖｉｌｂｉｓｓ圧縮された空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ
）の噴霧体積で、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ ａｅ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅ
ｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）の０．２％（ｗ／ｖ
）溶液を用いて５日以内に連続して５回噴霧された。生き残ったもの（活性に生育してい
る植物）は、最終噴霧後の４〜７日に同定され、鉢植え媒体（Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ ３６
０）を用いて調製された３インチのポットに個別に移された。移された植物は、３〜４日
間、湿式ドームで覆われ、以前の通り２２℃の生育チャンバーに置かれ、または温室に直
接移された。ドームは、その後、取り出され、植物は、温室（２２±５℃、５０±３０％
ＲＨ、１４時間明：１０時間暗、最小５００μＥ／ｍ2ｓ1自然＋追加の光）内で生育され
た。
導入遺伝子のゲノム組み込みのための分子分析および証拠
シロイヌナズナ（A. thaliana）トランスジェニック植物由来のゲノムＤＮＡは、製造
業者の指示書に従って、植物ＤＮＡＺＯＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、
６週齢の植物の葉材料から抽出された。ＰＣＲプライマーは、ＹＦＰおよびＰＡＴ導入遺
伝子を検出するために設計された。ＹＦＰプライマーは配列番号１および配列番号２とし
て示される。ＰＡＴプライマーは配列番号５および配列番号６として示される。
導入遺伝子のｇＤＮＡ ＰＣＲ増幅
ＰＡＴおよびＹＦＰについてのＰＣＲ増幅反応は、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（商標）
キット（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて完了された。遺伝
子産物は、５０μＬの全反応体積において増幅された。ＰＣＲ反応は、１００ｎｇゲノム
ＤＮＡ鋳型、１×ＥｘＴａｑ反応緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐＭｏｌの各プラ
イマー、および０．０２５単位／μＬのＥｘＴａｑを含んだ。以下のＰＣＲ条件を用いた
：９６℃で５分間の１サイクル、および以下の条件：９４℃で１５秒間、６５℃で３０秒
間、７２℃で１分間、および最終伸長７２℃で７分間の３１サイクル。ＰＣＲ増幅産物は
、０．８％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色に
よって視覚化された。ＤＮＡ断片は、ＱＩＡＥＸ（商標）ＩＩゲル精製キット（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、アガロースゲルから精製された。
ＰＣＲ断片は、高度なＳａｎｇｅｒ配列決定技術（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｕｎｔ
ｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、ＰＡＴフォワードプライマー（配列番号５）とＹＦＰフ
ォワードプライマー（配列番号３）により配列決定された。配列データは、Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｈｅｒソフトウェアを用いて分析された。
ＰＡＴおよびＹＦＰのＰＣＲアンプリコンの配列決定結果は、これらの遺伝子について
予期されたヌクレオチド配列と合致していた。これらの結果は、ｐＤＡＢ３８３１からの
ＰＡＴ配列およびＹＦＰ配列は、ナノ粒子および直鎖ＤＮＡカセット形質転換プロトコル
を用いて、シロイヌナズナのｇＤＮＡに安定に組み込まれたことを明示する。
本結果は、ＰＡＴおよびＹＦＰ配列が実施例１における正に帯電したナノ粒子を媒介し
た直鎖化ＤＮＡ送達を通じて送達され、したがって、シロイヌナズナ植物のゲノムＤＮＡ
における導入遺伝子の安定なゲノム組み込みの証拠を与えることを示す。
実施例4：培養植物細胞への官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子を媒介した送達
単一細胞植物材料を調製する。
例えば、ＢＹ２細胞およびＮＴ１細胞の両方を用いる。ＢＹ２細胞は、緑色でない、増
殖が速いタバコ細胞株である。ＮＴ１細胞は、タバコから単離された光独立栄養細胞であ
る。形質転換の３から４日前、１週齢の懸濁培養は、２５０ｍＬフラスコに５０ｎＭのＤ
ＡＳ−ＰＭＴＩ−１（微小管阻害剤）および０．５〜０．１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含
む４０ｍｌのＮＴ１ＢまたはＬＳＢＹ２培地に、２ｍｌのＮＴ１またはＢＹ２培養物を移
すことによって、新鮮な培地に継代培養される。単一細胞は、微小管阻害剤処理後の４日
または７日のいずれかで回収される。使用されるＢＹ２単一細胞は、生存細胞をカウント
するために、Ｂｅｃｋｍａｎフローサイトメータにより処理される。細胞は、単一細胞が
細胞の細胞質を通じて分布した大多数の色素体（アミロプラスト）を含むことを決定する
ために、共焦点画像システムに接続された微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用い
て調べられる。細胞は、３．０ＯＤ600の懸濁液１ｍＬを移すことによって、１４日ごと
に一度継代培養される。形質転換の標的細胞として培養細胞が用いられる。
