JPH08509860A - ジェミニウィルスを基礎とする遺伝子発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 課題の核酸フラグメントのコントロール発現を獲得するためのジェミニウィルスを基礎とするベクター系を開示する。cDNAスクリーニングを利用して組織特異的調節領域を同定し、そして得られる組織特異的調節領域を、植物細胞への導入のため、ジェミニウィルスベクターにとって固有でない核酸配列の転写及び／又は発現を供するようジェミニウィルス構築体において使用できるように操作する。このベクター系は、改質された表現特性を有する細胞、組織又は器官を有する形質転換植物を提供するのに利用できうる。

Description

【発明の詳細な説明】 ジェミニウィルスを基礎とする遺伝子発現系 序論 技術分野 本発明はジェミニウィルス（geminivirus）を基礎とするベクターを利用する 植物細胞への核酸の導入に関する。より詳しくは、本発明のトランスフェクト植 物細胞中での導入遺伝子の組織特異的発現を供するジェミニウィルスベクターの 利用に関する。 背景 数多くの用途に関し、遺伝子発現を植物の成長の特定の段階において、又は特 定の植物細胞、組織もしくは器官においてコントロールできることが所望される 。この目的のため、植物の発育及び再生に対してひどく有害な作用を及ぼすこと なく適当な細胞タイプにおいて及び／又は植物の発育における適当な時期におい て所望の転写又は発現の開始を供することのできる方法が必要とされている。一 般に、遺伝子操作技術は個々の原核及び真核細胞の、特に培養物の表現型を改質 することに向けられている。植物細胞は、少なくともある程度、適当なベクター 系の欠如に基づき、他の真核細胞よりも遺伝子導入しにくいことが証明されてい る。 ジェミニウィルスは二成分系一本鎖植物DNAウィルスである。それらは環状一 本鎖（ss）DNAを有し、そのゲノムは対になった「双生」正二十面体粒子の中に 封入されている。この封入されたssDNAは宿主細胞の核の中で、おそらくはロー リングサークルメカニズムにより、環状二本鎖DNA中間体を介して複製される。 大量の一本鎖及 び二本鎖ウィルスDNAの両者の刺激をもたらすウィルスDNA複製は、複製過程自体 にとって必要である、又は複製もしくはウィルス転写を促進するのに必要である わずかなウィルスタンパク質の発現にのみかかわっている。従って、ジェミニウ ィルスは宿主のそのゲノムをコピーし、そしてその遺伝子を発現するしくみに主 に依存しているようである。 ジェミニウィルスは単子葉類又は双子葉類のいづれかにおける宿主域を基礎に 、及び昆虫媒介体がヨコバイ（leaf hopper）であるか又はコナジラミ（white f ly）種であるかを基礎に副分類されている。数のふえつつあるジェミニウィルス のゲノムの分子分析及びこの分類を補強する。単子葉類ジェミニウィルスは全て ヨコバイにより伝搬され、そしてそのゲノムはサイズにおいて約2.7kbの一本鎖s sDNAを含んで成る；最も小さい公知の感染性DNAであるこのタイプのゲノムは、 ホイート・ドゥウォーフ・ウィルス（wheat dwarf virus）に代表され、それは このサブグループ由来の数多くのクローン及び配列決定されているものの一つで ある。反対に、双子葉類に感染するほとんどの構成員はコナジラミであるベミシ ア・タバチ（Bemisia tabaci）により伝搬され、そしてアフリカン・カッサバ・ モザイク・ウィルス（ACMV）、トマト・ゴールデン・モザイク・ウィルス（TGMV ）及びポテト・イエロー・モザイク・ウィルスにより代表される、同じぐらいの サイズのDNA（通常Ａ及びＢと呼ばれる）を含んで成る二分節系ゲノムを保有し ている。植物の有効な感染のためには、両方のゲノム成分が必要とされる。ビー ト・カーリー・トップ・ウィルスは上記２つのサブグループの間の固有の中間的 な位置を占めており、なぜならそれは双子葉類に感染はするが、DNAAに相当する 一つのゲノム成分しか含まないからである。それはおそらくはヨコバイ伝搬に対 する順応の結果である。 二分節系サブグループは双子葉類に感染するウィルスのみを含む。典型的なの はアフリカン・カッサバ・モザイク・ウィルス（ACMV）ゲノムであり、これは共 通領域として知られる相同性領域（約200ヌクレオチド）を含むそれぞれ約2.7kb の２つの環状一本鎖DNA分子を含んで成る。配列及び突然変異誘発分析から、DNA Aは４つのオープンリーディングフレーム（ORF）をエンコードすることが知ら れている。このORFはゲノム成分及びその共通領域に対する配向、即ち、ウィル ス（Ｖ）に対する相補性（Ｃ）に従って命名されている：AC１は複製にとって必 須のポリメラーゼ遺伝子であり；AC２はウィルス伝染にとって必要であり；AC３ はDNA複製の調節因子であり；そしてAV１はコートタンパク質遺伝子である。DNA Bは２つのORF，BC１及びBV１有し、その両者はウィルス伝染にとって必要であ る。ORFの整列は、それらが二方向状において発現されることを示す。５つの主 要転写体が同定され、そしてこれらは独立のAV１，BV１，BC１及びAC１のORF並 びに一緒のAC２／AC３ ORFに地図化されている。AC２はコートタンパク質遺伝 子AV１の生産を刺激するトランス作用性（transacting）因子をエンコードする ことが示されている。 二分節系グループ由来の他の例はトマト・ゴールデン・モザイク・ウィルス（ TGMV）であり、これはACMVと同様に、共に感染にとって必要とされる同一サイズ の２つの環状DNA分子より成る。２つのゲノム成分の配列分析は６つのオープン リーディングフレーム（ORF）を示す；４つのORFはDNA Aにより、そして２つはD NA Bによりエンコードされる。