RU1820914C - Способ получени двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине - Google Patents

Abstract

Использование: генетическа  инженери , в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактат- ринтетазу, устойчивую к гербициду. Сущность изобретени : конструируют рекомби- нантные плазмидные. ДНК, кодирующие мутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети Brassica, или картофел , или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника , или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры, провод т культивирование каллусной ткани и получают регене- ранты, устойчивые к гербициду. 14 табл. ел

Description

Изобретение относитс  к генетической инженерии, а частности к получению фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, устойчивую к гербициду. . Сульфометуронметил и хлорсульфурон ингибируют рост некоторых бактерий, дрожжей и высших растений путем ингиби- ровани  ацето актдтсинтазы (АЛС), первый общий фермент в биосинтезе аминокислот (валин, лейцин и изолейцин)с разветвленной цепью. Три основных изофермента АЛ С, обозначенные I, II и III, идентифицированы в кишечных бактери х. Изоферменты I и III, но не II,  вл ютс  чувствительными к инги- бированию конечного продукта валином. Каждый из трех бактериальных изоэнзимов содержит большую и малую субъединицы белка. Энзимы АЛ С из дрожжей Saccharo- myces cerevlslae и из некоторых высших растений частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибировани  конечного продукта. Неизвестно, состо т ли энзимы АЛС.дроссей и растений из одного или более различных полипелтидов. Данные дают основание предполагать, что местоположение энзимов АЛ С дрожжей и растений находитс  соответственно в митохондри х и хлоропластах.

Известно выделение генов, кодирующих энзимы АЛ С из кишечных бактерий Salmonella typhimurium и Escherichla coll. a также дрожжей S.cerevlsiae. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих две субъединицы изоэнзимов I. II и III АЛ С E.cpll, показывают, что они организованы как опероны HvBN. llvGM и ilvlH соответственно . Сравнение выведенных аминокислотных .последовательностей больших

00

ю

О О

СА

субъединиц изоэнзимов АЛС E.coli показывают три участка, содержащих приблизительно 50% консервативных аминокислот, на приблизительно 2/3 состо щих из бел- -ков и разделенных участками с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокислотные последовательности встречаютс  также и среди малых субъединиц бактериальных изоферментов. В дрожжах S.cerevislae был идентифицирован единственный ген ILV2, кодирующий активность АЛС. Анализ нук- леотидной последовательности гена ILV2 вы вил, что полипептид, кодируемый им, гомологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Аминокислотна  последовательность АЛС дрожжей характеризуетс  такой же структурной организацией и степенью гомологии, котора  наблюдаетс  между большими субъединицами бактериальных изоферментов, за исключением того, что около дев носта аминокислот в аминоконце дрожжевого белка обеспечивают перенос белка в митохондрию . Ранее не было никакой информации относительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последовательности энзимов АЛС растений.

Изофермет I кишечных бактерий представл ет собой единственную известную АЛС в природе, котора   вл етс  нечувствительной к ингибированию сульфометурон- метилом и хлорсульфуроном. Поэтому кишечные бактерии чувствительны к этим гербицидам только в присутствии валика, который иншбирует изофермент I. Идентифицированы сульфонилмочевинные герби- цидустойчивые мутантные формы кишечных бактерий Salmonella typhlmurlum и E.coli (отобранные в присутствии валина), дрожжей S.cerevislae и высших растений Nlcotiana tabacum (табак), Arabldopsls thaliana и Zea mays (кукуруза) .Эти мутантные фенотипы совместно расщепл ютс  к гербицидустойчивым формам АЛС посредством генетических кроссов. BS.typhimu- rium гербицидустойчивые мутации св заны с геном, кодирующим АЛС, а в E.coli и S.cerevislae эти мутации заключены в структурных генах дл  АЛС. В высших растени х мутации, ответственные за устойчивость, наследуютс  как единственные доминантные или полудоминантные  дерные признаки . В табаке эти мутации картируютс  по одному из двух несцепленных генетических локусов. Хот  многие гены, вовлеченные в структуру и функцию дифференцированных растительных тканей и органов, не экспрес- сируютс  в недифференцированных ткан х , те, которые участвуют в основных клеточных функци х, экспрессируютс  и могут быть отобраны в дезорганизированном

каллюсе или культуре клеточной суспензии. Это демонстрировалось во многих случа х путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растени , экспрессирующие такой же фенотип.

Известен способ получени  двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочеви- не, предусматривающий получение суспен- зионных каллусных культур, отбор клеток,

культивирование каллуса и получение регенёрантов , устойчивых к гербициду.

Поскольку ацетолактатсинтетаза представл ет собой энзим, вовлеченный в аминокислотный биосинтез, было продемон5 стрировано, что гены, кодирующие этот фермент , экспрессируютс  в каллюсовой ткани так же, как и в целом растении. Мутанты табака S4, СЗ и Нга. устойчивые к сульфо- нилмочевине и описанные в этом патенте,

0 вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы в целые растени , в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом. Каллюсные ткани, происход щие от регене5 рированных растений или их потомства, продолжают расти при концентраци х гербицида , которые ингибируют рост кал л юса дикого типа. Таким образом, устойчивость к гербициду на основе сульфонилмочевины

0 на клеточном.уровне растений указывает на устойчивость на уровне целого растени .

Существуют ограничени  дл  получени  гербицидустойчивых сельскохоз йственных растений посредством тканевой культу5 ры или обработки сем н мутагеном: 1) метод культуры тканей ограничен теми культурами растений, которые могут подвергатьс  манипулированию в тканевой культуре и регенерации из тканевой культуры, 2) растени ,

0 происход щие от обработанных мутагеном сем н и может быть из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют отщеплени  многочисленных генетических обратных скрещиваний и

5 3) перенос устойчивого гена путем размножени  был бы ограничен культурными сортами одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществлени  многократных генетических обратных скрещиваний. Поэтому выде0 ление фрагмента нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость , и его последующее введение в сельско- хоз йственные культуры посредством генетической трансформации позвол ет осу5 ществить быстрый межвидовой перенос гер- бицидной устойчивости и устранить многие из указанных ограничений.

Многие гены, выделенные из одного растени , были введены и экспрессированы в других растени х, нерастительные гены

были экспрессированы в растени х только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерасгительных генов были сплавлены с растительными регул - торнымй последовательност ми, необходимыми дл  экспрессии генов. Однако было бы трудно ввести гербицидную устойчивость в растени  путем введени  химерных генов, состо щих из бактериальных или дрожжевых генов, кодирующим гербициду- стойчивую форму АЛ С, поскольку а) эти микробные АЛОэнзимы, как полагают, не содержат специфической сигнальной (транзитной ) пептидной последовательности, необходимой дл  ввода в растительные хлоропласты, представл ющие собой клеточное местоположение растительной АЛ С, б) бактериальные изоферменты состо т из двух различных полипептидных субъединиц и в) микробные АЛС-ферменты не могут функционировать оптимально в чужеродной клеточной среде высших растений. Следовательно , Существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛ С и которые придают гебицид- ную устойчивость, когда они введены в гербицидчуветвительные растени .

Предлагаетс  использование фрагмен та нуклеиновых кислот, кодирующего ацето- лактатсинтетазу растений, встроенного в конструкцию нуклеиновых кислот, используемую дл  трансформации растений/содержащих ацетб актатсинтетазу дикого типа, которые  вл ютс  чувствительными к гербицидному соединению сульфонилмоче- вины, причем указанный фрагмент нуклеиновых кислот имеет по крайней мере одну точковую мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислот дикого типа, кодирующего аце- толактатсинтётазу растений таким образом, что при трансформации указанной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение приобретает устойчивость к внесению гербицидного соединени  сульфонилмочевины.

Сущность изобретени  состоит в следующем .

Получение фрагментов ДНК, кодирующих гербицидустойчивую АЛС.

Каллюснеые культуры чувствительного к гербициду табака (Nicotfana tabacum, разновидность Xonthl) подвергают воздействию сульфометуронметила при 2 ч. на млрд. Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные СЗ и S4. Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что кажда  из линий СЗ и S4 несет единственную полудоминантную  дерную генную мутацию , отвечающую за признак

устойчивости к гербициду, а также то. что мутации СЗ и S4 не св заны генетически, т.е. наход тс  в различных генах, обозначенных SURA и SURB соответственно. Как локазы- 5 вает анализ, линии СЗ и S4 продуцируют активность энзима АЛС, в 100 раз более устойчивого к сульфонилмочевинным герби- цидам-хлорсульфурону и сульфометуронме- тилу, чем АЛС дикого типа. Устойчивость АЛС

0 к гербициду в генетических кроссах выдел етс  вместе с устойчивостью к ингибирова- нию роста гербицидами. Наблюдение двух различных генов, которые мутировали с образованием гербициду- стойчивой АЛС, не

5 было неожиданным, поскольку N.tabacum, как полагают, представл ет собой аллотет- раплоид,образованный из N-tomentosfformls и N.sylvestris. по существу содержащих два полных генома. Так, каж0 да  клеточна  лини  СЗ и S4 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Клеточную линию S4 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ч. на млрд., избирательна  концентраци  которого пол5 ностью ингибирует рост S4. Идентифицируют клеточные линии, устойчивые к 200 ч. на млрд., одну такую линию обозначают Нга. Испытани  показывают, что Нга выдерживает концентрации сульфомету- ронметила,

0 которые в 1000 раз выше, чем те/которые требуютс  дл  полного ингибировани  роста каллюса дикого типа. Как показывает анализ , лини  Нга кросс устойчива к хлорсульфурону. Растени  регенерируют из

5 каллюсных культур Нга. Генетический анализ растений показывает, что мутации Нга и S4 св заны, что говорит о том, что лини  Нга содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительной линии S4. Определ ют ак0 тйвность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растени х табака гомозиготного мутанта Нга. Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Нга приблизительно в 1000 раз-более устойчива к хлорсульфурону,

5 чем активность растений дикого типа.

Дл  того, чтобы клонировать устойчивый к гербициду ген АЛС, ДНК табака выдел ют из гомозиготной мутантной линии S4 Nlcotiana tabacum. Порции по 50 г кал л юс ной

0 ткани замораживают в жидком N2 и затем лиофилизуют, Полученную высушенную ткань потом измельчают при температуре около 23°С в мешалке с использованием 15- секундных импульсов до превращени  в по5 рошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора (Oi3M сахарозы у 50 мМ трис-НС1 рН 5, 5 мМ MgCla) прибавл ют к смеси и полученную суспензию инкубируют при 0°С в течение 5 мин. Суспензию фильтруют че- рёэ марлю и центрифугируют при 350 х g в

течение 10 мин. Ядерный осадок в виде гранул ресуспендируют в лизисном буферном растворе (20.мМ ЭДТК, 50 мМ трис-ЧНС рН 8, t % Sarkosyl), прибавл ют CsCI с получением 0,95 г на мл буферного раствора и полученную смесь центрифугируют при 17000 х g в течение 20 мин при 4РС. ЭТидий бромид прибавл ют к полученному супер- натанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломлени  регулируют до 1,39 и полученный раствор центрифугируют при 90000 х g в роторе типа Beckman TI 70 при 20°С в течение 3 суток. .Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепл ют от градиента и обрабатывают изопропанолом дл  экстрагировани  этидий бромида, В заключение ДНК диализуют против буфера ТЕ и осаждают путем прибавлени  этанола.

Из этой ДНК получают геномнуюбибли- отеку Nicotiana следующим образом, использу  л мбда-вектор фага EMBL4. Фаг ЕМBL4 получают из биомассы с агарозных чашек. Получают фаговую ДНК путем кон- центрировани  фага полиэтиленгликолем, удалени  полиэтиленгликол  хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина. Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезок- сирибонуклеазой и«рибонуклеазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этанола. Дл  получени  плеч фага EMBL4 фаговую ДНК псоледовательно гид- ролизуют эндонуклеазами Sal I и Bam HI. Плечи отжигают и затем отдел ют от цент- рального фрагмента на 10-40%-ном саха- розном градиенте. Плечи:полностью денатурируют и повторно .отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную описанным образом, частично обрабатывают эндонуклеазой SAU3A и осаждают посредством градиента 10-40 %- ной сахарозы. Фракции от сахарозного гра- дие.нта затем анализируют электрофорезом на 0,5%-ых агарозных гел х. Фракции, со- держащие фрагменты в диапазоне размеров 20-40 кб, диализуют, осаждают и липируют к плечам ДНК л мбда-фага. ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на мл вектора и 45 мкг на мл вставки ДНК. Пол- ученные лигированные контактамеры затем упаковывают с использованием экстрактов упаковки.л мбда-ДНК. Выход фага составл ет приблизительно 4,5 х 10 фагов на мкг вставки ДНК, Конструируют библиотеку из приблизительно 400000 фагов, представл ющую примерно 99%-ную полную библиотеку дл  табака, котора  имеет приблизительно геномное содержанием 1,65 пикограммов или 1,52 х 10 пар оснований.

Полученную фаговую библиотеку ДНК Nicotiana выращивают и высевают на чашки на штамме LE392 „E.coli (АТСС 33572). Фаги высевают на чашки с получением 2000-5000 п тен на 90 мм чашках Петри или 50000 п тен на 150 мм чашках Петри. Вслед за переносом фаговрй ДНК к нитроцеллюлоз- ным фильтрам последние предварительно гибридизируют путем инкубировани  в течение приблизительно 4 ч при 56°С в б х SSPE, содержащем 0,5% SDS, 100 мкг на мл денатурированной ДНК тел чьего тимуса и 10 х раствора benhardt. На этой стадии прибавл ют свежую аликвоту гибридизирован- ного раствора вместе с приблизительно 108 отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию провод т в течение 24-48 ч при 56°С. В этот момент фильтры вначале промывают в течение приблизительно 4ч в6х55РЕпри56°С, затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2 х SSPE при температуре около 23°С. Затем фильтры сушат и подвергают воздействию ретгеновской пленки Kodak XAR и усиливающего экрана Du Pont Cronex®Lightning Plus™ при -70°С в течение 2 дней. Открытые места на пленке указывают положение п тен, потенциально содержащих гены АЛС Nicotiana.

Полученные авторадиограммы затем Ориентируют над первоначальными, бакте- риофагсодержащими чашками Петри. С использованием широкого конца стерильной пастеровской пипетки вырезают п тна, соответствующие наиболее темным местам на авторадиограммах. Собранные п тна затем элюируют в буфер SM и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Кажда  чаш- .ка получает около 100-200 фагов. Затем повтор ют полный процесс определени  местоположени  фагов, использу  вновь приготовленный зонд. Таким образом повтор ют стадии определени  местоположени  и выделени  фагов до тех пор, пока большинство п тен не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способную гибридиэировэтьс  к зонду гена АЛС дрожжей.