ナノ粒子調製および細胞の処理
プラスミドＤＮＡは、直鎖ＤＮＡ／量子ドット（ＱＤ）を媒介した植物形質転換のため
に単離および調製される。プラスミドは、シロイヌナズナユビキチン１０プロモーター（
ＡｔＵｂｉ１０）によって駆動されるＰＡＴ選択可能なマーカー遺伝子、およびカッサバ
葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ）によって駆動されるフィラジウム黄色
蛍光タンパク質遺伝子（ＰｈｉＹＦＰ）を含む。プラスミドを含む大腸菌（Escherichia
coli）株は植菌され、３７℃にてアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス
中で濁るまで増殖される。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅ
ｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離される。
プラスミドDNAを直鎖化するために、PCR反応を、連続熱サイクリング・システムを使用
して完了する。PCT国際公開WO 2008/045288。サンプルは以下を含むように調製される：1
2％ MgCl2（25mM）、0.33％ Taq DNAポリメラーゼ（5単位/μL）、2.0％ dNTP（アデノシ
ン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシグアノシン三リン酸
（dGTP）、およびデオキシチミジン（deothythimidine）三リン酸（dTTP））、8.0％ テ
ンプレート（2μg/mL）、61.66% プルロニックF108溶液（1.5％溶液）、4％フォワードプ
ライマー、4％リバースプライマー、及び8％の反応緩衝液（10倍濃度）。システムの隣接
セクタを、それぞれ解離、アニーリング、および伸長のために、95℃、59℃、および72℃
の温度に設定した。PCR反応混合物を20psiで加圧容器を使用して、システムを介してポン
ピングした。反応混合物を温度制御本体に供給した後、鉱物油を使用して、チューブの長
さ全体を通してサンプルをプッシュした。反応混合物の流速を流量弁で0.25 mL/分に制御
した。サンプル中に存在する特定のDNA配列を、温度帯を通して周期的に渡すに従って増
幅した。30サイクル後、内容物を採取した。PCR産物をゲルろ過カラムで精製し、続いて
エタノール沈殿させた。精製した産物のサンプルを、Agilent Bioanalyzer（商標）上で
、ならびにアガロースゲル電気泳動上で分析し、PCR産物のサイズおよび濃度を確認した
。
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを合成して、遺伝子およびそれらのプ
ロモーターの両方を含む完全な発現カセット（すなわち、直鎖化されたDNA）を増幅する
。さらに、ナノ粒子の表面への直鎖二本鎖DNAの結合を容易にするために、ビオチンTEG-C
Eホスホラミダイトを使用してプライマーのリン酸基にビオチン分子を化学的に結合させ
る。したがって、ビオチン化（両方向）DNA断片は、ストレプトアビジン被覆されたナノ
粒子に結合させることができる。ビオチン化オリゴおよび連続熱循環システムを使用して
、直鎖状DNA断片がミリグラム量で生成される。
直鎖DNA/ナノ粒子の複合体化
ストレプトアビジン被覆量子ドットは、Evident Technology（トロイ、ニューヨーク州
）から取得される。1 mLのストレプトアビジン被覆量子ドット（4 nmol）を0.5 mgのビオ
チン化直鎖化プラスミドDNA共に30分間室温でインキュベートして、直鎖DNA/QD複合体を
形成する。
１〜３μＬ／ｍＬの直鎖DNA結合ナノ粒子の濃度は、２４ウェルマイクロタイタープレ
ート中の５００μＬの細胞に添加され、２０分間、暗所で振とう機上で穏やかに回転させ
る。ナノ粒子は細胞壁を通じて運搬される。
実施例5：多官能化されたナノ粒子を媒介したシロイヌナズナの植物体形質転換
シロイヌナズナについての植物体形質転換は、CloughおよびBent(1998)から修飾された
ものを用いて行うことができる。多官能化されたナノ粒子上のＤＮＡ、ならびにホーミン
グタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）およびＮＬＳ単位の分子の濃度は、形質転換効
率の増加を達成するために最適化される。
植物材料：健康なシロイヌナズナ植物は、開花するまで土壌において、ポットに入れて
長日下で生育される。第１の束は刈り取られ、多数の第２の束の増殖を促す。植物は、刈
り取られた後のおよそ４〜６日で準備される。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
・コロンビア（Ｃｏｌ−０）生態型は、花の植物体形質転換のためにバックグラウンド（
Ｔ0植物）として選択される。種子の同調された発芽は、Ｔ0植物における花芽発生の均質
性を確実にするために重要である。野生型種子は、０．１％寒天溶液に懸濁され、４℃に
て４８時間インキュベートし、層別化を完了する。薬包紙上で６０ｍｇの種子を計量し、
１５ｍＬチューブに移す。１３ｍＬの０．１％寒天溶液を添加し、種子が均一に分散する
までボルテックスを行う。これは、４．６ｍｇ種子／１ｍＬ溶液（または約２３０種子／
ｍＬ）の濃度を作製する。６本のチューブ（７２ｍＬ溶液）を調製し、各トレイに１８（
３１／２インチ）ポットを含む４平面に植え付け、全２ポットを植え付ける。溶液を４℃
にて４８時間インキュベートし、層別化を完了する。各ポットは、個別に、ポットあたり
１．０ｍＬの層状化種子溶液で植え付けられる。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ド