両成分において、ORFは保存型230ヌクレオチド遺 伝子間領域（共通領域）から分れ、そして二本鎖複製式DNAから二方向的に転写 される。ORFはゲノム成分及び共通領域に対する配向に従って（即ち、左、対、 右）命名される。AL２遺伝子生成物 はTGMVコートタンパク質遺伝子の発現をトランス作用せしめる。 ACMVとTGMVの２つのDNA成分間では、約200塩基のほぼ同一の共通領域を除き、 わずかな配列類似しかないが、２つのゲノムの中のORFは類似であり、そしてコ ートタンパク質遺伝子のトランス作用転写のためのAL２遺伝子生成物について同 一の条件がある。いくつかの二分節系ジェミニウィルス由来のAL２配列の研究は 、このタンパク質がトランス作用性調節タンパク質より予測される一般的な特徴 を有することを示した。AL２機能にとっての条件は、コートタンパク質の発現を 、dsDNA増幅が起こるのに十分な時間のために遅らせることであると考えられる 。 コートタンパク質ORFが異種コード配列により置換されているベクターが開発 されており、そしてこの異種コード配列はコートタンパク質プロモーターより発 現される。しかしながら、このコートタンパク質の発現はトランス作用性調節タ ンパク質の合成に依存するため、コートタンパク質プロモーターからの異種配列 の発現の時期はトランス作用性調節タンパク質の発現の時期に依存する。従って 、トランス作用性調節タンパク質の発現の時期が変更されているベクターを開発 し、これによりコートタンパク質プロモーター由来の発現、それ故コートタンパ ク質ORFの代わりに挿入した異種配列の発現の時期を変更することに感心がもた られるであろう。 Ａゲノム成分はウィルスDNAの複製及び封入にとって必要な全てのウィルス性 情報を含み、一方、Ｂ成分は感染植物にわたるウィルスの移動にとって必要な機 能をエンコードする。これらのウィルスのDNA A成分は、植物細胞のゲノムの中 に全長よりも大きいものとして挿入したとき、又はコピーを植物細胞の中にエレ クトロポレートしたとき、DNA Bの非存在下で植物細胞において自己複製可能で ある。 関連文献 ジェミニウィルスに関する文献には以下のものが含まれる：R.H.A.CouttsらAu st.J.Plant Physiol.（1990）17：365-75；Ann HaleyらVirology（1992）188：9 05-909；Garry SunterらThe PlantCell（1992）４：1321-1331；Clare L．Broug hらVirology（1992）187；1-9；Garry SunterらVirology（1991）180：416-419 ；及びGarry Sunterら（1990）Virology（1990）179：69-77。 植物の種子組織、例えば胚又は種子コートの中で優先的に発現される遺伝子も 報告されている。例えばヨーロッパ特許出願第87306739.1（1988年２月23日にお いて0,255,378として公開）及びKridelら（Seed Science Research（1991）１： 209-219）を参照のこと。 開花から果実の発育、そして少なくとも成熟の開始に至るまでに、又はその最 中に発現される果実特異的プロモーターのクラスが、その開示内容を引用するこ とで本明細書に組入れるヨーロッパ出願88.906296.4に記載されている。綿繊維 の中で優先的に発現されるcDNAクローンが単離されている。単離されたクローン の一つは後期一次細胞壁合成及び初期二次細胞壁合成段階中の最も多いmRNA及び タンパク質に対応する。John Crow PNAS（1992）89：5769-5773。果実の発育中 に示差的な発現を示すトマト由来のcDNAクローンが単離及び特定されている（Ma nssonら、Mol.Gen.Genet.（1985）200：356-361：SlaterらP1ant Mol.Biol.（19 85）５：137-147）。 psbA（光学系IIの成分の１つ）にとっての成熟プラスチドMRNAは果実発育の後 期において最高レベルに達し、一方、成熟の開始後、光学系Ｉ及びIIの他の成分 にとってのプラスチドmRNAはクロモプラストの中で検出できないレベルにまで低 下する（PiechullaらPlant Molec.Biol.（1986）７：367〜376）。近年、トマト の花粉（McCormickらTomato Biotechnology（1987）Alan R.Liss， Inc.，NY） と雌 しべ（GasserらPlant Cell（1989），１：15〜24）との相互作用に明らかにかか わっている遺伝子を代表するcDNAクローンも単離及び特定されている。 その他の研究は、誘発的に調節される遺伝子、例えばトマトの傷つきに応答し て発現されるセリンプロテイナーゼインヒビターをエンコードする遺伝子（Grah amらJ．Biol．Chem．（1985）260：6555-6560：GrahamらJ.Biol.Chem.（1985）2 60：6561-6554）並びに傷ついた後の成熟中の果実及び葉におけるエチレン合成 に係るmRNAS（SmithらPlanta（1986）168：94-100）を焦点としている。傷つい たポテト植物の葉の中でのメタロカルボキシペプチダーゼインヒビタータンパク 質の蓄積が報告されている（GrahamらBiochem Biophys Res Comm（1981）101：1 164-1170）。 アグロバクテリア（Agrobocterium）媒介型綿形質転換がUmbeckの米国特許第5 ,004,863及び5,159,135号に記載され、そして粒子ボンバードメントによる綿形 質転換が1992年９月17日公開のWO 92／15675の中で報告されている。