Выдел ют мини-препараты ДНК из очищенного от п тен фага, обозначенного Nt А13. Продукты переваривани  мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционной эн- донуклеазы EcoRI подвергают электрофорезу через 0,7% агзрозные гели и блоттингу на нитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена. Фрагменты, способные гибридизироватьс  е зондом, затем выдел ют и субклонируют в векторы pBR322,

M13mp9 или M13mp18. Эти фрагменты далее секвенируют с использованием олигонуклео- тидных праймеров методом дидезокси-тер- минировани  цепи. Используют комплект приборов, поставл емый New England Blolabs. Использование синтетических олиго- нуклеотидных праймеров позвол ет осуществить раст жение ДНК-последовательности вдоль клонированного фрагмента в перекрывающихс  сегментах. С помощью ЭВМ-анализа последовательности ДНК идентифицируют открытую рамку считывани  667 кодов . Выведенна  аминокислотна  последовательность этой открытой рамки считывани  в основном гомологична последовательност м , ранее определенным из гена ILV2 Saccharomyces cerevislae и гена HvG E.colf, что указывает на то, что фрагмент ДНК, восстановленный из геномной библиотеки Nfcotiana, содержит ген АЛС табака. Дл  того, чтобы определить, кодирует ли этот ген АЛС гербицидчувствительный энзим дикого типа или мутантный гербицидустойчивый энзим из линии 54, ген ввод т в гербицид- чувствительный табак дикого типа путем трансформации, опосредственной Agrobac- ferlum tumefacfens,

. Требуетс  генетический маркер дл  отбора трансформированных растительных клеток. Используют устойчивость к антибиотику G-418, получаемую в результате того, что бактериальный ген NPT 11, кодирующий неомицинфосфотрансферазу. экспрессиру- етс  в растени х. Дл  осуществлени  экспрессии NPT 11 регул торные последовательности растений синтезируют с участком кодировани  NPT 1.1 в векторе pKNK. Вектор pKNK происходит от часто используемой плазмиды pBR322 в результате отщеплени  сайтов Hind III и Bam Ht и вставки в сайт Cla I фрагмента Cla I (приблизительно, 2,3 кб), который состоит из следующих компонентов:

а) последовательность Cla l-Bgl И длиной 320 пн, содержаща  промоторный участок гена неомицинфосфотрансферазы (NRT II) транспозона Тп 5, происход щего в результате преобразовани  сайта Hind 111 в сайт Cla I;

б) последовательность SaU 3A-Pst I длиной 296 пн, содержаща  промотор нопалинсинтазы (NOSP), происход щий от гена нопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды -263 до +33), относительно сайта начала транскрипции , путем создани  сайта Pst I кодона инициации;

в) последоватеьнрсть Hind UI-Bam Hf длиной 998 пн, содержаща  кодирующую последовательность дл  гена NRT 11. происход щего от Тп 5, путем создани  сайтов

Hind lit и BamH I у нуклёотидов 1540 и 2518, соответственно;

г) последовательность BamH -1-Cla I длиной 702 пн, содержаща  З1 -участок гена 5 нопалинсинтазы (нуклеотиды 848-1550).

Нуклёотидна  последовательность у сли ни  NOSP и кодирующей последовательности NPT И выгл дит следующим Образом: последовательность NOS

10 последовательность NPT If ... ...

AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGA TCGTTCGC ATG ... ...

Pstl Hind III

Вектор pKNK расщепл ют рестрикцион5 ным энзимом Sal I (BRL), полученный линейный вектор после экстракции фенолом соедин ют в присутствии ДНК-лигазы Т4 с очищенным фрагментом Sal I (2,1 кб), несущим бактериальный ген неомицинфосфот0 рансферазы I (NPT I) в качестве селектируемого маркера дл  бактериальной устойчивости к канамицину. Лигазную смесь используют дл  трансформации компетентных клеток НВ101 Е.соН, и трансформанты се5 лектируют на чашках, содержащих 100 мг/л канамицина. Полученную рекомбинантную плазмиду, обозначенную pKNKS, подвергают очистке.

Плазмиду pKNKS расщепл ют рестрйк0 ционным энзимом Ёсо Rl (BRL) и ее концы затупл ют фрагментом Кленова (BRL|. Полученную линейную ДНК соедин ют в присутствии ДНК-лигазы Т4 (New England Blolabs) с фосфорилированными линкерами

5 Bgl II. Вслед за экстенсивным перевариванием рестрикционным энзимом Bgl II (BRL) дл  удалени  избыточных линкеров ДНК пропускают через колонку гель-фильтрации Сефадекс G-150 (очищенный) с тем, чтобы

0 отделить ее от линкеров. Фрагмент ДНК выдел ют и обьем регулируют с получением концентрации ДНК около 78 мкг/мл. 1 мкл ДНК еамолигируют в присутствии ДНК-лигазы Т4 в общем объеме 5 мкл и используют

5 дл  трансформации компетентных клеток 1 НВ101 E.coli. АмпицИллинустойчивые клетки содержат плазмиду pKNKSG, котора  идентична плаэмиде pKNKS за исключением того, что рестрикционный сайт EcoRl за0 мещен сайтом Bgl II..

Фрагмент Sma I фага №А13 содержит . участок, который гибридизируетс  к дрожжевому гену АЛС. Фаг NtA13 частично переваривают рестрикционным энзимом Sma I и

5 вслед за экстракцией фенолом присоедин ют к фосфорилированным линкерам BamH I в присутствии ДНК-лигазы Т4. После гидролиза BamH J и удалени  избыточных линкеров путем электрофореза на агарсзном геле рестрикционный фрагмент BamH I (16 кб).

содержащий АЛС-ген табака от фага NtA13, выдел ют из гел  электроэлюированием и используют дл  дальнейшего клонирова- ни .

Вектор pKNKSG линеаризуют рестрик- ционным энзимом Bgl II (BRL) и вслед за дефосфррилированием кишечной фосфата- зой теленка его присоедин ют в присутствии ДНК-лигазы Т4 к рестрикционному фрагменту (16 кб) ВатН 1, происход щему из фага NtAtS. Лигазную смесь используют дл  трансформации компетентных клеток ИВ 101 Е.соН и отбирают ампициллинустой- чивые трансформанты, которые содержат рекомбинантную плазмиду, обозначенную plV13. Ориентаци  фрагмента-вставки в p)V13 такова, что рамки считывани  гена NOS:NPTII в векторе и гена АЛС во вставке наход тс  в противоположных направлени х . После очистки трем  штриховыми разводками одной колонии НВ101 (plV13) используют дл  трехродительского скрещивани . 3 мл ночных культур НВ101 E.colt (P.1V13) и НВ101 Е.соН (pRK2013) (номер АТСС 37159) в среде LB, содержащй 25 мг/л канамицина, выращивают при 37°С, а GV3850 Agrobacterlum tumefaclehs - в среде LB при 28-29°С. Клетки собирают при ком-, натной температуре в клинической центрифуге , промывают один раз в стэеде LB, не содержащей лекарства, собирают и ресус- пендируют в 3 мл LB, 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь перенос т на миллипоровый фильтр (2,5см HAWP, 0,45 мкм), помещенный на поверхности трех фильтров из ватманской бумаги № 1 в чашке Петри. После того, как вс  жидка  среда абсорбирована ватманским фильтром (около 30 мин), миллипоровый фильтр с бактери ми на его верхней поверхности кладут (сторона с бактери ми показывает наверх) на чашку со средой LB без лекарства. После инкубировани  в течение ночи при 28-29°С миллипоровый фильтр перенос т к 5 мл 10 мМ раствора MgS04 и завихр ют с тем/чтобы ресуспен- дировать бактерии в растворе. 0,1 мл алик- воты высевают на чашки с селективной средой чашки с минимальной средой М9, содержащей 20% сахарозу, 1 мМ MgSO/i. 1 мМ CaCte и 1 мг/мл канамицина (Sigma). Через примерно 4 дн  инкубировани  при 28-29°С про вл ютс  несколько больших колоний. Очищают несколько трансконъю- гантов трем  последовательными штриховым разводками (одноколониевыми) на тех же селективных чашках. Ожидают рост только Agrobacterlum, содержащих плазмиду plV13, вновь объединенную с эндогенной плазмидой pGV3850 за счет их общих последовательностей pBR322. Это подтвердилось анализом Southern перед использованием изготовленной Agrobacterium, GVKNT13 дл  трансформаций растений.

Дл  трансформации растительных клеток следуют стандартным асептическим методикам дл  манипул ции стерильными средами и аксенными растительно-бактериальными культурами, включа .использова0 ние колпака с ламинарными потоками дл  всех переносов. Составы сред представлены в примере 6, Консервированные растени  табака дл  заражени  листовых пластин выращивают в растильне: 12 ч при дневной

5 температуре 24°С и 12 ч при ночной температуре 20°С, относительной влажности около 80%, смешанном свете флуоресцентного и накаленного свечени . Осуществл ют заражение листовых пластин табака.

0 Молодые листь , не полностью распустившиес  и имеющие приблизительно 4-6 дюймов (101,6-152Ямгм) в длину, собирают скальпелем с растений табака (Nicotlana tabacum, разновидность Xanthl) приблизи5 тельно 4-6-недельного возраста. Листь  поверхностно стерилизуют в течение 30 мин погружением их в около 500 мл 10%-го Chlorox, 0,1%-го раствора додецилсульфата натри  и затем промывают 3 раза стериль0 ной деионизированной водой. Листовые пластины диаметром 6 мм получают из целых листьев с помощью стерильного бумажного пуансона.

Листовые пластины инокулируют погру5 жением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры (разбавление 1:10) Agrobacterium, несущей плазмиду GCKNT13. Выращивание культуры Agrobacterlum начинают инокулированием 10 мл бульона YEB

0 единственной бактериальной колонией, удаленной из чашки со средой R-arapa. Культуру выращивают приблизительно 17-20 ч в 18 мл стекл нных пробирках с культурой в качалке с платформой New Brunswick, под5 держива  температуру 28°С.

После икокулировани  листовые пластины помещают на чашки Петри, содержащие среду агара CN. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанных

0 флуоресцентном и Cro and Sho освещени х дл  растений в течение 2-3 дней в камере дл  выращивани  культур, где поддерживаетс  температура около 25°С.

Чтобы избавитьс  от листовых пластин

5 Agrobacterlum и отобрать дл  выращивани  трансформированных клеток табака, листовые пластины перенос т на свежую CN-cpe- ду, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохран ют в виде замороженного 100 мг/мл основного раствора и прибавл ют асептически (стерилизуют через 0,45-микрометровый фильтр) к средам после автоклавировани . . Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготавливают дл  каждого использовани  и стерилизуют через фильтр, пропуска  его в аетоклавированные среды.

Листовые пластины инкубируют в описанных услови х в течение 3 недель и затем перенос т на свежие среды такого же состава .

Приблизительно через 1-2 недели всходы , развивающиес  на среде, содержащей кзнэмицин, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде А, содержащей либо 100 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо 100 мг/л канамицина. До истечени  3 недель регистрируют корнеобразование на селективной и неселективной средах.

В течение 2 недель посева удал ют маленькие листь  с подрезанных проростков дл  определени  уровней устойчивости к хлорсульфурону и канамицину в проводимом испытании на каллюсовую индукцию на селективных средах. Дл  индуцирована образовани  кал л юс а отрезают маленькие листь / которые разрезают, на несколько участков с помощью скальпел  и засевают в В-среду, содержащую либо 10 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо 50 мг/л канамицина. До истечени  3 недель регистрируют кэллю- совой рост на селективной или неселективной средах.

Приведенные в табл.1 результаты указывают На то, что трансформаци  табака была достигнута с помощью штамма CVKNT13 на основе получени  канамицину- стойчивого каллюса. Канамицинустойчивый кал л юс остаетс  чувствительным к сульфо- нилмочевинному гербициду хлорсульфурон. что означает, что ген АЛС, выделенный из мутанта S4 табака в фаге Nta 13, кодирует гербицидчувствительный энзим дикого типа . Этот ген АЛС растений использовалс  в качестве зонда гибридизации ДНК дл  выделени  других растительных АЛС генов, включа  гены, которые кодируют гербици- дустойчивую АЛС.

Геномную библиотеку ДНК из мутанта Нга табака конструируют в бактериофаге л мбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируютс  к гену АЛС табака дикого типа из мутанта S4. Выдел ют несколько фаговых клонов. Физическое картирование ДНК-вставок табака с использованием рестрикционных зндонуклеаз вы вл ет присутствие двух различных классов фрагментов ДНК, представл ющих два гена АЛС: SURA и SURB. Сравнение физических карт генов SURA и SURB N.tabacum

с картами от прародительских видов показывает , что ген SURA происходит от N.sylvectrls, а ген SURB происходит от N.tomentoslformis. Ген АЛС дикого типа, вы- 5 деленный ранее из мутанта S4. обозначают SURA. Генетическое сцепление гербициду- стойчивой мутации высокого уровн  е Нга с мутацией S4 показывает, что мутаци  Нга наблюдаетс  в том же гене АЛС. что и мута- 0 ци  S4, а именно в SURB. Следовательно, ожидаетс , что ген SURB, выделенный из мутанта Нга, должен быть мутантным геном, обозначенным SURB-HRa и кодирующим гербицидустойчивую АЛС. Выбирают один

5 фаговый клон, содержащий ген SURB-Hra, дл  дальнейшего анализа. Этот фаговый клон, обозначенный 3, депонирован в Американской коллекции типовых культур, Рок- вилл, Мэрилэнд, под каталожным номером

0 АТСС 40237. фаговый клон переваривают рестрикционной эндонуклеазой Spe I с получением ДНК-фрагмента (8,3 кб), который вставл ют в сайт ХЬа I плазмиды рМис19, и полученную рекомбинантную плазмиду

5 pAGS148 депонируют в Американской коллекции типовых культур, Рок вилл, Мэрилэнд , под каталожным номером АТСС 67124. Плазмиды pAGS148 и pAGS135 лиги- руют одну с другой, как описано ниже, и

0 полученную рекомбинантную плазмиду PAGS152 вставл ют в LRA . 4404 Agrobacterium tumefacfens. Полученную LBA 4404 (pAGS152) Agrobacterium tumefaciens депонируют в Американской

5 коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 67126. .

Геномную библиотеку ДНК из мутанта СЗ табака конструируют в бактериофаге л мбда и подвергают скринингу на клоны,

0 которые гибридизируютс  с ранее выделенными генами АЛС из табака, несколько фаговых клонов выдел ют, после чего ДНК-вставки табака физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Иден5 тифицируют два различных типа фрагментов ДНК, соответствующих гену SURA-C3 и гену SURB. Дл  дальнейшего анализа отбирают два фаговых клона, обозначенных 35 и 38 и несущих ген SURA-C3.

0 Фаговый клон 35 переваривают рестрикционными эндонуклеазами Spe I и Sal I с получением фрагмета ДНК (6,3 кб). Этот фрагмент ДНК вставл ют в плазмидный вектор pUC119, переваренный рестрикционны5 ми эндонуклеазами ХЬА I и Sal I, и полученную рекомбинантную плазмиду pALS35 депонируют в АТСС, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 67424.