ームをトレイに配置し、土壌水分を保持する。ドームを植え付け日後の５日に除く。種子
を発芽させ、植物を長日条件下（１６時間明／８時間暗）、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ
2秒の光度にて、一定の温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下でＣｏｎｖｉｒｏ
ｎ（登録商標）（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ，Ｃ
ａｎａｄａ）において生育する。植物は、植物を植え付けた後の１０〜１４日間、Ｈｏａ
ｇｌａｎｄ溶液、続いてＤＩ水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持する。植
え付けの日から４週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせる。植え付け後
の第５週で、形質転換プロセスのために植物を調製する。
花の処理のためのナノコンジュゲート調製：２〜１２０ｎｍサイズ範囲のナノ粒子は処
置のために選択され、Derufusら(2007)に従って、直鎖DNAカセットおよびホーミングペプ
チド単位を用いて多官能化される。６５５または７０５ｎｍの発光極大を有し、ストレプ
トアビジンおよびアミノ基を用いて修飾された量子ドットを得る。ＱＤ濃度は、供給者に
よって提供される減衰係数を用いて、５９５ｎｍでの光学的吸収によって測定される。使
用される架橋剤は、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６−（３’−［２
−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）（Ｐｉｅｒｃｅ）およびスル
ホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート）（Ｓｉｇｍａ）である。アミノ修飾されたストレプトアビジン-
ＱＤは、架橋剤を用いて、ビオチン結合直鎖ＤＮＡカセットおよびホーミングペプチドに
コンジュゲートされる。ＱＤは、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４（１００ｋＤａカットオ
フ）フィルターを用いて、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
７．２に再懸濁される。架橋剤（１０００倍過剰）をＱＤに添加し、１時間反応させる。
サンプルは、１０ｍＭのＥＤＴＡを補足された類似の緩衝液にＮＡＰ−５重力カラム（過
剰の架橋剤を除去するため）上で濾過される。ペプチドは、典型的には、凍結乾燥粉末か
ら使用される。ペプチドおよび直鎖化ＤＮＡカセットは、濾過されたＱＤに添加され、一
晩４℃にて反応させる。３つのＡｍｉｃｏｎフィルターを用いて、生成物は、Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、高塩緩衝液（１．０Ｍ塩化ナトリウム、
１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）で２回、ＰＢＳでさらに２回濾過される。
高塩洗浄は、ＰＢＳ洗浄だけでは取り除かれない、静電的に結合されたＤＮＡおよびペプ
チドを除くために必要とされる。スルホ−ＳＭＣＣは、１つの末端に、アミド結合を形成
するために、アミノ修飾されたＱＤと反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）
エステルを有する。また、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰは、任意の１級アミン含有分子と急速
に反応して、安定なアミド結合を形成するアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨＳ）エステルを含む。
植物体形質転換およびＴ1抵抗性植物のスクリーニング：最終体積が２５０〜５００ｍ
Ｌの懸濁液は、ナノ粒子、ホーミングペプチドおよび直鎖ＤＮＡカセット（NHD）コンジ
ュゲート溶液を用いて作製され、次にシロイヌナズナ植物（大部分は、いくつかの受精し
た長角果を有する未成熟な花房）を処置に用いる。植物を浸漬する前に、０．０５％（２
５０ｕｌ／５００ｍl）〜０．００５％の濃度にしたＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７をＮＨｐＤ
コンジュゲート溶液に添加し、十分に混合する。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌し
ながら、ＮＨｐＤコンジュゲート溶液に２〜３０秒間浸漬される。処理された植物は、１
６〜２４時間、２２〜２４℃にてドームまたはカバー下に保持される。植物は、Ｃｏｎｖ
ｉｒｏｎに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収する。選択トレイ（１０．５’’
×２１’’×１’’トレイ）を用いて、バルク回収種子をＴ0植物からスクリーニングし
、各トレイでは約１０，０００個の種子がある。２つの対照を用いて、選択噴霧が正しく
行われたことを確認する、Ｃｏｌ−０負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照と
してＰＡＴ（ホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）選択可能なマーカーのため
に同型の種子でスパイクされたコロンビアＣｏｌ−０野生型。同期を達成するために、種