アブラナ（ Brassica）の形質転換がRadkeらにより述べられている（Theor.Appl.Genet.（19 88）75；685-694；Plant Cell Reports（1992）11：499-505）。 栽培トマトの形質転換がMcCormickらPlant Cell Reports（1986）５：81-89及 びFillattiらBio／Technology（1987）５：726-730に記載されている。 発明の概要 発現カセット及びトランスファーベクターを含む新規の組換ジェミニウィルス 構築体を提供し、これはジェミニウィルスにとって固有でないタンパク質のトラ ンスフェクト植物細胞の中でのコントロール転写及び／又は発現を可能にする。 更に、改変された遺伝子 型及び／又は表現型を有するトランスフェクト植物細胞を作るための発現カセッ トを作るための方法及びそれらの利用方法を提供する。この発現カセットは、バ イナリープラスミドの中で組合せることのできうるトランス作用化性（transact ivatable）発現カセット及びトランス作用性発現カセットを含む。このトランス 作用化性発現カセットは、作動連結された成分として、ジェミニウィルスコート タンパク質遺伝子より獲得できる転写開始ユニット、ジェミニウィルスコートタ ンパク質遺伝子の全長コード配列以外の核酸フラグメント、及び転写終止領域を 有する。このトランス作用性発現カセットは作動連結成分として、１もしくは複 数の植物細胞のタイプ、組織もしくは器官の中で構成的でなく発現される遺伝子 。５′非コード領域から獲得できる転写開始ユニット、トランス作用性調節タン パク質をエンコードするジェミニウィルス遺伝子由来のコード配列を含んで成る DNAフラグメント及び転写終止領域を有する。トランスフェクト植物細胞は、植 物細胞を組換ジェミニウィルストランスファーベクターと接触させることにより 作ることができ、ここでこのトランスファーベクターはトランス作用性及びトラ ンス作用化性発現ベクターの組合せを含んで成りうる。他方、トランスファーベ クターの組合せ、例えばゲノムの中のDNA AのACMV AC2遺伝子の該当物が不活性 化されており、そしてゲノムの中のコートタンパク質遺伝子のコード配列の少な くとも一部がこのジェミニウィルスにとって固有でない核酸フラグメントで置き 換えられており、且つDNABのACMV AC2遺伝子の該当物の５′非コード領域が、コ ートタンパク質の５′非コード領域と組合さって転写ユニットを含んで成る核酸 フラグメントで置き換えられているゲノムと；トランス作用発現カセットとを有 するジェミニウィルスを使用してよい。 図面の詳細 図１はジェミニウィルスを基礎とするバイナリープラスミドの構築を示す。 特定の態様の詳細 本発明に関し、トランスファーベクターを含む新規の組換ジェミニウィルス構 築体並びにその製造及び使用方法を説明する。植物細胞をトランスフェクトする ために使用するとき、このトランスファーベクターは１又は複数の植物細胞タイ プの中での核酸フラグメントのコントロール転写又は発現の可能な遺伝子導入植 物細胞を提供する。ベクターの中で利用する調節配列の種類に依存して、この核 酸フラグメントの転写又は発現は、１又は複数種の特定の細胞タイプ、例えば種 子もしくは胚細胞、又は例えば花粉果粒もしくは植物の子房に由来する細胞、例 えば綿繊維において（他の植物細胞と比較して）特定の刺激、例えば昆虫による 攻撃の如くの植物の傷つき、又は環境的ストレス、例えば熱もしくは高塩度に応 答して生じうる。特定の組織及び／又は植物器官が改変された表現型を有する植 物が本発明により作られうる。 この構築体は、その意図する用途に依存していくつかの形態を含む。即ち、こ の構築体は、ベクター、転写カセット、発現カセット及びバイナリープラスミド を含む。２つの基本的な構築体が必要とされ、それらは植物細胞をトランスフェ クトし、そして核酸フラグメントのコントロール転写又は発現が可能な遺伝子導 入植物細胞を獲得する様々な方法で組合せられうる。これらの２つの構築体はト ランス作用化性発現カセット及びトランス作用性発現カセットを含む。 トランス作用化性発現カセットは作動連結成分として、ジェミニ ウィルスコートタンパク質遺伝子から獲得できる転写開始ユニット、ジェミニウ ィルスコートタンパク質遺伝子の全長コード配列以外の核酸フラグメント及び転 写終止領域を有する。この発現カセットは、コートタンパク質遺伝子の天然コー ド領域を、ジェミニウィルスコートタンパク質遺伝子の全長コード配列以外の核 酸フラグメント、特にコートタンパク質遺伝子の起源であるジェミニウィルスに とって固有でないコード配列と交換することにより調製できうる。 この「転写開始ユニット」はコートタンパク質遺伝子の５′非コード領域より 獲得できるジェミニウィルスゲノムフラグメントを含んで成り、ここでこのフラ グメントはジェミニウィルストランス作用性調節タンパク質による活性化を経て 作動連結核酸フラグメントの転写を担うのに十分なサイズ及び核酸配列のフラグ メントである。「獲得できる」とは、天然配列からの転写を活性化するジェミニ ウィルストランス作用性調節タンパク質による活性化を経た作動連結核酸フラグ メントの転写を担うのに十分なほどに天然ジェミニウィルスコートタンパク質転 写開始ユニットのDNA配列に類似するそれを有する転写開始ユニットを意図して いる。獲得できるものには、天然及び合成配列の両者、並びに合成と天然配列の 組合せでありうる配列が含まれる。「固有でないコード配列」なる用語は、請求 の範囲の発明の組成物の調製にとって必要である特定のジェミニウィルスの未改 質ゲノムの中で認められないコード配列を意味する。