Кроме четырех генов АЛС табака, а именно SURA и SURB. кодирующих гербицидчувствительные АЛС дикого типа, и SURA-C3 и SURB-Hra, кодирующих мутан- тную гербицидустойчивую АЛС, гены АЛС выдел ют из Arabidopsls thaliana, Beta vulgaris (свекла сахарна ) и часть гена АЛС выдел ют из Zea mays (кукуруза). Последние гены АЛС из гербицидчувствительных растений получают из геномных библиотек ДНК, сконструированных в бактериофаге л мбда скринингом на ДНК, гибридизирую- щуюс  с ранее выделенным геном АЛС из дрожжей или табака. Ген АЛС дикого типа из сахарной свеклы выдел ют в фаге, обозначенном Ф21, и физически картируют ре- стрикционными эндонуклеазами. Плазмида pBALS216 депонирована в АТСС, Рок-вилл,- Мэрилэнд, под каталожным номером 67425. Гены, кодирующие гербицидустойчи- вые энзимы АЛС, выделены из спонтанных мутантов дрожжей, устойчивых к сульфо- нилмочевине. Секвенирование этих генов показывает, что молекул рную основу устойчивости составл ют изменени  в основных парах, привод щие к аминокислотным замещени м в 10 различных положени х в белке (табл.2), имено остатки 121, 122, 197, 205,256,359,384,588,591,595. - В шести из этих положений, а именно 122,197, 205,256,384 и 591 (табл.2), получают более чем одно з амещение.- придающёе гердицидную устойчивость. В положении 122 остаток аланина присутствует во всех известных энзимах АЛ С дикого типа за исключением изоэнзйма | E.coll, в котором остаток 122 замещен на аспарагиновую кислоту, пролин, треонин или валин, что приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 197. остаток пролина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа за исключением изоэнзимов I и {II E.coll, замещение серина или аргинина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 205, где остаток аланина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка в положении 205 на аспарагиновую кислоту или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине . В положении 256, где остаток лизина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 255 на глутаминовую кислоту, аспарагин или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 384, где аспарагинова  кислота присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 384 на глутаминовую кислоту, аспарагин или валин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине . В положении 591, где триптофан

присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, за исключением изоэнзйма I E.coli, в котором замена 591 остатка на аланин, цйстеин, глицин, лейцин, аргинин

или серии приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине,

Были получены мутанты, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины, в результате отдельных аминокислотных за0 мещений в других четырех положени х, а именно 121, 359, 588 и 595. В положении 121, где глицин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его сери- ном приводит к получению АЛ С, устойчивой

5 к сульфонилмочевине, В положении 359, где метионин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его валином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине . В положении 588, где

0 валин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его аланином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 595, где фенилаланин присутствует во всех извест5 ных энзимах АЛС. за исключением изоэнзйма III E.coll, замещение его лейцином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине.

Олигонуклеотиднаправленные сайтспе0 цифические мутации, привод щие к аминокислотным замещени м в положени х 122, 205, 256, 359, 384 и 5.91, выполнены в дрожжевом гене, кодирующем АЛ С (табл.3). В положении 122 производ т мутации,

5 привод щие к замещени м аланина 18 аминокислотами , присутствующими в АЛС дико- со типа. Каждое замещение за исключением глицина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положение

0 205 мутации, привод щие .к замещени м аланина - остатка дикого типа на цйстеин, глутаминовую кислоту, аргинин или трипто- фан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине . В положении 256 мутации,

5 привод щие к замещени м лизина - остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту, глицин , лейцин, пролин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 384 мутации, привод щие к

0 аминокислотным замещени м аспарагино- вой кислоты - остатка дикого типа на цйстеин , глицин, пролин, лизин, серин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 591 мут а5 ции, привод щие к аминокислотным замещени м триптофана - остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, гмстидин, изолей- цин, лизин, аргинин, валин. метионин. аспарагин , глутамин, треонин или Тирозин,

171820914 18 образуют АЛ С, устойчивую к сульфонилмо- н ютс  во всехтербицидчувствительных эн- чевине.зимах АЛС дикого типа, до сих пор имеющих

Все мутации, описанные в табл.2 и 3, отличительные признаки эукариотов, не.ко- E.coli привод т к получению энзимов, кото- торые замещени  в этих положени х встре- рые активны и менее ингибируютс  герби- 5 чаютс  в бактериальных энзимах АЛС. цидэми на основе сульфонилмочевины, чем дикого типа. Изоэнзим I E.coli имеет серии, энзимы дикого типа. Вместе вз тые эти ре а не аланин в положении 122, и глутамин, а зультаты показывают, что большинство за- нетриптофан в положении 591; изоэнзим II мещений в этих 10 положени х приводит к E.coli имеет серии, а не пролин в положении получению.ферментативно активной герби- 10 197, а изоэнзим III E.coli имеет аланин, а не цидустойчиврй АЛС,.. лролин в положении 197 и изолейцин, а не

Аминокислотные остатки в положени х фёнилаланин в положении 595. Каждый из 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и этих изоэнзимов АЛС E.col более устойчив 595 во всех.растительных энзимах такие же, (от 50 раз до более чем 10 000 раз) к ингиби- кбторые присутствуют в гербицидчувстви- 15 рованию (определенными) сульфонилмоче- тельном дрожжевом белке дикого типа. Ока- винными гербицидами, чем растительна  залось, что две мутации генетически св заны , или дрожжева  АЛС. Кроме того, сайт-на и введение этого фрагмента в чувствительные правленна  мутаци , вызывающа  замеще- клетки табака придает клеткам такой же уро- ние серина пролином в положении 197 в вень гербицидной устойчивости, который об- 20 Е.соН.АЛС II, придает мутантному энзиму в наружен дл  первоначального высоко-. 100 раз большую чувствительность к инги- устойчивого мутантного растени  табака, от бированию, т.е, такую чувствительность, ко- которого происходит данный энзим. На ос- тора  присуща энзимам высших растений нове этих фактов ожидаетс , что должны дикого типа. Таким образом, пролин в поло- быть два аминокислотных замещени  в эн- 25 жении 197 вовлечен в гербицидноесв зыва- зиме, кодируемом этим фрагментом. Срав- ние в АЛС К E.coli так же, как и в АЛС нение выведенной аминокислотной дрожжей и высших растений, последовательности мутантной АЛС с выве-Кроме того, были выполнены сайтнап- денной аминокислотной последовательно- равленные мутации,, которые привод т к за- стью АЛС дикого типа вы вл ет, что 30 мещени м триптофана лейцином и MyTaHfHafl АЛС имеет замещение пролина глутамина триптофаном в положе,нич 591 в аланином в положении 197 и замещение АЛС II и АЛС I соответственно. Мутаци  в триптофана лейцином ъ положении 591. На АЛС II придает энзиму больше устойчивости основании изложенного обнаружено, что к гербицидам, чем АЛС II дикого типа, тогда замещени  в остатках пролина 197 и трип- 35 как мутаци  в АЛС I придает ему больше тофана 591 придают гербициднуюустойчи- чувствительности к гербициду, чем АЛС I вость. Сравнение выведенной аминокис- дикого типа.

лотной последовательности мутантного эн-Сайтнаправ енные мутации в положе- зима АЛ С с аминокислотной последователь- ни х 197 и 591 в АЛС I и АЛС И E.coli оказы- ностью энзима .АЛ С дикого типа вы вл ет, 40 вают. воздействие на ингибирование что мутантна  АЛС имеет единственное за- мутантных энзимов гербицидом так, как мещение пролина глутамином в положении можно это предсказать из действи  дрож- 197, Лини  клеток СЗ, из которой был получен жевых и растительных белков АЛС гербици- reHSURA-СЗ. показывает избирательную гер- дустойчивых мутантов. Эти эксперимен- бицидную устойчивость. Это означает, что му- 45 тэльные данные лодеерждают универсаль- таци  СЗ придает устойчивость к сульфонил- ность аминокислотных остатков, вовлечен- мочевинным гербицидам хлорсульфурон и . ных в гербицидное св зывание с энзимами сульфоментуронметил, но не придает устой- АЛС из разнообразных источников, чивость к гербициду на основе имидазоли- нона. 50 Аминокислотные замещени , необходиИдентификаци  аминокислотных заме- мые дл  придани  гербицидной устойчиво- . щений в гербицидустойчивых энзимах АЛС сти, получают путем сайтспецифического из растений в положени х 197 (от мутантов мутагена фрагмента нуклеиновых кислот, СЗ и Нга)и591 (от мутанта Нга) показывает, кодирующего гербицидчувствительную что замещени  в положени х, операбель- 55 АЛС, следующим образом: ных в дрожжевой АЛС, также операбельны(1) выдел ют геномную ДНК или мРНК в растительной АЛС.. из растени ;

В то врем  как аминокислотные остат-(2) конструируют геномную библиотеку ки, присутствующие в положени х 121, 122, из выделенной ДНК или кДНК-библиотеку 197,205, 256.359.384, 588.591 и 595, сохра- из выделенной РНК;

(3) идентифицируют те фаги или плазми- ы, которые содержат фрагмент ДНК, кодиующий АЛ С;

(4) секвенируют фрагмент, кодирующий ЛС;5

(5) субклонируют фрагмент ДНК, несуий ген АЛС, в клонирующий носитель, коорый способен произвести однонитёвую НК;

(6) синтезируют олигонуклеотид длиной 10 около 15-20 нуклеотидов, который комплементарен определенной нуклеотидной последовательности АЛС, кодирующей одну из аминокислотных субпоследовательностей , за исключением нуклеотидного (-ных) 15 изменени  (изменений), необходимого Дл  мутации;

(7) присоедин ют олигонуклеотид к од- нонитевой ДНК, содержащей мутируемый участок, и использу  его дл  первичного 20 синтеза In vitro нити комплементарной ДНК, образующей гетеродуплекс;

(8) трансформируют бактериальные клетки гетеродуплекснрй ДНК;

(9) осуществл ют скринингтрансформи- 25 рованных бактериальных клеток дл  тех клеток, которые содержат мутированный фрагмент ДНК, путем а) иммобилизации ДНК на нитроцеллюлозном фильтре, б) гибридизации с 5( -концом, меченам Р, мута- генным олигонуклеотидом при температуре окружающей среды ив) промывки ее в услови х повышенной температуры с тем, чтобы избирательно отделить зонд от гена дикого типа, но не мутантнрго гена;

(10) выдел ют фрагмент двунитевой ДНК, содержащей мутацию из клеток, несу- - .щих мутантный ген; и

(11) подтверждают присутствие мутации анализом последовательностей ДНКЪ 40

Получение гербицидустойчивых растений . .- .- .. . ; . ;.. . -.

Фрагменты нуклеиновых кислот насто щего изобретени  могут быть использованы дл  введени  гербицидной устойчивости 45 в растени . С целью вставлени  фрагмента Нуклеиновых кислот, который включает ген, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, в различные растени , используют большое разнообразие методик в зависимости от же- 50 лаемого вида или культурного сорта. Вообще экспланты или протопласты могут быть .вз ты или получены из.растений, выращенных либо In vitro, либо в почве. Экспланты или протопласты могут быть получены из 55 сем долей, стеблей, черешков, листьев, корней, незрелых зародышей, гипокотилий, соцветий и т.д. В теории люба  ткань, которой можно манипулировать in vitro с образованием нового каллюса -или

30

35

0 5

0

5

0

5 0 5

0

5

организованного роста ткани, может быть использована дл  генетической трансформации ,,

Дл  достижени  трансформации эксплантаты или протопласты могут совместно культивироватьс  с Agrobacterlum, которую индуцируют дл  переноса фрагментов нуклеиновых кислот, расположенных между границами Т-ДНК плазмиды П, в растительные клетки. Другой способ, менее встречающийс  на практике, заключаетс  в пр мом поглощении ДНК растительными протопластами .

В примерах целый р д эксплантов из различных растений культивируют совместно с Agrobacterlum с тем,.чтобы достигнуть трансформации в гербицидную устойчивость . Эти экспланты культивируют так, чтобы позволить расти каллюсу. Затем каллюс сразу исследуют на устойчивость к сульфо- нилмочевинам или растени  регенерируют, а затем исследуют на устойчивость к сульфо- нилмочевинам. Исследование заключаетс  в ферментативном анализе экстрактов растительных клеток на наличие активности АЛС, устойчивой к гербициду, и/или в выращивании растительных клеток в культуре Или целых растений в присутствии обычно ингибирующих концентраций гербицида.

Фрагменты ДНК состо т из участка, кодирующего синтез гербицидустойчивой АЛС, и участка, предназначенного дл  экспрессии кодирующей последовательности « растени х. Фрагмент ДНК (8,3 кб), кодирующий белок гербицидустойчивой АЛС, состоит из приблизительно 800 п.н. в направлении 51 конца (по направлению вверх) кодирующего участка, достаточного дл  экспрессии белка в растени х. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего до 2000 частей на млрд. в трансформированных кал юсах табака . Растени , регенерированные из трансформированных клеток, также про вл ют устойчивость на уровне целого растени . Фрагмент ДНК длиной 6,3 кб, который кодирует белок гербицидустойчивой АЛС, содержит 2,5 кб в направлении 5( конца (по направлению вверх) и 1.8 кб в направлении З1 -конца (по направлению вниз) кодирующего участка, достаточного дл  экспрессии белка в растени х. Этот фрагмент ДНК может придавать устойчивость к хлорсульфурону при концентрации последнего 2 частей на млрд, в трансформированных каллюсэх табака.

В работе, котора  продолжаетс , фрагменты ДНК, содержащие сайтнзправлен- ные мутации в гене SURA, который, как ожидают, кодирует гербицидустойчивую

АЛ С, были выполнены за вителем. Эти мутации привод т к получению следущих аминокислотных замещений: Ala 122 на Ser, который как известно, операбелен в изоэн- зиме II АЛ С Е.соМ и дрожжевой АЛ С. Ala 122 на Val. который, как известно, операбелен в изоэнзиме II АЛ С E.coll и дрожжевой АЛС, Ala 122 на Pro, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 на Ser, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в изоэнзиме II АЛС E.coll, Pro 197 на Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака , Lys 256 на Gfu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, Asp 384 на Val, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС, и Тгр 591 на Leu, который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и АЛС, кодируемой геном SURB-HRa табака . Путем объединени  вышеприведенных мутаций также были выполнены двойные мутации, привод щие к получению двух аминокислотных замещений, таких как Ala 122 на Ser и Pro 197 на Ser, или Ala 122 на Ser и Pro 197 на Ala, или Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu, или Pro 197 на Ser и Тгр 591 на L eu, Эти мутации были выполнены во фрагменте ДНК, содержащем примерно только 180п.н. в направлении 51-конца (по направлению вверх) и только около 600 п.н. в направлении 3 -конца (по направлению вниз) последовательности, кодирующей АЛС. Эти Фрагменты ДНК были вставлены в табак посредством трансформации. Гербицидна  устойчивость не была экспрессировэна в этих трансформантах. Полагают, что использование регул торных последовательностей, найденных достаточными дл  экспресии гербицидной устойчивости с участком, кодирующим мутант SURA-C3, а именно 2,5 кб а направлении 5 -конца (по направлению вверх) и 1,8 кб в направлении 3 -конца (по направлению вниз) кодирующего участка, привело бы к экспрессии гербицидной устойчивости со всеми сайтнаправленными мутаци ми в участке, кодирующем SURA.

Сайтнаправленные мутации, которые, как ожидают, кодируют гербицидустойчи- вую АЛС, были выполнены также в гене АДС свеклы сахарной. Эти мутации привод т к получению следующих аминокислотных замещений: Ala 122 на Pro, который, как известно , операбелен в дрожжевой АЛС, Pro 197 на Ala, который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака, Тгр 591 на Leu. который, как известно, операбелен в дрожжевой АЛС и в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака и двойного мутанта, Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu,

который, как известно, операбелен в АЛС, кодируемой геном SURB-Hra табака.

Предпочтительный способ встраивани  фрагмента нуклеиновых кислот в раститель- 5 ные клетки заключаетс  в использовании Agrobacterlum tumefaclens, содержащей фрагмент нуклеиновых кислот между грани- цамиТ-ДНК либо на бесплечевой плазмиде TJ (т.е. плазмиде Ti, из которой удалены гены

0 дл  иммуногенности опухолевых клеток), либо в бинарном векторе in trans в плазми- ду Т с Vir-функци ми. Agrobactertum можно использовать дл  трансформации растений инокулированием тканевых эксплантатов,

5 таких как стебли или листовые пластины, или совместным культивированием с растительными протопластами. Другой предпочтительный способ встраивани  фрагмента нуклеиновых кислот насто щего изобрете0 ни  заключаетс  в непосредственном введении фрагмента или вектора, содержащего фрагмент, в растительные протопласты или клетки с помощью или без помощи электро- порировани , полиэтиленгликол  или дру5 гих агентов или способов, известных дл  изменени  пропускающей способности мембраны к макромолекулам.