子は、植え付け前の４８時間、０．１％寒天溶液に層状化される。選択トレイあたり１０
，０００個の種子を与えるために、２００ｍｇの種子を０．１％（ｗ／ｖ）寒天溶液に添
加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスする。次に、層状化された種子は、Ｓｕ
ｎｓｈｉｎｅミックスＬＰ５で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Ｈｏａｇｌａｎ
ｄ溶液を用いて地下潅漑される。有効である選択噴霧について、４０ｍＬの懸濁された種
子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁殖ドームを各
選択トレイ上に配置し、先に言及した条件を用いた選択のために、種子を生育する。繁殖
ドームは、植え付け後の約５日で除かれる。苗木は、植え付け後の５日、さらに植え付け
、苗木噴霧後の１０日に、１塗布あたり２８０ｇ／ｈａグルホシネートの有効速度で送達
するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮された空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ
（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積中のグルホシネートアンモニウム（Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ
ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標）除草剤）の０．２％（ｖ／ｖ）溶液
（２０μｌ／１０ｍｌ ｄＨ２Ｏ）を用いて噴霧される。調製するためのＬｉｂｅｒｔｙ
（登録商標）の量は以下のように計算される：（７０３Ｌ／ｈａ噴霧体積＝２８０ＧＰＡ
）。（２８０ｇ ａｉ／ｈａ）×（１ｈａ／７０３Ｌ）×（１Ｌ／２００ｇ ａｉグルホ
シネート）＝０．２０％溶液（または２０μＬ／１０ｍＬ）。１０ｍＬの溶液は、噴霧さ
れるべき各トレイのために２０ｍＬシンチレーションバイアルにピペットで入れる。噴霧
は、水平および垂直の塗布パターンを用いて送達される。第２の噴霧後の４〜７日に、除
草剤抵抗性植物を同定する。
細胞壁を有する植物細胞に対象とする（of interest）分子を導入するための、ナノ粒
子および直鎖化核酸分子の使用のための方法および組成物が、本明細書中に記載される。
本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定的に形質転換された遺伝的に改変された繁殖
力のある植物を生産するために使用し得る。いくつかの実施形態では、官能化直鎖核酸カ
セット分子の特徴的な性質により、望ましくない核酸配列（例えば、限定はしないが、ベ
クターバックボーン配列）無しに、対象とする特定の遺伝子配列を送達することが可能に
なる。
本開示は、以下の［1］から［27］を含む。
［1］細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;
対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程；
細胞壁を有する上記植物細胞と上記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程；ならびに
細胞壁を含む上記植物細胞に上記ナノ粒子および上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。
［2］ナノ粒子が、上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用する官能基を含む、上記［1］に記載の方法。
［3］ナノ粒子が、ストレプトアビジンQD共役ナノ粒子である、上記［2］に記載の方法。
［4］さらに、細胞壁を含む上記植物細胞の区画に、上記ナノ粒子の取り込ませる工程を含む、上記［1］に記載の方法。
［5］さらに蛋白質を標的とする細胞内区画で上記ナノ粒子を被覆する工程を含む、上記［4］に記載の方法。
［6］上記区画が、細胞質ゾル、核、液胞膜、プラスチド、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔からなる群から選択される、上記［5］に記載の方法。
［7］細胞壁を有する上記植物細胞が、商業作物種から植物細胞である、上記［1］に記載の方法。
［8］上記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、菜種、菜種、綿、ヤシ、落花生、ダイズ、イネ属、シロイヌナズナ属、トウゴマ属、およびサトウキビの細胞からなる群から選択される、上記［7］に記載の方法。
［9］上記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、および茎からなる群から選択された組織由来のものである、上記［7］に記載の方法。
［10］細胞壁を有する上記植物細胞が培養細胞である、上記［1］に記載の方法。
［11］上記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子、量子ドット、正に帯電したナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆されたナノ粒子、多孔質粒子、メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマーナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア（nanocores）、ナノスフェア、ナノロッド、および磁性ナノ粒子からなる群から選択される上記［1］に記載の方法。