改質ジェミニウィルスコー ド配列は、突然変異、トランケーション、他の配列への接続等のいづれにより改 質されていようと、固有でないコード配列を構成する全長コード配列以外の配列 を含んでいる。 トランス作用性発現カセットは作動連結成分として、１又は複数種の植物細胞 タイプ、植物組織もしくは植物器官の中で構成的でな く発現される遺伝子の５′非コード領域から獲得できる転写開始ユニット；トラ ンス作用性調節タンパク質をエンコードするジェミニウィルス遺伝子由来のコー ド配列を含んで成るDNAフラグメント又は同一もしくは類似のトランス作用活性 を有するその同族体；並びに転写終止領域を有する。 トランスフェクションのためにはトランス作用化性発現カセット及びトランス 作用性カセットはバイナリープラスミドを形成するように組合されるか、又はこ の２つの発現カセットは細胞の中に別々のプラスミド上で導入されうる。「構成 的でなく発現される遺伝子」とは遺伝子であってその転写が経時的に、例えば、 組織発育段階に関係して、例えば子房細胞における開花前から果実成熟に至る段 階に関係して、及び／又は転写の組織に関係して（例えば葉に比べ果実において 優先的に）、ポジティブに、又はネガティブにコントロールされる遺伝子を意図 している。 トランスファーベクターはウィルスゲノムに更なる改質を施すことによって調 製される。コートタンパク質遺伝子のコード配列は、転写又は発現のための核酸 フラグメントをクローンすることのできうる制限部位で置き換える。このトラン スファーベクターはバイナリーベクター上のトランス作用性カセットと組合せる か、又は細胞の中に別々のプラスミド上で導入できうる。 更なる自己複製トランスファーベクターを、コートタンパク質にとってのコー ド領域が、転写又は発現のための核酸フラグメントをクローンすることのできう る制限部位により置き換えられており、且つ構成的でなく発現される遺伝子由来 の５′非コード領域が好適にはAC１コード領域に対して３′側に、且つAC２遺伝 子のコントロール発現を可能とするようにAC２コード領域に対して５′側に挿入 されている改質ジェミニウィルスから構築できうる。活性AC２の発 現のため、AC１コード領域の中に包括されるAC２コード領域の部分の再構築が必 要とされうる。自己複製式ベクターを植物の中に単独で、又はバイナリーベクタ ーの一部として導入できうる。自己複製式ジェミニウィルストランスファーベク ターの調製のための改質ジェミニウィルスゲノムにとっての、又はトランス作用 性調節タンパク質コード配列もしくはコートタンパク質遺伝子由来の転写開始ユ ニットを含んで成るジェミニウィルスDNAフラグメントにとっての起源として、 任意のジェミニウィルスゲノムを使用してよい。トランス作用性及びトランス作 用化性発現カセットの調製のために利用するジェミニウィルスゲノムフラグメン トは、このトランス作用性調節タンパク質及びコートタンパク質転写ユニットが 相互作用してこのコートタンパク質転写ユニットに作動連結している核酸フラグ メントの転写を供することができる限り、同一又は異なるウィルスに由来しうる 。適当なジェミニウィルスの例には、ACMV，TGMV、ポテト・イエロー・モザイク ・ウィルス、BGMV、ビート・カーリー・トップ及びスクアッシュ・リーフ・カー ルが含まれる。Harrison（1985）Ann．Rev．Phytopath．23：55-82。 トランス作用性発現カセットは、植物細胞の中で構成的でなく発現される遺伝 子から獲得できる５′非コード領域部分であって、その遺伝子に作動連結してい るトランス作用性調節タンパク質についてのコード配列の発現を担うのに十分な 部分を利用することにより、トランス作用性調節タンパク質のコントロール発現 を供する。この転写及び翻訳開始領域（これは時折り「プロモーター」と呼ばれ る）は好ましくは転写開始調節領域と、mRNAをリボソームに結合せしめて転写開 始させるのに重要な「リボソーム結合部位」である非翻訳５′配列の翻訳開始調 節領域とを含んで成る。この開始コントロール領域の転写及び翻訳機能要素は全 て同一遺伝子に由来するか 、又は獲得できることが好ましい。一定の態様において、このプロモーターはエ ンハンサーの如くの配列の付加、又は非本質的及び／もしくは所望されない配列 の欠失により改質されるであろう。「獲得できる」とは、課題のDNA配列の転写 の所望の特異性を担うほどに天然プロモーターのDNA配列に十分に類似するそれ を有するプロモーターを意図している。それには天然及び合成配列、並びに合成 と天然配列との組合せでありうる配列が含まれる。 この調節領域はジェミニウィルストランス作用性タンパク質のコントロール発 現を誘導することができる。「コントロール発現」とは、１又は数タイプの植物 細胞の中では起こるが、他の細胞においては全く又は低レベルでしか起こらない 発現を意図する。この発現は、限られた数の細胞タイプにおける特定遺伝子の発 現の開始及び停止をもたらす発育変化もしくは外部刺激又はその他の変化の結果 でありうる。開花から満開に至るまで子房細胞の如くの細胞においては発現を誘 導するか、受粉及び／もしくは受精付近時において起こる初期変化の後では、又 はその他の植物組織においては発現をわずかに又は全く誘導しないプロモーター が、コントロール発現を誘導できる調節領域の例である。その他の例には、葉に 対する損傷、例えば傷をつける昆虫により損傷を受けた葉細胞においては発現を 誘導するが、他の組織においてはわずかもしくは全く発現を誘導しないプロモー ター；発現塊茎の改質の例としてのパタチン由来の転写調節領域；及び農業環境 （agrisphere）の高められた塩度の如く環境的刺激に応答して高められた発現を 誘発するプロモーターが含まれる。