Фрагменты нуклеиновых кислот насто щего изобретени  можно использовать

0 дл  трансформации протопластов или клеточных культур из широкого спектра РИДОВ высших растений дл  образовани  культур растительных тканей насто щего изобретени . Эти виды включают двухдольные расте5 ни  табак, петунь , хлопчатник, свекла сахарна , картофель, томат, салат-латук, дын , подсолнечник, со  культурна , canola (рапс) и другие виды Brassica и топол ; и однодольные растени  (кукуруза, пшеница,

0 рис, Lolium multiflorum и Asparagus offlclnalis). Ожидаетс , что все линии растительных клеток, имеющие протопластное происхождение, могут стабильно трансформироватьс  фрагментами насто щего изо5 бретени .

Фрагменты нуклеиновых кислот насто-  щего изобретени  можно также вставл ть -, в растительные клетки с последующим образованием трансформированных растений

0 насто щего изобретени . Трансформаци  целых растений осуществл етс  в растени х , клетки которых могут быть трансформированы инородными генами на стадии, на которой могут быть регенерированы целые

5 растени . В соответствии с насто щим изобретением трансформируемые растени   вл ютс  однодольными и двудольными растени ми. Предпочтительно, если трансформируемые растени  выбирают из группы , состо щей из табака, петуньи.

хлопчатника, свеклы сахарной, картофел , томата, салата-латука, подсолнечника, сои культурной, canola и других видов Brassica, тополей, люцерны, клевера, сахарного тростника ,  чмен , овса и проса. Наиболее предпочтительно, если трансформируемые растени  выбирают из группы, состо щей из табака, петуньи, картофел , томата, подсолнечника , свеклы сахарной, люцерны, салата-латука или видов Brassica.

Можно дополнительно повысить уровень экспрессии фрагментов нуклеиновых кислот путем замещени  их первоначальных регул торных нуклеотидных последовательностей и 51 - и З1 -концов АЛ С-кодиру- ющей последовательности синтетическими или природными последовательност ми, обеспечивающим экспрессию высокого уровн  и/или тканьспецифичную экспрессию . Можно также заместить нуклеотидные последовательности фрагментов нуклеиновых кислот насто щего изобретени  другими синтетическими или природными последовательност ми, которые кодируют транзитные пептиды, способствующие эффективному хлоропластному поглощению фрагментов нуклеиновых кислот насто щего изобретени .

Способ иллюстрируетс  следующими примерами. ....

П р и м е,р 1. Выдел ют ДНК табака (Nicotlana tabacum сорта Xanthl) из мутанта HVa. Отщепл ют листы 2x13 г размером 2.54-5,08 см (1-2 дю,йма) от растений и сразу же разминают в 2 объемах по 20 мл буфера А (10 ММ трицин-КОН, рН 7.6-1,14 М сахарозы - 5 мМ MgClz - 5 мМ 2-меркапто- этанол) в холодной комнате с помощью ступок и пестиков. Прибавл ют добавочное количество 40-50 мл буфера А, полученные суспензии фильтруют через 16 слоев марли. Фильтрат центрифугируют в роторе типа Son/all GSA при скорости вращени  2500 об/мин и температуре 4°С в течение 5 мин. Осадок после центрифугировани  ресус- пендируют в 10 мл буфера А, примешивают еще 100 мл буфера А и клетки центрифуги руют при указанных услови х. Полученные гранулы затем ресуспендируют в 100 мл буфера А в смеси с 0,4%-ным раствором Тритона Х-100, выдерживают на льду в течение 10 мин и центрифугируют указанным образом . Гранулы после центрифугировани  дважды промывают в последнем буферном растворе. Полученные конечные гранулы ресуспендируют в 5 мл рёсуспензионного буфера (50 мМ трис-HCt, рН 8,20 мМ ЭДТК), прибавл ют 1 мл рёсуспензионного буфера, содержащего 10% саркозила, а затем объем довод т до 10 мл посредством рёсуспензионного буфера. Прибавл ют протеиназу К до концентрации 100 мкг/мл до получени  лизэтов, пизаты -подвергают перевариванию при 37°С в течение ночи. Лизаты затем

довод т до плотности 1,55 г/мл CsCI и до конечной концентрации 300 мкг/мл бромида этидиуса. Растворы центрифугируют в роторе типа Beckman TI 70.1 при скорости вращени  40 000 об/мин при 15°С в течение

0 24 ч, полосу флуоресцентной ДНК снимают после визуализации длинноволновым УФ- излучением. Дл  сн ти  ДНК в боковых сте нах трубок полиалломера прокалывают отверсти  иглой калибра 18, что дает воз5 можность в зкой ДНК капать капл ми в трубку дл  сбора материала. Дл  предотвращени  среза ДНК на всех стади х после лизиса клеток соблюдают большую осторожность . ДНК вновь ресуспендируют в

0 м гких услови х в растворе CsCI с плотностью 1,55 г/мл и бромида этидиума с концентрацией 300 мкг/мл. а затем центрифугируют в роторе типа Sarvall TFT65.13 при скорости вращени  40. 000

5 об/мин и при 15°С в течение 48 ч. Затем ДНК вновь собирают через боковой прокол трубки-сборника. Затем ее экстрагируют 10 раз в м гких услови х посредством изоами- лового спирта, насыщенного ТЕ-буфером

0 (10 мМ трис-HCI, рН 8,1 мМ ЭДТК), а затем

экстенсивно диализу ют против ТЕ-буфера.

Конструируют библиотеку ДНК табака.

ДНК табака гидролизуют рестрикционным

энзимом Sau ЗА с образованием большин5 ства фрагментов, как определено электрофорезом в агарозном геле, прот женностью в интервалов 20 кб. (т.п.о). Полученные фрагменты нагружают на градиенты 10-40% сахарозы (в 1 М NaCi, 20 мМ трис, рН 8, 1 мМ

0 ЭДТК)и фракционируют по размерам центрифугированием в роторе типа Bekman SW 28 при скорости вращени  26000 об/мин и при 17°С в течение 16ч. Фракции, образованные от градиентов концентрации сахаро5 зы, собирают и анализируют электрофорезом в агарозном.геле, причем фракции, содержащие фрагменты размером 20 кб (20 Т.П.О.). диализируют против ТЕ-буфера и осаждают этанолом. Затем указанные фрак0 ции лигируют с плечами EMBL3 фага л мбда , расщепленными ВаглН (при мол рном соотношении 2:1, и упаковывают в головки фага л мбда, следу  инструкци м изготовител  по плечам генома л мбда и реакци м

5 упаковки.

Библиотеку ДНК табака, содержащую 400 000 фагов, высевают в чашки со штаммом-хоз ином Е.соН LE 392 при плотности 50 000 фагов на 150 мм чашку Петри с распределением на 10 чашках. Осуществл ют

перенос из бл шек фага на сдвоенные нит- роцеллюлозные фильтры и затем гибриди- зируют с зондами, меченными Р и несущими либо 51 -/шбо З1 -фрагменты гена АЛС, полученные в системе мечени  рибо- зондов. Бл шки, дающие положительные сигналы на пленках из обоих комплектов фильтров, собирают и очистку повтор ют многократно до тех пор, пока не получат хорошо изолированные гибридизирующие- с  бл шки.

Анализируют минипродукты ДНК из очищенного фага обработкой рестрикцион- ным энзимом. Различают два класса вставок фрагментов клонированной ДНК табака. Фаги 1, 2, 17 и 18 содержат вставки, родственные с ранее выделенным геном АЛС из места SURA, кодирующего чувствительную к гербициду АЛС. Фаг 3 содержит вставку, отличающуюс  от указанной, котора , как предполагают, содержит ген SURB- Нга, кодирующий АЛС, устойчивую к гербициду. Фрагменты EcoR l, которые окружают участки гибридизации фага 3, суб- клонируют в фаговые векторы М13 и . провод т анализ последовательности ДНК, Использу  олигонуклеотиды дл  расширени  секвенированных участков в перекрывающихс  сегментах. Обнаружена единственна  открыта  рамка считывани  из 1992 нуклеотидов, котора  идентифицирована как ген АЛС путем сравнени  выве- денной аминокислотной последовательности с консервативными участками аминокислотных последовательностей белков АЛ С других видов.

АЛС-гены, изолированные из гербици- дустойчивогомутантного табака Нга, ввод т в чувствительные клетки табака через систему бинарный вектор, использу  Agrobac- terium tumefacfens. гены АЛС первоначально ввод т в бинарный вектор в A.tumefa- clens через конъюгацию плазмиды и затем используют сконструированную A.tumefaciens дл  трансформации растительных клеток чужеродными генами путем совместного культивировани .

А). Введение изолированных генов АЛС табака в A.tumefaciens

1). Очищенный фрагмент нуклеиновых кислот Spe Г размером 8,3 кб насто щего изобретени , изолированный из мутанта HVa табака и содержащий кодирующую последовательность дл  гербицидустойчивой формы гена АЛС, вставл ют в сайт Хоа I плазмидного .вектора рМис19. Хот  ре- стрикционные энзимы Spe I и ХЬа I распознают отличающиес  ДНК-последовательности , продукты этого гидролиза нос т аналогичную , выступающую на 5- -конце последовательность . Ориентацию вставл емого фрагмента в одной из результирующих плазмид pAGS148 определ ют за счет анализов с помощью рестрикционного энзима. 5Бинарный вектор pAGS 135 используют дл  переноса плазмиды pAGS148 в А-tumefaciens. Плазмида PAGS135 происходит из плазмиды pAGS112. Она получена в результате переваривани  ДНК плаэмиды

0 pAGS112 рестрикцией ной эндонуклеазой Xho I, обработки фрагментом Кленова пол- имеразы I ДНК E.coli и самолигэции ДНК, за счет чего осуществл етс  удаление сайта Xho вне правого предела Т-ДН К. Плазмидэ

5 pAGS112 происходит от вектора pLAFR с широким диапазоном хоз ев. Она получена путем встраивани  ее в pLAFR фрагмент EcoR 1, в котором пределы Т-ДН К ограничиваютс  геном дл  экспрессии устойчивости

0 к канамицину в растени х и уникальным сайтом ВатН I дл  клонировани . Плазмиды pAGS148 и pAGS135, очищаемые CsCI. переваривают ВатН I и образующиес  ВатН I - расщепленные плазмиды са зыва5 ют. Гибридную ДНК ввод т в фаг л мбда in vitro и используют дл  заражени  штамма НВ101 Escherichia coli. Трансформанты выбирают на ампициллине.

2). Конъюгаци  плазмиды pAGS152 из

0 E.coli в A.tumefaciens.

Плазмиду pAGS152 вставл ют в tumefaciens путем конъюгации. Штамм НВ101 E.coli, содержащий плазмиду pAGS152, и штамм НВ101 E.coli, содержа5 щий мобилизирующий вектор pRK2013 (АТСС 37159), смешивают с штаммом LBA4404 A.tumefaciens. содержащим плазмиду , и подвергают скрещиванию на твердой LB-среде при 28°С в течение 16

0 ч. Трансконъюгаты селектируют на пластинах , содержащих рифампицин при концентрации 100 мг/л и тетрациклин при 1 мл/л. A.tumefaciens LBA4404 : pAGS152 подвергают рестрикции на минимальной А-среде, со5 держащей тетрациклин при 1 мг/л.

В основном аналогичный метод используют дл  .получени  как штамма LDA4404 A.tuiTiefaciens, содержащего плазмиду pAGS112, причем бинаирный вектор не со0 держит какой-либо вставки фрагмента нуклеиновых кислот, так и штамма LBA4404 A.tumefaciens, содержащего плазмиду pAGS145, причем бинарный вектор содержит фрагмент нуклеиновых кислот от фаго5 вогр клона 1. Последний фрагмент также изолируют из мутанта Нга растений табака и он несет ген дл  экспрессии гербицидчув- ствительной формы АЛС, этот ген не  вл етс  аллелем дикого типа гена дл  экспрессии гербицидчувствительной АЛС. а представ ет собой ген SURA из второго генетичекого локуса.

В). Введение изолированных генов АЛС чувствительные клетки табака посредст- 5 ом совместного культивировани  клеток расений с штаммами LBA4404 A.tumefaelens pAGS145) и LBA4404 (PAGS152).

Все манипул ции на стерильных средах растительных материалах провод т в кол- 10 паках с ламинарным потоком в приемлемых мкост х. Выращивание растений и культивирование растительных клеток провод т при 27°С. Все манипул ции на протоплатах осуществл ют при комнатной темпера- 15 уре, если не указано по-другому.

1 день (после полудн ).

Приготавливает среду дл  изол ции . протопластов путем прибавлени  следующих компонентов к K3/S (I) - среде: 0,1% 20 (мас./об.)МЕ5-буфера(51дта Chemical Co.), 1% (мае./об.) целлюлазы (Onozuka или цел- люлизин)и 0,1% мацеразы (Onozuka). После осторожного перемешивани  примерно в течение 30 мин значение рН довод т до 5,6 25 с помощью КОН и полученную среду стерилизуют на фильтрах.

Стерильные растени  табака (Nlcotlana tabacum сорта Вискрнсин-38) культивируют из 1 см апикальных или вспомогательных 30 эксплантатов на OMS-среде в коробках типа Магента при цикле из 16-часового светлого периода (6000-8000 люкс) с последующим 8-часовым темным периодом. Когда растени  достигнут 5-7 недельного возраста, от- 35 щеп л  ют полностью распустившиес  листь  (3-6 листьев снизу от верхушки) и каждые два листа помещают верхней поверхностью вниз на 20 мл среды дл  изол ции протопласта, содержащейс  в чашке Петри 40 размером 100 х 250 мм. Затем листь  погружают в среду и мелко измельчают острым хирургическим скальпелем. Среднюю жилку листа фиксируют и надрезы делают наружу от нее в направлении к краю листа с проме- 45 жутками примерно 2 мм. После этого чашки Петри герметизируют парапленкой и маце- рированную ткань инкубируют в течение ночи (14-17 ч) в темноте при 27-29°С при осторожном встр хивании в роторе (20-25 50 об/мин). .

2 день (утро).

Воронку дл  фильтровани  емкостью 75 мл, заполненную 4 сло ми марли, закрепл ют в кольцевидном держателе. Стекл нную 55 пробирку (длиной примерно 15 см и внешним диаметром 5 мм) прикрепл ют к воронке с системой трубок из латекса. Используемую воронку, марлю, систему трубок и пробирок из стекла и латекса заворачивают в алюминиевую фольгу и стерилизуют в автоклаве в виде единого целого.

Систему стекл нных пробирок помещают в колбу Бабкока, а марлю пропитывают средой КЗ/5(1). Переваренную ткань листа с двух чашек Петри осторожно выливают в, воронку. Марлю промывают и выжимают в указанную колбу. Заполненные колбы доверху заливают средой K3/S(1), покрывают фольгой и центрифугируют примерно при ТОО х g в течение 10 мин. Плавающие протопласты (1-2 мл) собирают серологической пипеткой (1 мл) и помещают в 20 мл среды K3/S(1), содержащейс  в другой колбе Бабкока . После ресуспендировани  протопластов за счет осторожного перемешивани  колбы Бабкока заполн ют доверху и центрифугируют , как указано ранее.,Плавающие протопласты (1-2 мл) собирают по описанному методу и помещают в 30 мл среды K3/G(I). Указанные протопласты подсчитывают в гемацитомере, а полученный объем регулируют дл  получени  1-х протопластов на мл. 5 мл аликвот протопластов высевают в чашки Петри тканекультивиру- емые чашки Петри размером 100 х 20 мм (Corning) эти чашки используют во всех последующих манипул ци х с протопластами и выращивают в темноте.