［12］上記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、上記［11］に記載の方法。
［13］半導体ナノ粒子が、量子ドットである、上記［12］に記載の方法。
［14］上記ナノ粒子が、金ナノ粒子である、上記［11］に記載の方法。
［15］さらに、上記ナノ粒子の表面を誘導体化する工程を含む、上記［1］に記載の方法。
［16］上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、上記［1］に記載の方法。
［17］上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、遺伝子を含む、上記［16］に記載の方法。
［18］上記遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、上記［17］に記載の方法。
［19］上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、核酸配列のPCR増幅から得られる、上記［1］に記載の方法。
［20］核酸配列が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される核酸分子から得られる、上記［19］に記載の方法。
［21］さらに上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を安定的に組み込んだ細胞を選択する工程を含む、上記［16］に記載の方法。
［22］上記選択した細胞が、再生可能な細胞である、上記［21］に記載の方法。
［23］さらに再生可能な細胞から植物細胞を再生する工程を含む、上記［22］に記載の方法。
［24］植物材料に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
植物細胞、植物組織、植物からなる群から選択される植物材料を提供する工程;
ナノ粒子を提供する工程;
対象とする官能化直鎖核酸カセット分子で上記ナノ粒子を被覆する工程；
細胞壁を有する上記細胞と上記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程；
上記植物材料に上記ナノ粒子および上記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。
［25］上記植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根、花、種子、さや、および茎からなる群から選択される植物組織である、上記［24］に記載の方法。
［26］植物へ形質を移入するための方法であって、
植物細胞を提供する工程;
官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用し得るナノ粒子を提供する工程;
植物において形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程;
上記植物細胞と上記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;
上記植物細胞に上記ナノ粒子および上記植物において上記形質を発現させるための手段を取り込ませる工程;
上記形質転換植物細胞から植物全体を再生させる工程、および
上記植物を繁殖させる工程を含む、方法。
［27］上記形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤耐性、害虫抵抗性、細菌性の病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性からなる群から選択される、上記［26］に記載の方法。



Claims (27)

  1. 細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であ
    って、
    細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;
    対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程；
    細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程；
    ならびに
    細胞壁を含む前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセ
    ット分子を取り込ませる工程
    を含む、方法。
  2. ナノ粒子が、前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用する官能基を含む
    、請求項1に記載の方法。
  3. ナノ粒子が、ストレプトアビジンQD共役ナノ粒子である、請求項2に記載の方法。
  4. さらに、細胞壁を含む前記植物細胞の区画に、前記ナノ粒子の取り込ませる工程を含む
    、請求項1に記載の方法。
  5. さらに蛋白質を標的とする細胞内区画で前記ナノ粒子を被覆する工程を含む、請求項4
    に記載の方法。
  6. 前記区画が、細胞質ゾル、核、液胞膜、プラスチド、エチオプラスト、有色体、白色体
    、脂肪体、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の内腔からなる
    群から選択される、請求項5に記載の方法。
  7. 細胞壁を有する前記植物細胞が、商業作物種から植物細胞である、請求項1に記載の方
    法。
  8. 前記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、菜種、菜種、綿、ヤシ、落花生、