一定の態様において、特定の１又は複数の組 織において発現を選択的に調節することが所望されるであろう。例えば、種子組 織、例えば胚及び種子コート組織における発現の選択的調節が、種子生成物、例 えば種子油、デンプン及び貯蔵タンパク質の改質のた めに所望される。種子油の改質のため、様々な表現型の変更が課題となる。これ らには、種子油の脂肪酸組成の改質、例えば様々な脂肪酸の比率及び／もしくは 量の変更、鎖長の変更、飽和度の変更、等が含まれる。これらの結果は、１又は 複数種の内因性生成物、特に酵素もしくは補因子の発現性の低下を供することに より；天然遺伝子の転写生成物に対して相補的な転写生成物を生成せしめ、その 遺伝子生成物の発現を阻害することにより；又は脂肪酸合成に係る内因性もしく は外因性の遺伝子の発現を供することにより；達成できる。特に課題となるのは 、貯蔵タンパク質、例えばナピン、クルシフェリン、β−コングリシニン、ファ セオリン、ゼインもしくは油体、例えばオレオシンに係る転写開始領域、又は脂 肪酸合成に係る例えばアシルキャリアータンパク質（ACP）、ステアロイル−ACP デサチュラーゼ及び脂肪酸シンターゼに関与する遺伝子、並びに胚発育中に発現 されるその他の遺伝子、例えばBce4である。例えば、ACPプロモーターは脂肪酸 生合成改質にとっての適当な時期的パターンを供し、そして本明細書に記載の方 法は、所望の遺伝子生成物の転写又は発現のレベルをACP発現の特定の期間にわ たり高めるのに利用されうる。 例えば、翻訳を開始させる、一定の子房組織、例えば子房珠皮（「胚珠表皮細 胞」としても知られる）、コア又は果皮組織等において発現させることのできる ５非翻訳配列と一緒に用いたとき、この転写開始領域は所望の表現型改質をより 有効に及ぼすように特定の組織において課題のDNA配列によりエンコードされる 所望の情報を誘導できる。例えば、子房壁及び／又は子房コア組織としても知ら れる子房果皮組織における発現は、数多くの果実、例えばトゥルーベリー、例え ばトマト、グレープ、ブルーベリー、クランベリー、カラント及びナス；ストー ンフルーツ（石果）、例えばチェリー、 プラム、アプリコット、ピーチ、ネクタリン及びアボガド；並びに集合果実（小 石果）、例えばラズベリー及びブラックベリーの食用部分に有用な改質をもたら しうる。ミカン状果（オレンジ、柑橘類）において、かかる発現カセットは果実 の「ジューシー」な部分の中で発現されるものと予測される。ウリ状果（例えば スイカ、カンタロープ、ハニージュー、キュウリ及びスクアッシュ）において、 該当の組織はほとんどが内部食用部分である。他の果実、例えば豆果においては 、該当の組織は種子さやである。 非食用果実の類似構造の改質も課題となりうる。即ち、特に課題となるのは、 少なくとも子房外部果皮組織の中で発現性である転写開始領域である。例えば、 綿において、類似の子房構造は綿さやであり、なたねにおいては、それは種子さ やである。似たように、子房珠皮及び／又はコア組織における発現の調節は、類 似の果実又はそれから発達する関連の構造体、例えば種子コート毛、例えば綿繊 維に有用な改質をもたらしうる。綿繊維は胚珠の外部珠皮の分化した単上皮細胞 である。それは４つの異なる成長期を有する；開始、伸長（一次細胞合成）、二 次細胞合成及び成熟。繊維の発育の開始はホルモンにより誘引されるようである 。一次細胞は伸長期の際に広がり、25日間の後開花（DPA：days postanthesis） に至るまで続く。二次細胞の合成は伸長期の終了前に始まり、そして約40DPAま で続き、ほぼ純粋なセルロース壁を形成する。子房組織プロモーターの他に、種 子組織、特に種子被膜組織の中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域 も、綿繊維細胞の改質を考慮する場合に適用の課題となる。 アブラナ種子コート細胞の中で高レベルにおいて発現される遺伝子の例はEPA 0,255,378号に記載のEA９遺伝子である。EA9 CDNAの一部の核酸配列がその中で 提供されており、そしてプロモーター領 域を含む対応の配列を獲得するために利用できる。種子胚及び種子コート細胞の 中で発現される更なる種子遺伝子はBce4アブラナ遺伝子である。この遺伝子由来 のプロモーター領域は本発明においても有用である。この遺伝子及び対応のプロ モーター領域は、1991年９月19日に公開のWO 91／13980に記載されている。繊維 特異的タンパク質は発育が調製されている。即ち、繊維細胞において発現される タンパク質由来の転写開始領域も課題である。発育調節繊維細胞タンパク質の例 はＥ６である（John and Crow Proc.Nat.Acad.Sci.（USA）（1992）89：5769-57 73）。Ｅ６遺伝子が繊維の中で最も活性であるが、低レベルの転写が葉、胚珠及 び花において認められる。 特異的に誘導された転写開始領域を獲得するため、以下の段階が採用されうる 。メッセンジャーRNA（MRNA）を所望の発達期の組織から単離する。このMRNAを 次にCDNAクローンを構築するのに用いる。これは、クローンの一次DNA配列の観 点及び集団の中の様々のクローンの豊富さの観点の両方でMRNA集団に該当する。 mRNAを、標的遺伝子が発現されないであろう様々な発育期の組織（他の組織）か らも単離する。所望の組織及び他の組織に由来する放射活性cDNAをcDNAクローン の二重コピーをスクリーンするのに用いる。この事前スクリーンは、両組織にお いて豊富となっているmRNAに対応するもの；いづれの組織においても豊富となっ ていないmRNAに対応するもの；一方の組織においては豊富であるが、他方におい ては比較的豊富でないmRNAに対応するもの；としてcDNAクローンの分類を可能に する。