2 день (после полудн )

Единую колонию клеток A.tumefaelens, содержащую вектор трансформации требуемого растени , а именно pAGS 112 (указанный плазмидный вектор), pAGS152 (содержащий фрагмент нуклеиновых кислот насто щего изобретени ) или pAGS145 (содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую чувствительную форму АЛС); выращиваемую на пластине Минимал А, икокулируют в 5 мл среды Минимал А в 18 мм тестируемой пробирки и выращивают в течение ночи в роликовом барабане при скорости вращени  40-60 об/мин при 27-28°С.

3 день (утро)

Оптическую плотность культур A.tumefaelens измер ют при 550 км, довод т до 0,15 с помощью среды Минимал А и бактерии продолжают выращивать, как указано выше.

3 день (после полудн )

Когда оптическа  плотность (при 550. нм) культур A.tumefaelens составл ет 0.6 (логарифмическа  фаза культуры), примерно через б ч после разбавлени  указанные бактерии внос т в клетки при титре примерно 50 бактерий/растительную клетку (оптическа  плотность пор дка 1 при 550 нм 1,4 х х 109 бактерий). Полученную смесь бактерий и растительных клеток совместно культивируют в течение 66 ч при 24°С при слабом

освещении (примерно 500 люкс). Нетрансформированные протопласты-контроли инкубируют аналогичным образом, но без использовани  агробактерий. Дл  каждого совместного культивировани  провод т последующее протоколирование (дл  клеток, трансформированных различными агробактери ми , а также дл  нетрансформированных клеток).

6 день (утро)

Совместное культивирование прерывают путем прибавлени  20 мл смеси в соотношении 1:1, состо щей из среды K3/G(2) и среды С, дополненной 500 мг/л цефотакси- ма (при отборе против агробактерий) к 5 мл смеси дл  совместного культивировани . Совместно выращенные клетки осторожно и тщательно ресуспендируют в новой среде путем смешивани  серологической пипеткой (5 или 10 мл). Плотность клеток составл ет 2 х 104 протопластных эквивалентов/мл (протопластные эквивалентные исходным протопластам при 100% выхода и выживаемости клеток), а осмол рность составл ет 0,35 М. Три порции по 5 мл аликвот из каждой культуры распредел ют в свежих чашках Петри.

С этого момента до тех пор, пока культивируемые клетки не внедр етс  в твердую среду, они растут при слабом освещении (500 - 1500 люкс) без движени  и их перенос т в различные среды в стерильных услови х . В указанные времена клетки из одной чашки перенос т в неселективные среды, в то врем  как клетки с других двух чашек из каждой культуры перенос т в селективные среды, содержащие либо 50 мг/л канамици- на или 2 нг/мл хлорсульфурона дл  отбора трансформированных растительных клеток. Дл  этих переносов клеток содержимое из каждой чашки собирают с помощью серологической пипетки (5 мл), помещают в ргз- дельные конические трубки центрифуги из полистирола (емкостью 15 мл) и центрифугируют примерно при 50 х g в течение 5-10 мин. Надосадочную жидкость удал ют пипеткой , не разруша  рыхлых гранул. Полученные гранулы из совместно выращиваемых клеток с каждой из чашек затем осторожно ресуспендируют в соответствующей свежей среде.

10 день

Клетки перенос т в 5 мл среды С, котора  в случае неселектируемых растительных клеток дополнена 500 мг/л цефотэксима. а в случае селектируемых клеток дополнена 500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л кана- мицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона. Каждую из указанных культур возвращают в чашки Петри, из которых они были вз ты. Таким образом, дл  осуществлени  обмена

в среде с минимальной потерей клеток, не все клетки должны быть гранулированы. 13 день

Неселектируемые клетки перенос т в 20 5 мл смеси с соотношением 3:1. состо щей из среды С и среды MSP с добавкой 500 мг/л цефотаксима, и 5 мл аликвоты распредел ют в свежей чашке Петри (при плотности 5 х х 103 протопластных эквивалентов/мл). Се0 лектируемые клетки ресуспендируют в 5 мл смеси (3:1), состо щей из среды С и среды MSP, дополненной 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона и возвращают на первоначальные

5 чашки дл  последующего культивировани . 16-17 день

Клетки перенос т в 5 мл смеси в соотношении 1:1, состо щей из среды С и среды MSP, дополненной 500 мг/л цефотаксима (в

0 случае неселектируемых .растительных клеток ) или 500 мг/л цефотаксима и либо 50 мг/л канамицина, либо 2 нг/мл хлорсульфурона (в случае селектируемых клеток) и выращивают , как описано выше.

5 20 день

Неселектируемые клетки перенос т в 25 мл смеси в соотношении 1:1, состо щей из среды С и среды MSP, и затем полученную смесь прибавл ют в 25 мл смеси в соотно0 шении 1:1. состо щей из 2 объемов среды MSP и 1% (мас./рб.) раствора агарозы типа VII (температура 50°С). Полученную культуру быстро перемешивают серологической пипеткой (25 мл) с широким отверстием и

5 распредел ют в 5 мл аликвот на свежие чашки Петри. Суспендированные микрокаллюсы в растворе агара осторожно и равномерно распредел ют по чашкам взбалтыванием вручную. Чашки покрывают и оставл ют под

0 колпаком в течение часа дл  затверждени  перед тем, как их обернут в парапленку и перенесут в вегетационную камеру. Плотность клеток составл ет примерно 5 х 102 протопластных эквивалентов/мл и осмол р5 ность составл ет 0,15 М. Внедрившиес  клет- ки подсчитывают примерно 10 дней спуст  счетчиком дл  подсчета колоний.

Селектируемые клетки перенос т в 20 мл смеси в соотношении 1:3, состо щей из среды

0 С и среды MSP, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл зликвот ресуспендированных культур (5 х 10+3протоп-  аетных эквивалентов/мл) распредел ют по четырем свежим чашкам Петри на селектйруе5 мую культуру и выращивают, как указано выше. 23-24 дни

Каждую культуру селектируемых клеток объемом 5 мл разбавл ют 7,5 мл среды MSP, дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона в цел х получени 

плотности клеток 2 х 1043 протопластных эквивалентов/мл. Эту культуру с установленной плотностью смешивают с 12,5 мл среды в соотношении 1:1, состо щей из 2 объемов среды MSP и 1 % (мае./об.) раствора агэрозы типа VII (температура 50°С), дополненной 50 мг/л канамицина или 2 нг/мл хлорсульфурона. 5 мл аликвот перемешанных культур быстро распредел ют с помощью широкогорлой серологической пипетки (25 мл) на свежие чашки Петри. Конечна  плотность посева составл ет 1 х 103 протопластных эквивалентов/мл, а осмол р- ность культуры составл ет0,1 М. Чашки отвер- ждают, как описано выше. Внедрившиес  клетки подсчитывают примерно 10 дней спуст  счетчиком дл  подсчета колоний.

25 день «

От 10 до 12 индивидуальных трансформированных каллюсов/колоний собирают и перенос т скальпелем № 11 в чашку Петри, содержащую среду MSP с использованием или без использовани  соответствующего селективного агента дл  регенерации растений , Каллюсы выращивают при 27°С с фотопериодом в 16 световых часов (5000 - 8000 люке) с последующими 8 ч темноты. Побеги по вл ютс  спуст  2-3 недели и продолжают свое развитие в течение нескольких мес цев . Побеги длиной 2-3 мм срезают острым хирургическим скальпелем и перенос т дл  укоренени  в среду OMS в  щики Магента. После образовани  корневой системы (1-4 недели) растени  перенос т в почву дл  регенерации.

Результаты совместного культивировани .

Полученные результаты вследствие экс- периметов по совместному культивированию показывают, что фрагмент нуклеиновых кислот насто щего изобретени , кроме гена SURA табака дл  экспрессии гербицидчув- ствительной формы АЛ С, придает устойчивость к гербициду, когда его ввод т в гербицидчувствительные клетки табака (см. табл.4 и 5). Поскольку фрагмент нуклеиновых кислот насто щего изобретени  может придать устойчивость к гербициду при аналогичной частоте, когда его ввод т в любую ориентацию относительно вектора, он содержит регул торные последовательности обоих 51 - и 3 -концов относительно кодирующей последовательности, котора  необходима дл  экспрессии гербицидустойчивого гена АЛ С.

Уровень устойчивости к гербициду, придаваемый фрагментом нуклеиновых кислот насто щего изобретени , определ ют путем посева 100 колоний каждой из трансформированных клеток pAGS152 N.taba- cum, устойчивых к хлорсульфурону при 2 ч. на млрд. и не совместно культивированных клеток дикого типа N.tabacum при различных концентраци х хлорсульфурона. Подсчитывают количество активно растущих колоний при различных концентраци х хлорсульфурона после 1 мес ца (см.табл.6). В то врем  как колонии дикого типа чувствительны к хлорсульфурону при концентрации 2 ч. на млрд., колонии, получаемые из совместного культивировани  с плазмидой PAGS152 A.turriefaclens, могут выдержать концентрации до 2000 ч. на млрд. Такой уровень устойчивости полученных трансформантов сравним с уровнем гербицидустойчивого мутанта Нга табака, из которого фрагмент нуклеиновых кислот насто щего изобретени  изолирован, причем он примерно в 10 раз выше уровн  гербицидустойчивого мутанта S4 табака (родитель Нга).

Среда дл  культивировани  N.tabacum

K3/S (1) - сахароза, фитогормонный режим 1 (повышенный)

K3/G (1) - глюкоза, фитогормонный режим 1 (повышенный)

K3/G (2) - глюкоза, фитогормонный режим 2 (пониженный)

1-NAA 3,0 мг/л 2-NAA 0,1 мг/л ВАР 1,0 мг/л ВАР 0.1 мг/л рН довод т до 5,7. стерилизуют на фильтре и хран т при 5°С.

Распредел ют 25 мл на чашку Петри (tOO x 25 мм) и при необходимости прибавл ют

Среда QMS (дл  поддержани  растений ) Компонент

Соли-макроэлементы Fe ЭДТК

Микроэлементыi MS I

селективные агенты в стерильных услови х после охлаждени  среды до 50°С.

агрузка

10Х

100Х

1000Х

Конечна 

1

Ко -во/л

100 мл 10 мп

МЛ Jk

Дл  отвеждени  среды: агар (15 г/л) фирмы Dlfco Bacto автоклааируют в отдель (ЭДТК полностью раствор ют перед прибавлением значение рН довод т доЗ)

ном объеме 500 мл. Перед посевом соли и агар смешивают.

Дополнительное оборудование, химические препараты и среды, MES-буфер

П р и м е р 2. Получают ДНК табака из мутанта СЗ и конструируют, как описано в примере 1, геномную библиотеку ДНК на бак- териофаговом векторе EMBL3. Фаг, несущий гены АЛС, идентифицируют, как описано в примере t, посредством гибридизации с 51- концом зонда фрагмента гена АЛС табака, меченным Р.

Шесть независимых рекомбинант- ных фагов изолируют путем скрининга из 600 000 рекомбинантов из библиотеки мутанта СЗ. Анализ рестрикционной эндонуклеа- зы этих изолированных фагов показывает, что

ДНК-естааки из 3 фагов могут быть линеэр- ны с геном SURA из библиотеки мутанта Нга (фаги 35,36 и 38). Остальные 3 фага (фаги 31, 34 и 37) содержат вставки ДНК, соответствующие гену SURB. Как полагают, ген АЛС в фагах 35, 36 и 38  вл етс  геном SURA-C3, кодирующим гербицидустойчивую АЛС, а ген АЛС в фагах 31, 34 и 37  вл етс  геном SURB, кодирующим гербйцидчусствитель-  уюАЛС.Фрагменты ДНК из фагов 31, 35 и 38 субклонируют в плазмидуриС119, а затем в бинарный вектор плазмиды pAGS135, в осно .вном как описано в примере 1. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Spe I из фага 31 (размером примерно 8,3 кб), аналогичный фрагменту, содержащемус  в плаз ми де pAGS148, но несущий ген SURB, кодирую- щий гербицидчувствительНую АЛС, субкло- нируют в обеих возможных ориентаци х в векторе, Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Spe l-Sal I (размером примерно 6,3 кб) из фага 35 и фрагмент Spe - Sal I (размером примерно 7,8 кб) из фага 38 суб- клонируют с получением pALS35 (ATCC № 67424) и PALS38, соответственно. Указанные фрагменты включают 2,5 кб участка, кодирующего АЛС, в направлении 5 -конца (по направлению вниз), 2 кб АЛС-кодирую- щей последовательности, кодирующей гер- бицидустойчивый энзим и 1,8 и 3,3 кб, соответственно, АЛ С-кодирующего участка в направлении З1 -конца (по направлению вверх). Последние два субклонированных фрагмента содержат сайт рестрикционной эндонуклеазы ВатН I. Частичные переваривани  BamH I или pALS35 и pALS38 используют дл  вставлени  этих плазмид в сайт ВатН I бинарногЬ вектора плазмиды pAGS135. Гены АЛС в бинарном векторе, обозначенные р312, р313,р351 и р381 (таблица 7) перенос т в A.tumefaciens путем трехродительского скрещивани , как описа- но в примере 1.

Введение генов АЛС в гербйцидустой- чивые клетки табака путем совместного культивировани  растительных клеток с A.tumefaciens, несущим гены АЛС, в бинарный вектор провод т по методу, описанному в примере 1. Полученные результаты экспериментов по совместному культивированию представлены в табл.7. Как ожида- лось, ген АЛС, изолированный в фаге 31, т.е. ген SORB, кодирующий гербицйдчувстви- тельную АЛС, не дает никаких гербициду- стойчивых растительных клеток. Ге н АЛС, изолированный в фагах 35 и 38, т.е. ген SURA-C3, кодирующий гербицйдустойчи- вую АЛС, действительно дает растительные клетки, устойчивые к гербициду. Растительные клетки, устойчивые к гербициду, образуютс  при более низкой частоте, чем растительные клетки, устойчивые к канами- цину, а также при более низкой частоте, чем наблюдаетс  в случае, когда используют ген SURB-Hra: Это может быть в св зи с меньшей устойчивостью к гербициду АЛС-энзи- ма, кодирующегос  геном SURA-C3, по сравнению с АЛС-энзимом, кодирующимс  геном SURB-Hra, либо в св зи с более низкой экспрессией гена SURA-C3 по сравнению с геном SURB-Hra. либо и с тем. и с другим.

Пример 3. Осуществл ют мутации в гене SURA дикого типа табака In vitro, чтобы он кодировал гербицидустойчивую АЛС. Фрагменты рестрикционной эндонуклеазы. содержащие часть гена SURA, субклониру- ют в фаговые векторы М13 или плазмидные векторы, содержащие начало М13 репликации дл  получени  однонитиевой ДНК. Специфический фрагмент ДНК, который еубклонирован, зависит от участка, подвергаемого мутагенезу in vitro, и наличи  сайтов рестрикционной эндонуклеазы.