    ダイズ、イネ属、シロイヌナズナ属、トウゴマ属、およびサトウキビの細胞からなる群か
    ら選択される、請求項7に記載の方法。
  9. 前記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根、花、種子、さや、お
    よび茎からなる群から選択された組織由来のものである、請求項7に記載の方法。
  10. 細胞壁を有する前記植物細胞が培養細胞である、請求項1に記載の方法。
  11. 前記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子、量子ドット、正に帯電したナノ粒子、金ナノ粒子、
    金被覆されたナノ粒子、多孔質粒子、メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマー
    ナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア（nanocore
    s）、ナノスフェア、ナノロッド、および磁性ナノ粒子からなる群から選択される請求項1
    に記載の方法。
  12. 前記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、請求項11に記載の方法。
  13. 半導体ナノ粒子が、量子ドットである、請求項12に記載の方法。
  14. 前記ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項11に記載の方法。
  15. さらに、前記ナノ粒子の表面を誘導体化する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  16. 前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子か
    らなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
  17. 前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、遺伝子を含む、請求項16に記載の方法
    。
  18. 前記遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、
    請求項17に記載の方法。
  19. 前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、核酸配列のPCR増幅から得られる、請
    求項1に記載の方法。
  20. 核酸配列が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染
    色体からなる群から選択される核酸分子から得られる、請求項19に記載の方法。
  21. さらに前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を安定的に組み込んだ細胞を選択す
    る工程を含む、請求項16に記載の方法。
  22. 前記選択した細胞が、再生可能な細胞である、請求項21に記載の方法。
  23. さらに再生可能な細胞から植物細胞を再生する工程を含む、請求項22に記載の方法。
  24. 植物材料に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、
    植物細胞、植物組織、植物からなる群から選択される植物材料を提供する工程;
    ナノ粒子を提供する工程;
    対象とする官能化直鎖核酸カセット分子で前記ナノ粒子を被覆する工程；
    細胞壁を有する前記細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程；
    前記植物材料に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取
    り込ませる工程
    を含む、方法。
  25. 前記植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根、花、種子、さや、お
    よび茎からなる群から選択される植物組織である、請求項24に記載の方法。
  26. 植物へ形質を移入するための方法であって、
    植物細胞を提供する工程;
    官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用し得るナノ粒子を提供する工程;
    植物において形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程;
    前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;
    前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記植物において前記形質を発現させるための手
    段を取り込ませる工程;
    前記形質転換植物細胞から植物全体を再生させる工程、および
    前記植物を繁殖させる工程
    を含む、方法。
  27. 前記形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤耐性、害虫抵抗性、細菌
    性の病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵
    抗性からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
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