所望の組織においてのみ豊富であるmRNAに対応するクローンを選別し、次 いでこれらの選別クローンを更に特定する。 上記に概略した事前スクリーンのためのハイブリダイゼーションプローブは特 定組織由来の全cDNAであるため、それは最も豊富な配列に主としてハイブリダイ ズする。特にmRNAが豊富でない組織にお ける発現の実際のレベルを決定するため、クローン化配列を、所望の組織及び様 々な所望でない組織の全mRNA集団に対するハイブリダイゼーションプローブとし て用いる。これは特定の組織の中でのmRNAの相対的な豊富さ及びmRNA転写物のサ イズの両方についての情報を提供するノーザンブロットとして一般的に行われる 。 mRNAの豊富さが単一遺伝子由来の転写に基づくものであるか、又はそれが遺伝 子のファミリーからの転写の生成物であるかを知ることは重要である。このこと は、ゲノムサザンブロットをcDNAクローンでプローブすることにより決定できる 。全ゲノムDNAを様々な制限酵素により消化し、そして放射活性cDNAクローンと ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションのパターン及び強度から、mRNA が１もしくは２種の遺伝子によりエンコードされたものであるか、又は大型ファ ミリーの近縁遺伝子によりエンコードされたものであるかの可能性を区別できう る。複数の交差ハイブリダイズする遺伝子のうちどれが所望の組織において見い 出せる豊富に発現されるmRNAをエンコードするかを決定するのは難しいことがあ る。この場合、特定の遺伝子をファミリー構成員の残りから区別できるプローブ を使用することが重要である。 上記のように獲得したcDNAを、オープンリーディングフレーム（有望なタンパ ク質コード領域）及び転写の方向を決定して、その後に所望の標的DNA配列を転 写カセットの中に適正な部位に、且つ適正な配向において挿入できるように、配 列決定できる。cDNAクローンにとっての配列情報は以下に説明する地図化及びサ ブクローニングを含む対応のゲノムクローンの特性化も助長しうる。同時に、転 写配列の隣りにあるコントロール領域を含む完全遺伝子配列を含むクローンにつ いてゲノムライブラリーをスクリーンできる。ゲノムクローンは一般に大きなDN Aセグメント（約10〜20kb）を含み、そ して制限酵素を用い地図化、次いでサブクローンし、そしてどのセグメントが発 育調節遺伝子を含むかを決定するために部分配列決定できうる。 上記の方法を利用し、複数の転写調節性領域が同定された。一例はトマト由来 の転写開始領域であり、これはpZ130 cDNAクローンに対応する配列の発現を調節 する。pZ130クローンにハイブリダイズできる配列、例えばプローブpZ７は、特 に開花の初期において豊富なmRNAを示す。この情報は子房珠皮及び子房外部果皮 組織において発現され、そして他の組織もしくは果実発育の任意の他の段階にお いては発現されないか、又は少なくとも容易に検出はできない。即ち、pZ130転 写開始領域は本発明の目的にとって子房特異的であると考えられる。pZ130転写 開始領域は、その開始内容を引用することで本明細書に組入れるUSPN 5,175,095 に記載されている。 2A11と呼ばれるトマト遺伝子由来のプロモーターを上記の方法を利用して単離 した。2A11プロモーターは豊富な情報を提供し、開花時に又はそのすぐ後に活性 化され、そして赤果実期まで活性であり続ける。2A11プロモーター下にある2A11 遺伝子の発現は果実においてのみ起こる；一般に、検出可能な発現は根、葉又は 幹においては獲得できない。この遺伝子は硫黄含量及びサイズにおいて植物貯蔵 タンパク質に類似する硫黄に富むアミノ酸配列をエンコードする。2A11転写開始 領域は、その開示内容を引用することで本明細書に組入れる1990年７月24日特許 のUSPN 4,943,674及びPCT出願WO 90／04063に記載されている。 組織特異的転写は、遺伝子調節タンパク質が特定の細胞におけるエンハンサー 配列及びその他の上流プロモーター要素に結合していることがあることを示唆し ている。エンハンサー要素（「エンハンサー」）とはそれに連結したプロモータ ーから転写を活性化でき、 正常なRNA出発部位において合成を始めさせる調節DNA配列を意味している；それ は両方向（正常又は反転）において作動可能であり；そしてそれはプロモーター の上流においてもしくは下流において移動したときでさえも機能可能である。エ ンハンサー及び他の上流プロモーター要素は共にその作用を媒介する配列特異的 DNA結合性タンパク質に結合する。 例えば、エンハンサー及びその他の上流要素の機能にとって重要な正確なるヌ クレオチド配列を同定するため、2A11 5′−領域のフラグメントを、核タンパク 質に結合するその能力及び異種プロモーターにおいて機能するその能力について スクリーンする。果実組織及びその他の組織、例えば葉由来の核タンパク質との 結合実験を、エンハンサー及びサイレンス配列の存在を決定するために利用でき うる。このタンパク質結合研究は対応の一連の遺伝子調節タンパク質に結合する 特異的ヌクレオチド配列の位置を正確に示すために利用できうる。 各エンハンサー及びその他の上流プロモーター要素の活性は、複数のタンパク 質に対する結合部位を含みうるDNAのセグメント上に存在する。この結合部位は 一般に、リポーター遺伝子であってその生成物が容易に測定できるもの、例えば Gus遺伝子に連結されたエンハンサー配列の小型の突然変異バージョンを調節す ることにより分析されうる。転写体に及ぼす各突然変異の影響を次に試験してよ い。他方、この領域のフラグメントを調製できる。