Синтезируют олигонуклеотиды длиной 16-17 оснований, которые гибридизуютс  с однонитиевой ДНК из АЛС-гена SURA с одноосновными неправильными подборами. Эти неправильные подборы предназначены дл  превращени  аминокислотных кодонов, обнаруженных в гене АЛС дикого типа, в кодоны, обнаруженные в генах АЛС, которые кодируют АЛС-энзимы, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины. Указанные олигонуклетоды содержат фрагменты: 5 GTTCAATTGGAGG АТС З1, дл  замены trp59tHaleu,

51 GTCAAGTGGCACGTAGG31, дл  замены pro 197 на ala, и

51 GTCAAGTGTCACGTAGG 31, дл  замены pro 197 на ser,

51 ATGTACCTGAGGATATT З1, дл  замены lys 256 на gtu.

51 GAGGTTTGTTGATAGAG З1, дл  замены asp 384 на val,

51 AGGTTTGAGGATAGACT 3. дл  замены asp 384 на glu,.

51 TACTGATGATTTTCAGG З1, дл  замены ala 205 на asp и

51 CAGGTGGCCCTTCCATG З1, дл  замены ala 122 на pro.

Указанные олигонуклеотиды гибридизу- ют с однонитиевой ДНК и используют в качестве праймербв дл  синтеза комплементарной нити в реакции, катализируемой фрагментом Кленова ДНК-попимеразы 1. Полученную ДНК трансформируют в компетентные клетки E.coli mutl. Отдельные бл шки или колонии очищают в зависимости от того, использованы ли фаговые векторы М13 (Ml3 mp 18/19) или плазмидные векторы М13 (pTZ18R/19R) начала репликации. Минипро- дукты однонитиевой ДНК получают и используют в реакци х секвенировани  ДНК дл  идентифицировани  клонов, несущих мутированные основани .

Эти сконструированные in vitro сайтс- пецифические мутации можно вставл ть индивидуально или в комбинации в ген SURA дикого типа, который содержит 51 - и З1 -концевые регул торные последовательности, необходимые дл  обеспечени  экспрессии гена в растительных клетках (см. пример 2). Такое включение достигают путем замены фрагментов рестрикционной эндонуклеазы, несущих мутации плэзмидой, содержащей ген SURA, из которого удален аналогичный фрагмент. Выбор рестрикционного фрагмента дл  замены зависит от положени  мутации в гене и от наличи  сайтов рестрикционной эндонуклеазы. Введение мутированных генов SURA в растительные клетки далее осуществл ют по мето . ду, описанному в примерах 1 и 2. Любой из фрагментов ДНК, содержащих мутации , которые привод т к получению гер- бицидустойчивой АЛС, как раскрыто в описании насто щего изобретени , можно получить в основном по этому методу. Кроме того, нет необходимости осуществл ть мутации только в гене SURA. Ана логичные мутации можно осуществл ть в гене SURB или в любом другом растительном гене, кодирующем АЛС, дл  которого доступна информаци  о ДНК-последовательности .

П р и м ё р 4. ДНК получают из Beta vulgarls сорта Sennika (сахарна  свекла), а теномную библиотеку ДНК в векторе EMBL3 бактериофага л мбда конструируют, как описано в примере 1. Рекомбинэнтныефаги (300 000) подвергают скринингу путем гибридизации с зондом, меченным Р, фрагмента гена АЛС табака на 5 -конце, как описано в примере 1. Фильтры промывают при 42°С (0,TXSSC) и выдел ют 20 индивидуальных клонов. На второй стадии очистки рекомбинантный фаг гибридиэуют с обоими З1 - и 51 -концами зонда гена АЛС табака. Кроме того, фильтры, которые гидридизиро- ваны с зондом 5 -конца, промывают при 55°С. Только один клон ф21 гибридизуетс  с обоими 51 - и З1 -концами зонда,, причем концы остаютс  тибридизованньчии после промывки при 55°С: Препараты минилиза- тов ДНК получают из 20 клонов и переваривают с помощью EcoR I и Ncol. Различные изол ты содержат разные фрагменты, полученные в результате обработки рестриктаза- ми, причем оп ть только ф21 гибридизирован с обоими зондами и остаетс  гибридизиро- вэнным после промывки при 55°С. Один фаг, а именно ф41, также содержит полосу гибридизации, котора  остаетс  после промывки при 55°С, тем не менее он не гибридизируетс  с зондом на З1 -конце. Участок,

кодирующий АЛС, св зывают с фрагментом BamH I - Hind III размером 3 кб путем гибридизации с зондами из гена N.tabacum на 5 51 - и З1 -концах. Обе нити ДНК этого фрагмента секвенируют. Фрагмент BamH I - Hfnd 111 субклонируют в векторы pUC119 или Bluerscrlpt; затем генерируют делеции эк- зонуклеазы III или Bal 31. Это осуществл ют 0 методом дидезокси-секвенировани . Сравнительный анализ.выведенной аминокислотной последовательности, кодируемой геном сахарной свеклы, с этой же последовательностью гена (генов) табака указывает

5 на отсутствие гомологии в первых 88 аминокислотах предполагаемого белка. Указанный участок может представл ть собой пептид перехода в хлоропласт. В св зи с этим гомологи  составл ет примерно 90% в

0 случае вставки 4 аминокислот вокруг остатка 290 АЛС табака. Проверка аминокислотных остатков, которые определ ют сайты дл  гербицидной устойчивости, установл - емой в табаке и дрожжах, указывают на то,

5 что указанные остатки консервируютс  также и в АЛС сахарной свеклы. Полученные данные позвол ет осуществить пр мой подход к конструированию гена, кодирующего энзим АЛ С сахарной свеклы,

0 устойчивый к гербицидам, посредством сайтспецифического мутагенеза, как описано в примере 3.

В этом гене сахарной свеклы подвергают мутагенезу три сайта. Кодон GCA дл  ala

5 в положении 122 замен ют ССА дл  pro, кодон ССА дл  pro в положении 197 замен ют CGA дл  ala и кодон TGG дл  trp в положении 591 замен ют TTG дл  leu. Двойные мутации, измен ющие pro на ala в положе0 нии 197 и trp на leu в положении 591, которые имеют сходное действие с геном SURB-Hra табака, также провод т путём комбинировани  двух отдельных мутаций .

5

Дл  трансформации растений посредством указанных мутаций, сконструированных in vitro, в гене АЛС сахарной свеклы, в плазмидный вектор pUC119 клонируют

0 фрагменты ДНК, содержащие мутации и проход щие от сайта BamH I размером примерно 910 п.н. в 51-концевом направлении (по направлению кверху) кодирующего уча- сТка до сайта Pst I размером .1000 п.н. в З1

5 -концевом направлении (по направлению книзу) кодирующего участка. Указанные фрагменты вставл ют в бинарный вектор pAGS140 дл  трансформации в клетки растени , как описано в примере 1. Указанный бинарный вектор pAGS140 аналогичен век-с

тору pAGS135, за исключением того, что между сайтом ВатН I и правой границей Т-ДНК П-плазмиды Agrobacterium tumefaciens вставл ют ген, который придает устойчивость растени м к антибиотику гмгромицину.

Введение генов АЛ С в табак и сахарную свеклу, чувствительные к гербициду, путем совместного культивировани  рэститель- ных клеток с помощью A.tumefaciens, несущего гены АЛС в бинарный вектор, провод т, как описано в примерах 1 и 2. Полученные результаты совместного культивировани  на табаке представлены в табл.8. Гербмцидустойчивые трансформанты получают с помощью 3 или 4 мутантных генов АЛС сахарной свеклы. Частота выхода гербицидустойчивых трансформантов, ниже , чем дл  трансформант.ов, устойчивых к канамицмну, и ниже, чем частота выхода гербицидустойчивых трансформантов при использовании гена SURB-Hra табака. Полагают/что это вызвано слабой .экспрессией мутантных генов АЛС сахарной свеклы в табаке. Вышеуказанное можно объ снить либо недостаточными регул торными последовательност ми нуклеотидов; располо- женных по направлению книзу или кверху от мутантных генов АЛС сахарной свёклы в используемых фрагментах ДНК, либо плохой утилизацией регул торных последовательностей нуклеотидов сахарной свеклы в табаке.

Введение генов осуществл ют стандар- тным способом совместного культивировани . Дл  каждого построени  аликвоту совместно культивируемых растительных клеток (исходна  концентраци  растительных клеток 2Х105) отмеривают дл  устойчи- вости к Ялорсульфурону, и другую аликвоту - дл  устойчивости к канамици- ну. Селекцию осуществл ют при 2 ч. на млрд. хлорсульфуронаили при 50 ч. на млн. канамицина. ..

П р и м е р 5. Ге.н SURB-Hra, описаный в примере Т, трансформируют в культурные сорта табака заражением Agrobacterium t.umefaciens пластинок табачных листьев, потомство трансформантов анализируют с тем, чтобы продемонстрировать экспрессию устойчивости на уровне целого растени  и наследственность признака гербицидной устойчивости, Затем поступают стандартными стерильными методами дл  манипули- ровани  стерильными средами и аксеиными культурами растений и бактерий включа  использование колпака с ламинарным потоком дл  всех переносов. Растени  табака дл  заражени  листовых пластинок высевают в чашки и выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24°С и 12 ч при ночной температуре 20°С, относительной влажности около 80%. при смешанном холодном белом свете флуоресцентного и накаленного свечени  осуществл ют заражение пластинок табачных листьев.

Молодые листь , не полностью распустившиес  и имеющие длину примерно 4-6 дюймов (10,16-15,24 см), собирают скальпелем с растений табака возраста примерно 4-6 недель (Nlcotlona tabacum, сорт CV.NK326 или К14). Листь  поверхностно стерилизуют в течение 30 мин погружением их в 500 мл 10%-го раствора Chlorox, 0,1%-го раствора додецилсульфата натри  и затем промывают 3 раза стерильной деи- онизированной водой. Пластины листьев диаметром б мм получают из целых листьевс использованием стерильного бумажного пуансона .

Пластины листьев инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры Agrobacterium (разбавление 1:10), несущей плазмиду pAGS152. Культуры Agrobacterium по вл ютс  после инокулировани  10 мл бульона Min A (пример 1) с единственной бактериальной колонией, удаленной из бл шки с бульоном Mln А и тетерциклина (пример б ). Культуру выращивают в течение примерно 17-20 ч в стекл нных пробирках (18 мм) с культурой в качалке с платформой типа New Brunswick, поддержива  температуру при 28°С.

После инокулировани  пластины листьев помещают на чашки Петри, содержащие среду с агаром CN (пример 6). Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанном освещении дл  растений, т.е. флуоресцентном и Gvo and Sho (General Electric) в течение 2-3 суток в камере дл  культивировани , где температуру поддерживают примерно при 25°С.

Чтобы освободить пластинки листьев от Agrobacterium и отобрать дл  выращивани  трансформированных клеток табака, пластинки листьев перенос т на свежую среду CN, содержащую 500 мг/  цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохран ют в виде замороженного основного раствора (концентраци  100 мг/мл) и прибавл ют в стерильных услови х (стерилизуют через 0,45 мкм фильтр) к средам после автоклавировани . Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготовл ют дл  каждого использовани  и стерилизуют через фильтр, пропуска  его в автоклавированные среды.

Пластинки листьев инкубируют в услови х культивировани , описанных выше, в течение 3 недель и затем перенос т на све- жие среды такого же состава.

Всходы возраста приблизительно 1-2 недель, развивающиес  на канамицин-ото- брэнных эксплантатах, подрезают стерильным скальпелем и высевают в среде А, содержащей 100 мг/л канамицина. Корне- образование на селективных и неселективных средах регистрируют в пределах 3 недель. Всходы, которые укорен ютс  в ка- намицине, перенос т в почву и выращивают в растильне, как описано выше. Через 3-5 недель, но перед тем, как происходит цветение, листовую ткань вырезают и используют дл  анализа А Л С, как описано в примере 6. Результаты этих анализов, которые указывают на то, что развиваетс  герби- цидустойчива  форма АЛС, приведены в табл.9. Растени , про вл ющие активность гербицидустойчивой АЛС, затем перенос т в теплицу, где они растут до зрелости. Отдельные цветки заключают в мешки дл  то- го, чтобы позволить самооплодотворение без перекрестного опылени . Зрелые семена собирают и осуществл ют испытани  по качеству потомства дл  определени  наследственности признака гербицйдной устой- чивости. Семена поверхностно стерилизуют, как описано выше, сушат, и семена сажают на среде SG (1/4 соли MS, 0,75% сахарозы. 0,8% агара) в присутствии или отсутствии гербицида (DPX-F6025, CfassfcR). Чувстви- тельные семена прорастают, но далее не развиваютс . Результаты испытани  по качеству потомства приведены в табл.9. Сегрегационное соотношение трех устойчивых потомств по сравнению с одним чувстви- тельным потомством указывает на присутствие вставки на одном сайте гена SURB-Hra в трансформант, который  вл етс  стабильно унаследованным. Это наблюдают в 15 случа х из 17 трансформантов. Более высокие со- отношени  устойчивых потомств к чувствительным показывают множественные вставки в несв занных положени х в геноме. Соотношение 15:1 указывает на присутствие двух несв занных генов SURB- Нга, а соотношение 255:1 - на присутствие четырех несв занных генов SURB-Hra в трансформантов К14 N 40 и К14 №:7 соответственно .

Примерб. Дл  трансформации герби- цидчувствительного .томата в гербициду- стойчивый используют ген SURB-Hra из табака, переносимый на бинарном векторе

pAGS152 в штамме A.tumofar.ions LHA.4104 (см. пример 1).

Следуют стандартным стерильным методикам дл  манипулировани  стерильных сред и аксенных культур растений и вакге рий. включа  использование коппака с ламинарным потоком дл  всех переносов. Семена томата (Lycopersicon esoulentum сорт Herbst Res Cherry) поверхностно стерилизуют в течение 30 мин в 10%-ом растворе Chlorox, 0,1 %-ом растворе дедоцилсульфата натри  и промывают 3 раза стерильной де- ионизированной водой. Семена сажают в  щиках Magenta (Magenta Corp.). содержащих 100мл среды с агаром OMS. и инкубируют при смешанном освещении дл  растений, т.е. флуоресцентном и Gro and Sho (General Electric) в растильне, поддержива  в ней температуру около 25°С. Сем доли от всходов 10- 15-дневного возраста используют дл  инокул ции Agrobacterium.

Сем доли скарифицируют путем отщеплени  около 2 мм ткани от каждого конца сем доли при помощи стерильного скальпел . Скарифицированные сем доли высевают на чашки Петри на среду с агаром СТМ либо в присутствии, либо в отсутствии 75 мкм ацетосирингона (Aldrich Chemical).

Дл  приготовлени  инокулировани  сем долей единственную бактериальную колонию с чашки с агаровой средой Min А и тетрациклина (1 мкм/мл) инокулирут в колбу , содержащую 30 мл бульона Min А (пример 1), и выращивают в течение 2 суток при 28°С в качалке с платформой New Brunswick. В то утро, когда инокулируют сем доли , культуру бактерий разбавл ют стерильным бульоном Min А до оптической плотности 0,1 при 650 нМ и ей дают размножатьс  до оптической плотности 0,2 в услови х выращивани , описанных ранее. Эту культуру затем используют неразбавленной дл  инокулировани .

Чашки с агаром СТМ, содержащие эксплантаты сем долей, наполн ют 5 мл бактериального раствора в течение приблизительно 5 мин перед тем, как удалить раствор. Затем чашки закрепл ют лентой Time Tape (Shamrock Scientific Specialty) с двух сторон чашки и инкубируют в течение 2 суток при смешанном освещении дл  растений, а именно флуоресцентном и Gro and Sho (General Electric) при температуре около 25°С.

Чтобы освободить растительные культуры от Agrobaeterlum и отобрать .дл  выращивани  трансформированных клеток томата, эксплантаты сем долей перенос т в

свежую среду СТМ, содержащую 500 мг/л цефотаксима и 50 мг/л канамицина, и инкубируют их при таких же улсови х культивировани , которые описаны выше, в течение приблизительно 3 недель. Затем сем доли перенос т в свежие среды с таким же составом и селективными веществами, как и среда СТМ, однако при 1 /10 концентрации зеатина.

Приблизительно через 2-4 недели всходы , развившиес  из канамицинотобранных сем долей, отрезают и высевают в средах OMS, содержащих 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л кзнамицина. Всходы томата, которые усокренились в канамицине через 2-3 недели, перенос т в почву в 8-дюймовых (20,32 см) сосудах и накрывают пластмассовыми мешками. Растени  выращивают при смешанных флуоресцентном и накаленном свечени х: 12 ч при дневной температуре 24°С и 12 ч при ночной температуре 20°С, относительной влажности около 80%, в течение одной недели перед тем, как сн ть пластмасссовые мешки. Затем растени  выращивают еще 2-4 недели и осуществл ют испытание АЛС. В этих экспериментах по- казано повышение неингибированной активности АЛС в присутствии сульфонил- мочевины GlassicR в экстрактах листьев из трансформированных растений (табл.10).

Анализ активности АЛС в отсутствии или в присутствии гербицида из трансформированных или нетрансформированных растений осуществл ют следующим образом:

1. Измельчают 2,5 г относительно молодой листевой ткани (4-6 дюймов/10,16- 15,24 см в длину) в тканевом гомогени- заторе, содержащем 10 мл экстракционного буферного раствора (100 мМ КНРСм), рН 7,5, 0,5 мМ MgCla, 10% глицерина, 1 мМ пирува- та, 0,5 мМ тиаминпирофосфата, 10 нМ фла- винаденийнуклеотида) и 200 мг Polyclar AT (BDH Blochemicals). Эту смесь сохран ют на льду.

2. Гомогенизируют экстракт в течение приблизительно 10 с с в политроне(Brinkman Instruments) при наетройке на №7.

3. Центрифугируют экстракт в роторе Son/all SS-34 в течение 20 мин при скорости вращени  1.6 000 об/мин и 4°С,

4. Уравновешивают колонки PD-10 (Pharmacia) промыванием 5 раз колоночным буферным раствором (100 мМ КНРСм, рН 7,5, 0,5 мМ MgClz, 10% глицерина, 1 мМ пирувата).

5. Дл  засева экстракционного суперна- таита прибавл ют холодный насыщенный раствор (NH4hSO/t с получением 50% фракции . Инкубируют на льду в течение 30 мин,

6. Центрифугируют экстракт в роторе SS-34 в течение 20 мин при скорости вращени  16 000 об/мин и температуре 4°С. Декантируют супернатант.

7. Ресуспендируют гранулы в 1 мл холодного колоночного буфера.

8. Загружают экстракт на колонку и прогон ют объемом колоночного буферного раствора с получением полного объема загрузки , равного 2,5 мл. Этот прогон пропускают через колонку.

9. Элюируют белки двухкратным объемом загруженного экстракта. Извлекают в трубке Falcon (15 мл), расположенной под колонкой.

10. Приготавливают реакцию дл  каждого экстракта в трубках дл  микроизмельчени  следующим образом: 350 мкл реакционной смеси (200 мМ пирувата, 5 мМ тиаминпирофосфата, 0,9 мМ фламинаде- ниннуклеотида, 5 мМ КНРСм, рН 7,0), 50 мкл либо 5 мМ КНРСм, либо нужной концентрации сульфонилмочевины, и 100 мкл растительного экстракта подвергают взаимодействию .

11. Инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч при 30°С.

12. Дл  прекращени  реакции прибавл ют 50 мкл 6 М раствора НаЗСм и инкубируют при 60°С в течение 10 мин, Центрифугируют в микромельнице в течение 5 мин.

13. Приготавливают пробирки дл  развити  красок следующим образом: 500 мкл 0.5%-го креатина реакционной пробирочной надосадомной жидкости, 0,5 мл раствора а -нафтона (1,5 г а -нафтола в 30 мл 2,5N NaOH). Смесь перемешивают и нагревают при 60°С в течение 20 мин.

14. Завихр ют каждую пробирку и помещают 100 мкл каждой пробы в резервуары микротитровых чашек. Снимают показани  при оптической плотности 530. В

Среда индукции каллюса .

1 упаковка солей-MS

(Glbco Murashtge

Qrganics Medium)

с 3%-ной сахарозойна 1 п

1 мл 1 мг/мл МАЛрН 5,8 0,2 мл 1 мг/мл ВАР 0,8% агара

CN

Среда индукции всходов 1 упаковка соелй MS с 3% сахарозына 1 л 1 мл 1 мг/мл NAA рН 5,8 1 мл 1 мг/мл ВАР 0,8% агара

А

Среда корневой индукции 1 упаковка солей MS (без сахарозы)на 1 л

ТО г сахарозырН 5,8 0,8% агара

R-среда Argobacterium Прибавл ют 7,5 г агара к 440 мл воды, автоклавируют и сохран ют при 55°С. Прибавл ют следующие стерильные компоненты: . 0,5 мл 1М раствора MgSCk 0,5 мл 1М раствора CaCla 10,0мл 20%-ной сахарозы 5,0 мл 100 мг/мл канамицина 50,0мл 10 х сол ей

(60 г/л NaaHPCU 7Н20 30 г/л КНаРСм; 5 г/л NaCI; 10г/лМН4С1) Среда СТМ 1 упаковка солей MS 1 мл витаминов В5 (на 100 мл; 100 мг никотиновой кислоты , 1000 мгтиа- мин гидрохлорида, 100 мг пиридоксин- .гидрохлорида, 10000 мг мионизи- та)

1 мМ MES

3% глюкозы« 0,7% агара рН 5,7

Смесь автоклавируют и прибавл ют 1 мл 1 мг/мл раствора зеатина.

Среда OMS 1 упаковка солей MS 1 мл витаминов В5 (см. выше) 3 мМ MES 3% сахарозы 0,8% агара РН5.7 Среда Mln A + 1 мкг/мл тетрациклина

1. Прибавл ют 7,5 г агара к 400 мл воды.

2. Приготавливают основной раствор.

К2НР045,25 г

КН2РО42,25 г

(NH4)2S040,5 г

Лимоннокислый

натрий -2Н200,25 г/100 мл

3. Приготавливают и автоклавируют смесь 20 г/100 мл MgS04 7Н20

4. Приготавливают и автоклавируют 20%-ный раствор глюкозы

5. Приготавливают тетрациклиновую смесь (1 мг/мл в смеси этанола и НзО), которую затем стерилизуют через фильтр (50 об.%).

Дл  получени  среды Min A + 1 мкг/мл тетрациклина смешивают (1) и (2), прибавл ют 0,5 мл (3), 5 мл (4) и 0,5 мл (5).

Среда УЕВ

Бактом сной экстракт Бактодрожжевой экстра Пептон. Сахароза MgSO 7Н20 Агар (при желании)

Гербицидные растворы: 1 ч. на млн. основного раствора гербицида на основе сульфо- нилмочевины можно получить растворением 1 мг гербицида в 100 мл 0.01 N МНзОН с последующим разбавлением (соотношение 1:10) путем добавлени  5 мМ КНРСм, рН 7.

Эта смесь достаточна дл  испытани  гербицида при концентрации 100 ч. на млрд. или ниже. Если требуютс  более высокие концентрации , раствор ют 1 мг е 10 мл 0,0IN NH40H и т.д.

Гербицидные разбавлени : При прове- дении стандартного испытани  50 мкл гербицида прибавл ют к 450 мкл испытуемой смеси и экстрагируют, дл  1:10 разбавлени  гербицида. Итак, дл  каждой испытуемой

концентрации следует разбавить 10х раствор в 5 мМ КНРСм, рН 7, из основного раствора.

Пример. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербйцидустойчивую АЛС, используют дл  трансформации Beta vuigaris (сахарна  свекла) с использованием Agrobacterlum tumefaclens.

Чтобы поверхностно стерилизировать семена, 50-100 сем н помещают в стерильные чашки Петри (25 х 100 мм) в колпаке с ламинарным потоком и прибавл ют 25-30 мл 70%-го этанола. Семена перемешивают вручную в течение 1-2 мин, этанол декантируют , после чего прибавл ют 25-30 мл 20%го Chlorox (2G мл коммерческого отбеливател  (80 мл стерильной воды) 1 капл  Tween 80). Семена перемешивают на ротационной качалке при скорости вращени  40 об/мин в течение 20 мин и отбеливатель декантируют . Стерилизацию отбеливател  повтор ют 2 раза а течение всего 60 мин, стерилизованные семена промывают 3 раза в течение 5 мин, .каждый раз 25-30 мл стермльной воды..

Дл  прорастани  сем н последние высевают на чашки Петри (15 х 150 мм) со средой, отаержденной агаром 1/2 PGo (12 сем н на 50 мл среды), и культивируют при 24°С в темноте.

Примечание. 10-20%-ное загр знение сем н можно ожидать дл  хорошей, чистой дел нки с семенами. По этой причине семена высевают далеко друг от друга на больших пластинках и прорастани  наблюдают непрерывно, незагр зненные семена

перенос т к свежим пластинкам. Если загр знение грибковое, тогда переносы осуществл ют в камере с ламинарным потоком оез вентилировани .

60-80% всхожесть сем н ожидают дл  хорошей дел нки сем н. Прорастание не синхронное. Необходимо приблизительно 14 суток дл  достижени  а) всех всходов и б) достаточной элонгации с тем, чтобы получить много подход щих эксплантов.

Получают ночные суспензионные культуры (0/N) Agrobacterium, как описано enpi/r мере 1. Заново посе нна  Agrobacterium имеет более короткий латентный период, чем культуры, сохран емые в течение длительного времени при 5°С, Важно использовать логфазовые бактерии в качестве инокул тов. Поэтому необходимо провести испытание с тем, чтобы обеспечивать получение ночной культуры, котора  достигает лог-фазы (оптическа  плотность при 550 нм 0,4-0,8) перед инокулированием гипокоти- лий.

Дл  получени  растительных эксплантатов гипотолии разрезают на сегменты около 0,5 см при помощи острого хирургического скальпел  и сразу высевают на чашки с PGo 0,1/0,1, отвержденный агаром. Необходимо следить за тем, чтобы не случилось высыхани  или повреждени  раны при использовании тупого скальпел  или при сжа- тии пинцетом.

Дл  инокулировани  эксплантатов последние погружают отдельно в суспензию с лог-фазой соответствующего штамма Agrobacterium. Эксплантаты погружают на короткий срок (1-3 с) и располагают в решетчатой конфигурации на свежей чашке: 25 эксплантатов на 100 мм чашке PGo 0,1/0,1, отвержденной агаром.

Эксплантаты сушат, оставл   чашки открытыми в ко паке с ламинарным потоком в течение 10-30 мин. Вследствие этого Agrobacterium концентрируетс  на бане. Это также может ограничить возможное повреждение , наносимое водой. При этом очень важно следить за тем, чтобы ткань не .повредилась. Требуетс  тщательное наблюдение за данной стадией. Затем чашки герСреды и структурообразователи

метизируют пара-пленкой и культивируют при 24°С в течение 3 суток.

Эксплантаты собирают в жидкой PG 0,1/0,1, содержащей цефотаксим при концентрации 500 мкг/мл в чашках Петри (25хТОО мм), и осторожно встр хивают на ротационной качалке при скорости вращени  40 об/мин в течение 1 ч. Среду декантируют , замен ют свежими противоселективными средами и встр хивают осторожно в течение еще 2 ч. Эксплантаты высевают в решетчатой конфигурации на чашки (25 х 100 мм) со средой PG 0,1 /0,1, отвержденной агаром и содержащей цефотаксим (500

мкг/мл), и культивируют при 24°С в течение 3 суток.

Отбор трансформированных растительных клеток осуществл ют следующим образом . Эксплантаты перенос т на свежие

чашки со средой PG 0,1/0,1, отвержденной агаром и содержащей 100 мкг/мл ванкоми- цина или 2 нг/мл хлорсульфурона в качестве селективных агентов. Число устойчивых колоний подсчитывают через 20-30 дней. В

каждой ране можно наблюдать более чем

.: одну колонию. Трансформанты отщепл ют

следующим образом. Каллюс удал ют из раны/экслланта хирургическим скальпелем и

культивируют независимо друг от друга на

свежих селективных средах. Некоторые Agrobacterium могут избежать контрселе- кии. .Возможны дополнительные промывки в жидких средах, содержащих цефотаксим, а также повторные переносы к цефотаксимсодержащим чашкам, отвержденным агаром . С соблюдением предложенных правил можно установить приблизительно 15% загр знени  эксплантатов, которые  вл ютс  допустимой потерей. Результаты эксперимента по трансформации с использованием линии клеток Beta vulgaris 87193 сахарной свеклы приведены в таблице 11. Уровень устойчивости к хлорсульфурону в каллюсах В.Vulgaris, трансформированной мутантным АЛС-геном SURB-Hra табака, сравнивают с уровнем устойчивости к хлорсульфурону в нетрансформированных каллюсах. Эти результаты показывают, что ген SURB-Hra табака , кодирующий гербицидустойчивую

АЛ С, может быть эффективно экспрессиро- ван в сахарной свекле.

Основные растворы

ПримерВ. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛ С, используют дл  трансформации Brasslca napus, сорт Olga.

Дл  поверхностной стерилизации сем н последние погружают на 1 мин в 70%- ный этанол, затем на 30-60 мин в раствор Chlorox/Tween (см.пример 7). Поверхностно стерилизованные семена культивируют на 1/2 MS, 1/2 PGo (см. пример 7) при 24°С в темноте. Через 5-10 дней после прорастани  гипокотоли раздел ют на участки 0,5 см и помещают на твердой среде I, содержащей 100 мкм Ацетосиригона (1AS100).

Gpa3y же эксплантаты окунают по отдельности в суспензию логфазы LBA4404, содержащей бинарную плазмиду pAGS15.

Эксплантаты высевают обратно на IAS100. Капельку Agrobacterlum осторожно сушат на ткани за счет оставлени  пластинки открытой в колпаке с ламинарным потоком. Совместное культивирование осуществл ют при 24°С при малом свете или ъ темноте в течение 3 суток.

Через 3 суток эксплантаты собирают в жидкой сере 1, содержащей 500 мг/л цефо- таксима, в чашках Петри (25x100 мм) и встр хивают на ротационной качалке при скорости вращени  40 об/мин в течение 3 ч.

Эксплантаты высевают на твердую среду 1, содержащую 500 мг/мл цефотаксима, и культивируют в течение 3 суток при 24°С при малом свете.

Эксплантаты высевают на чашки с твердой средой 1, содержащей 100 мг/л ванко- мицина и 100 мг/л канамицина.

Приблизительно через 1 мес ц трансфер 1 мированные каллюсы по вл ютс  в виде дискретных узелков на концах эксплантатов.

Сразу после по влени  узелки отрезают острым скальпелем и высекают на твердую среду 1, содержащую 100 мг/л канамицина.

Когда трансформированный каллюс достигает достаточного размера (диаметр 0,5

см), его перенос т к среде KR, содержащей 100 мг/л канамицина. Этот материал регенерируетс  быстрее, если его высевают на свежие среды каждые две недели. Корни

регенерируют на 1 /2 MS, содержащей 2 мкм IBA.