このエンハンサー配列の突然 変異バージョン又はフラグメントをそれぞれ適当な宿主細胞の中に導入し、そし てリポーター遺伝子の発現の効率を測定できる。この試験におけるエンハンサー 機能にとって必要とされるヌクレオチドはゲル移動性シフト及びDNAフットプリ ンティング研究の手段により、特異的なタンパク質にとっての結合部位として同 定される。リポーター遺伝子の発現を高める単離フラグメントの能力を調べる他 の手段は、TATA CAATボックスは含んで成るが、しかし活性をわずか又は全く示 さないプロモーターより発現レベルを高めることのできる上流領域のサブドメイ ンを探すことにある。かかるプロモーターの例はトランケートされた35Ｓプロモ ーターである（例えば、Poulsen and Chua，Mol.Gen.Genet.（1988）214：16-23 並びにBenfeyらEMBO J.（1990）９：1677-1684及び1685-1696、並びにGilmartin ，Plant Cell（1990）２：369-378を参照のこと）。５′領域のフラグメントを 発現カセットの中のトランケート化プロモーターの前に挿入し、そしてリポータ ー遺伝子の発現に及ぼす作用を評価した。開示内容を引用することで本明細書に 組入れるPCT出願WO 90／04063は、2A11遺伝子を用いて例示して、上流調節性配 列をどのようにして作り、そしてどのようにして利用するかを開示する。 課題のその他のプロモーター領域には、果実の成熟において重要な役割を果た す酵素であるポリガラクツロナーゼの発現を調節するものが含まれる。ポリガラ クツロナーゼプロモーターは少なくとも発芽（breaker）から赤果実段階におい て活性である。他の５′領域、例えば果実において優先的に課題のDNA配列の発 現を供するのに必要とされるPG遺伝子由来のものの最適量を決定するうえで、ス クリーニングは2A11 5′領域について上記した通りにして、リポーター遺伝子、 例えばGusを利用して実施できる。ポリガラクツロナーゼ遺伝子は1985年８月13 日承認のUSPN 4,535,060号、1988年９月６日承認のUSPN 4,769,061号、1989年Ｉ 月３日承認のUSPN 4,801,590号及び1992年４月21日承認のUSPN 5,107,065号に記 載され、それらの開示内容は引用することで本明細書に組入れる。 また、以下の遺伝子に由来する５′非コード領域が課題である： 伸長因子EF-1、これは分裂組織の中で活性であり、そして1993年１月５日承認の USPN 5,177,011号に開示されている；MAC、これは1992年４月21日承認のUSPN 5, 106,739号に開示されている；ヒートショック、これは1993年２月16日承認のUSP N 5,187,267号に開示されている；及びACC／ナピン、これは種子の中で活性であ り、そしてEP 255,378号に開示されている。引用した特許及び出願は引用するこ とで本明細書に組入れる。 転写トランス作用化性カセットは転写方向において作動連結した成分として、 ジェミニウィルスコートタンパク質転写開始領域及び任意的に翻訳開始シグナル 、課題の核酸配列、並びに植物細胞の中で機能的である転写性、且つ任意的な翻 訳終止領域を含むであろう。このカセットが課題の核酸配列の転写及び翻訳を担 うとき、それは発現カセットであると考えられる。１又は複数のイントロンがカ セットの中に存在していてよい。他の配列、例えば所望ならば一過性ペプチド及 び分泌性リーダー配列もトランス作用化性カセットの中に存在していてよい。こ れらの配列をどうやって得る及び利用するかは当業者に公知である。 コートタンパク質の転写／翻訳開始コントロール領域から下流にあり、且つそ の調節コントロール下にあるのは課題のヌクレオチド配列である。このヌクレオ チド配列は課題のポリペプチド、例えば酵素をエンコードする任意のオープンリ ーディングフレーム、又はゲノム配列に相補的な配列（この場合、ゲノム配列は オープンリーディングフレーム、イントロン、非コードリーダー配列、又は任意 のその他の配列であってこの相補性配列が転写、メッセンジャーRNAプロセシン グ、例えばスプライシングもしくは翻訳を阻害するものである配列でありうる） であってよい。本発明のヌクレオチド配列は合成的、天然由来、又はそれらの組 合せであってよい。課題の ヌクレオチド配列の種類に依存して、植物に好適なコドンを有する配列を合成す ることが所望されうる。植物に好適なコドンは、課題の特定の植物種において最 大量で発現されるタンパク質において最も高頻度のコドンから決定されうる。 表現型改質は内因性転写又は翻訳生成物の生産性を（例えば量、相対分布等） 調節することにより、又は外因性転写もしくは翻訳生成物の生産性を（例えば遺 伝子導入宿主細胞又は組織の中で新規機能又は生成物を供するように）調節する ことにより達成されうる。特に課題となるのは、植物果実の発育にかかわる発現 生成物をエンコードするDNA配列、例えばサイトキニン、オーキシン、エチレン 、アブシジン酸等の代謝に関与する遺伝子である。サイトキニンの発現を調節す る方法及び組成物はその開示内容を引用することで本明細書に組入れる米国特許 第5,177,307号に記載されている。他方、その他の真核又は原核細胞を含む起源 、例えば細菌の、例えばアグロバクテリア トゥメファシエンス（Agrobacteriu m tumefaciens）の例えばT-DNAオーキシン及びサイトカイニン生合成遺伝子生成 物、並びに哺乳動物の例えばインターフェロンに由来する様々な遺伝子を使用で きうる。 