В одном эксперименте из 100 скарифицированных сайтов (любой конец сектора гипокотил  0,5 см) 20 развили каллюсовую

ткань, котора  была устойчивой к канамици- ну при его концентраций 100 мг/л. П ть из 20 трансформированных линий клеток последовательно индуцируют дл  регенерации на канамицине, соматические, скрещивающиес . между собой сибсы дл  каждого ре- генрирующего генотипа были получены узловым размножением. Эти растени  опрыскивают различными концентраци ми хлорсуль- Фурона, резул ьтаты приведен ы в табл. 12. Два из

п ти трансформантов устойчивы к хлорсульфу- рону на уровн х, которые приблизительно в 10 раз выше уровн , летального дл  контрольных (нетрансформированных) растений.

Дл  дальнейшей демонстрации экспрессии гена SURB-Hra в трансформированном Brasslca napus осуществл ют испытание АЛ С в присутствии гербицида хлосульфурон, как описано в примере 6. Сравнивают активности АЛС нетрансформировэнного родител  и трансформанта RO № 5 (табл.12). Результаты приведены в табл.13. В трансформанте наблюдаетс  неуклонное повышение процентной доли ин- гибировани  активности АЛС. Таким

образом, ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛС, может экс- прессироватьс  в Brasslca napus, однако эта экспресси  не  вл етс  эффективной. Добавление нуклеотидных регул торных

последовательностей Brasstca napus, как ожидают, могло бы повысить уровень экспрессии гербицидустойчивой АЛС и уровень выдерживаемости к лиственному введению гербицида.

Эти стерилизованные на фильтре компоненты прибавл ют асептически

.При м е р 9. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛ С, используют дл  трансформации Cucumis meJo, сорт Amarlllo Ovo (дын ).

Поверхностна  стерилизаци  сем н в значительной степени упрощаетс  первоначальным удалением сем нной оболочки. Затем семена стерилизуют промывкой в 70%-ном зтаноле в течение 2 мин, после чего семена промывают в смеси Chlorox и Tween (см. пример 7) в течение 20 мин. Стерильные семена промывают 3 раза в стерильной дистиллированной воде и прорастают на среде OMS при 24°0 в течение 16-часового дн . Сем доли всходов дыни возраста 7-14 дней разрезают на срезы 5 мм при помощи нового, острого скальпел . Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterium с лог-фазой, полученную, как описано-в примере 1. Затем эксплантаты перенос т к новым чашкам дл  совместного культивировани  и культивируют при 24°С в течение 3 суток (16 часов в день).

Бактерии убивают путем промывки экспланатов в течение 3 ч с осторожным перемешиваним и промывочных средах и культивируют на вежих чашках с селективной средой.

Эксплантаты субкультивируют каждые -4 недели, причем отсекают более компакные , более темно-зеленые секторы от белого ворсистого каллюса.

Когда Морфогенный каллюс (очень темно-зеленый, компактный, возможно, чуть узнаваемые листь ) становитс  заметным , его перенос т к регенерационным средам . Ткань может проходить пр мо к росткам вместо того, чтобы проходить через морфогенную стадию. Всходы укорен ютс  в корнеобразующих средах. Приблизительно 70% эксплантатов развивают каллюс, устойчивый к канамицину при концентрации 100 мкм/п. Трансформированный каллюс помещают на среды, содержащие возрастающие концентрации хлорсульфурона, и рост в присутствии гербицида определ ют взвешиванием каллюса через 30 дн-эй (табл.14). Некоторые трансформанты растут при высоких концентраци х хлорёу ьфурО на (1000 ч, на млрд) так же хорошо, как и в его отсутствие, например транс 1, транс 2 И транс 7. Таким образом, ген SURB-HRa табака трансформирует дыню и обеспечивает высокий уровень гербицидной устойчивоСТИ , . ....

Измерени  показывают многократное увеличение веса каллюса. Среды

OMS

Соли MS и Fe ЭДТК1х Витамины В5 1х Сахароза 3% MES ЗмМ рН5,7 :

Агар

0,8%

Автоклавирование в течение 20 минут

Основна  среда Соли MS и Fe ЭДТК 1х Миоинозит100 мг/л Тиамин -% 1 мг/л Сахароза 3% MES ЗмМ , рН 5,7

Агар0,8% Автоклавирование в течение 20 мин В качестве среды дл  совместного культивировани  используют основную среду плюс: 100 мкм ацетосирингона (ацетосирин- гон хран т как основной раствор 100 мМ в ДМСО) ..; . 6 мг/л кинетина 1,5 мг/л IAA

В качестве промывочной среды используют основную среду без агара плюс:

500 мг/л цефотакаима

6 мг/л кинетина

1,5мг/  IAA

В качестве селективной среды используют основную среду плюс: .6 мг/л кинетина

1,5 мг/л IAA

100 мг/л ванкомицина

Одно из следующих селективных  е- 0 карств в зависимости от конструкции Agrobacterlum:

100 мг/л канамицина

50 мг/л гигромицина

100 мг/л хлосульфурона 5 В качестве регенерационной среды используют основную среду плюс:

0,1 мг/л ВАР

ТОО мг/л ванкомицина

Описанные выше селективные лекарст 0 ва

В качестве корнеобразующей среды используют OMS плюс:

2 MKMlBA

100 мг/  ванкомицина

5 описанные выше селективные лекарства - - -.. .

ПримерЮ. Ген SURB-Hra табака, кодирующий гербицидустойчивую АЛ С, используют дл  трансформации Medicago 0 sativa, сорт Rangelander.

Рйстени  выращивают и субкультивируют в OMS. Используемыми Материалами  вл ютс  черешки и сегменты стебелька (длиной 5 мм) от растений приблизительно 5 через 2 мес ца после последней субкультуры.

Черешки и стебли стерильных растений разрезают на 5 мм отрезки при помощи нового острого скальпел . Эти эксплантаты погружают в культуру Agrobacterlum лог-фа- 0 зы, полученную, как описано в примере 1, перенос т к свежим чашкам дл  совместного культивировани  и культивируют при 24°С в течение 3 суток (16 часов в день).

Бактерии убивают путем промывки экс- 5 плантатов в течение трех часов с осторожным перемешиванием в промывочной среде и культивируют на свежих чашках с селективной средой,

Эксплантаты субкультивируют каждые .0 3-4 недели, Через приблизительно один мес ц заметен трансформированный каллюс, выросший из обработанных концов эксплантатов , которые отрезают от эксплантата и высевают на свежие селективные 5 среды. Когда каллюс становитс  более организованным (участки более темно-зеленые и более компактные), его перенос т к свежим средам дл  созревани .

Когда по вл ютс  развившиес  зародыши/их перенос т к средам дл  прорастани . После прорастани  маленькие растени  выращивают на этой же среде.

Менее 1 % эксплантатов развивают кал- люс, устойчивый к канамицину при концен-, трации -ТОО мг/л. Канамицинустойчивые секторы наход т устойчивыми к гербициду хлорсульфурон при концентрации 50 ч. на млрд. Из канамицинустойчивого к ал л юса получают 3 всхода. Ткань из этих трансформантов испытыва ют на гербицидустойчивый рост при разных концентраци х хлорсульфу- рона. Один трансформант способен расти при концентрации хлорсульфурона 1000 ч. на млрд. Остальные два способны расти при 5000 ч. на млрд. Таким образом, ген SURB- Нга табака может использоватьс  дл  трансформации люцерны и обеспечивает высокий уровень гербицидной устойчивости.

Среды

OMS

Соли MS и Яв ЭДТК1х Витамины В5 1х Сахароза 3% MES ЗмМ рН5,7

Агар0,8% Автоклавиррвание в течение 20 мин.

Основна  среда

Соли MS и Fe ЭДТК1х Витамины UM 1х Сахароза 3% рН 5,7

Агар0,8% Автоклавирование в течение 20 мин. 100х витамины UM (количества указаны дл  100 мл загрузки ЮОх)

Тиамин HCIt r Никотинова  кислота 0,5 г Пиридоксин HCI 1 г Миоинозит 10 г Глицин 0.2 г Среда дл  совместного культивировани : Основна  среда плюс; 100 мкм ацетосирингона {ацетосирин- гон сохран ют в виде смеси 100 мМ в ДМСО) 2,4-D 0,5 мг/л ВАР 0,2 мг/л Промывочна  среда Основна  среда без агара плюс: Цефотаксим 500 мг/л 2.4-D 0.5 мг/л ВАР 0,2 мг/л

Селективна  среда Основна  среда плюс 2.4--D0.5 мг/мл ВАР 0.2 мг/л Ванкомицин 100 мг/л Одно из следующих селективных лекарств , в зависимости от конструкции Agrobacterlum

Гигромицин50 мг/л Хлорсульфурон 100 мг/л Среда дл  созревани : то же, что и селективна  среда, но без 2,4-D

Среда дл  прорастани : Основна  среда плюс ванкомицин100 мг/л Селективное лекарство, как описано выше. Форму  а изобретени  Способ получени  двудольных растений , устойчивых к сульфонилмочевине, предусматривающий получение суспензионных каллусных культур, отбор клеток, культивирование каллусной ткани и получение регенераторе , устойчивых к гербициду, о т л и ч а- ю щи и с   тем, что перед получением суспензионных каллусных культур конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pHraB1NpAGS152, или р735114, или p735D, или р735Н, или р73592, или рМ78, или рМ7А, или рМ7СА, или рМ7О.8, или рМ7Н8, или pM7AD, или рМ7АН, или рМ7А92. или рМ7А8, или pGVKAP, или pAGS589, или pAGS596, или pHGS594, или pAGS591, или P5T35D, или р5Т35Н, или pAGS351, или PAGS381, или pAGS140 с геном SURB-Hra, кодирующую мутантную ацетолактатсинта- зу табака, в которой Ala 122 замещен на Pro, или Pro 197 на Ala, или Pro 197 на Gin, или Pro 197 на Ser, или Ala 205 на. Asp, или Тгр 591 на Leu. или Ala 122 на Тгр и Тго 591 на Leu, или Pro 197 на Ala и Ala 205 на Asp, или Pro

197 на Gin и Ala 205 на Asp, и Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu, или Pro 197 на Gin и Тгр 591 на Leu, или Pro 197 на Ser и Тгр 591 на Leu, или Ala 205 на Asp и Тгр 591 на Leu, или ацетолактатсинтетазу Arabiodopsls, в которой Pro 197 замещен на Ser, или ацетолак- татсинтетазу сахарной свеклы, в которой Ala 122 замещен на Pro, или Pro 197 на Ala, или Тгр 591 на Leu. или Pro 197 на Ala и Тгр 591 на Leu, и трансформируют полученными ДНК клетки Brassica, или картофел , или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника, или люцерны и отбирают трансформированные клетки.

.Таблица1

Результаты каллюсовых тестов табака, зараженного GVKNT13.

Количество трансформированных ростковых эксплуантатов, продуцирующих каллюс на селективных и неселективных средах :

Штамм Agrobacterlum, содержащий плазмиду Т|, несущую ген АЛС табака и ген NOS/NPTII (канамицинустойчивость)

Штамм Agrobacterlum, содержащий плазмиду TI, несущую только ген NOS/NPTII

Штамм Agrobacterium, содержащий плазмиду Т1 (лишенную либо гена АЛС табака, либо гена NOS/NPTH).

.Та бл ица2

Спонтанные мутации дрожжевого гена АЛС, привод щие к устойчивости к сульфонилмочевинномугербициду

Т   .6 л и ц а 3

Сайт-направленные мутации дрожжевого гена АЛС. привод щие к устойчивости к сульфонилмочевинному гербициду

.Т а б л и ц а 4 Перенос ДНК из фэгового клона 1 в чувствительные клетки N;tabacum

Некультивируемые совместно (контрольные) растительные клетки. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaclens, содержащим

плазмиду pAGS145, с канамицинустойчивым вектором, содержащим ген табака дл  . экспрессии гербицидчувствительной АЛС из фаговрго клона 1.

Табл и ца5 :Перенос ДНК из фагового клона 3 в чувствительные клетки N.tabacum

Некультивируемые совместно (контрольные) растительные клетки.:

Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens. содержащим плазмиду pAGS 112, с канамицинустойчивым вектором.

Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaclens, содержащим плазмиду pAGS152, с канамицинустойчивым сектором, содержащим фаговый клон 3.

.:. ;. .. ... :- . . . ; . ..- .. ..-. Табл ица б

Уровень устойчивости к хлорсульфурону в клетках N.tabacum сорта W38, трансформированных мутантным геном АЛС 100 колоний, высе нных при каждом уровне хлорсульфурона.

Колонии, полученные из некультивированных (контрольных) растительных расте- /ний. -; . ... ; / ..... . ..;... ... - . . .. ..

Колонии, полученные в результате совместного культивировани  (контрольных)

растительных клеток с A.tumefaclens, содержащей pAGS152 и первоначально селектированную за счет устойчивости к хорсульфурону при концентрации 2 ч/млрд.

Таблица

Эксперимент 3 по повторному введению АЛС

Перенос ДНК из фаговых клонов 31. 35 и 36 к чувствительным клеткам N.tabacum Число колонийобразующих единиц, происход щих от ТО5 протопластных эквивалентов через один мес ц после совместного культивировани 

1. Некультивируемые совместно растительные клетки.

2. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens, содержащим pAGS 152, субклон S4/Hra.

3. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens, содержа- . щим pAGS312, сублокон СЗ, фЗ Т (ориентаци  1)..

4. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens, содержащим pAGSS 13, субклон СЗ, ф31 (ориентаци  2).

5. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens, содержащим pAGS35l, субк он СЗ. ф35.

6. Растительные клетки, культивируемые совместно с A.tumefaciens, содержащим pAGS381, субклон СЗ, ф38.

Та б л и ц а 8

Гербицидна  устойчивость в растительных клетках, трансформированных сайтспецифиче- скими мутантными генами АЛС сахарной свеклы

ТаблицаЭ

1 Активность АЛ С в каждой линии относитс  к активности в отсутствие гербицида, котора  принимаетс  за 100%. Используемый гербицид на основе сульфонилмоче- вины представл ет собой DPX-F6025 (Classic ) при концентраций 10 ч.на млрд; 2Устойвое потомство способно расти при указанных концентраци х гербицида PPX-F6025 (Classic)

Активность АЛ С томатов трансформированного и дикого типов

Активности АЛ С в каждой линии относ тс  к активности в отсутствие гербицида, которую принимают за 100%. В качестве соединени  сульфонилмочевины используют DPX-F6025, которое  вл етс  действующим началом в гербициде Classic.

Лини  87193 Beta vulgarls, трансформируема  LBA4404 Agrobacterium tumefa- clens, несущим плаэмиду pAGS152. 2Нетрансформированна  лини  87193 Beta vulgaris.

Продолжение табл. 9

Таблица 10

Та б л ица 11

нормальный рост, никакой осевой индукции; -и-уменьшенный рост, сублетальный у пчелы, осева  индукци ; + уменьшенный рост, летальный у пчелы, осева  индукци ; -летальный.

Таблица 13 Активность АЛС Brasslca napus дикого типа трансформированного Brassica napus

Активности АЛС даны по отношению к активности в отсутствие гербицида, котора  принимаетс  за 100%. Используемым соединением сульфонилмочевины  вл етс  хлорсульфурон (DPX-W4189), который представл ет собой действующее начало в гербициде GleanR.

Таблицам

Т ; б л и 11   12 10 ч. на млн.