課題のその他の遺伝子には、中鎖及び長鎖チオエステラーゼ（1991年10月31日 公開のWO 91／16421）、デサチュラーゼ（1991年９月19日公開のWO 90／13972） 、シンターゼ（1992年３月５日公開のWO 92／03564）を含む脂肪酸合成遺伝子； フレーバー遺伝子、例えばSPS（1991年12月26日公開のWO 91／19808）；並びに 成熟遺伝子、例えばアンチセンスポリガラクツロナーゼ（USPN 4,801,540号）、 アンチセンスエチレン遺伝子、例えばACCD、ACCシンターゼ、エチレン生成酵素 （EFE）（WO 91／02958）が含まれる。その他の表現型改質には、子房珠皮及び ／又はコア組織から発育する植物器官、例え ば種子コート毛、例えば綿繊維の色の改質が含まれる。課題となるのはメラニン の生産に関与する遺伝子及びインジゴの生産に関与する遺伝子である。メラニン は動物、植物及び微生物の中で見い出せる濃茶色の顔料であり、いづれも本発明 の構築体への挿入のための配列の起源を担いうる。綿の色、並びに色及び果実の 品質はカルチノイド経路の遺伝子の利用により改質されうる（EP 0,393,690及び WO 91／13078）。 トランス作用化性転写カセットはアンチセンス配列の転写が所望されるときに 使用されうる。ポリペプチドの発現が所望されるとき、課題のヌクレオチド配列 の転写及び翻訳を供するトランス作用化性発現カセットが利用されるであろう。 様々な変更が課題である；これらの変更には、特定の糖類、ホルモン、酵素又は その他の生物学的パラメーターの生成の調節（増大又は減少）が含まれうる。こ れらには、最終果実又は繊維の組成の改質、例えば水、固形物、繊維又は糖の比 率及び／又は量の変更が含まれる。所望される種子改質には油含量、脂肪酸組成 及び貯蔵タンパク質含有量が含まれる。改質の対象となるその他の表現型特性に は、ストレス、生物、除草剤、ブラシがけ、成長調節因子、等に対する応答が含 まれる。これらの結果は１又は複数の内因性生成物、特に酵素又は補因子の発現 の、天然遺伝子の転写生成物に対して相補的（アンチセンス）である転写生成物 を生成して、この転写生成物の成熟及び／もしくは発現を阻害させることによる 、又は特定の組織もしくは植物器官の発育に係るべき内因性もしくは外因性の遺 伝子の発現を供することによる低下を供することによって達成できる。 トランス作用化性及びトランス作用性発現カセットにおいて採用される終止領 域は主に慣用されているものとし、なぜならこの終止領域は比較的互換性である ようであるからである。使用するこの終 止領域は転写開始領域にとって天然であってよく、課題のDNA配列にとって天然 であってよく、他の起源に由来するものであってよい。この終止領域は天然であ るか、又は完全もしくは部分的に合成であってよい。慣用の終止領域はＡ．トゥ メファシエンスのTi−プラスミドより入手できる、例えばオクトパインシンター ゼ及びノパリンシンターゼ終止領域である。一定の態様において、特定の構築体 において利用される転写開始領域に天然な３−終止領域を利用することが所望さ れうる。 様々な構築体は通常、植物細胞の中での選別のためにマーカーに連結されてい るであろう。好都合には、このマーカーは殺生物剤、特に抗生物質、例えばカナ マイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、クロラムフェニコール等に 対して耐性でありうる。採用する特定のマーカーは、導入されているはずのDNA を欠く細胞に対する形質転換細胞の選別を可能にするものであろう。本発明の転 写カセットを含むDNA構築体の成分は、宿主にとって天然（内因性）又は外来（ 外因性）である配列から調製されうる。外来とは、その配列が、この構築体を導 入した野生型宿主において見い出されないことを意図している。異種構築体は、 その転写開始領域が由来している遺伝子にとって天然でない少なくとも一の領域 を含むであろう。 構築体を調製するうえで、この様々なDNAフラグメントは、DNA配列を発現にと って適正な配向、及び適宜適当なリーディングフレーム内に供するように操作し てよい；DNAフラグメントを連結するのにアダプターもしくはリンカーを採用し てよく、又は慣用の制限部位の設置、過剰DNAの除去、制限部位の除去等のため にその他の操作を関与させてよい。インビトロ突然変異誘発、プライマー修正、 制限、アニーリング、再配列、リゲーション、等を採用してよく 、この場合には挿入、欠失又は置換、例えばトランジション又はトランスバーシ ョンが関与しうる。好都合には、ベクター又はカセットは子房関連転写開始領域 より下流に多重クローニング部位を含んでよく、これによりこの構築体は効率的 に様々な配列の中に採用されうる。 様々な工程を実施するうえで、DNAの量を増幅させ、且つその操作が適切に行 われているかどうかを確認するためにDNAの分析を可能にする、クローニングが 採用される。適当な操作、例えば制限処理、チューイングバック又は突出し部を 補完してプラント末端を供する、リンカーのリゲーション等により、このフラグ メントの相補的末端が連結及びリゲーションのために供することができる。多種 多様なクローニングベクターが有用であり、この場合このクローニングベクター はＥ．コリ（E．coli）の中で機能的な複製系及び形質転換細胞の選択を可能に するマーカーを含む。例示のベクターにはpBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ 、pACYC184等が含まれる。即ち、この配列はベクターの中に適切な制限部位にお いて挿入することができ、得られるプラスミドはＥ．コリ宿主を形質転換するの に利用し、そのＥ．コリを適当な栄養培地の中で増殖させ、そして溶解し、そし てそのプラスミドを回収する。分析には配列分析、制限分析、電気泳動等が含ま れうる。各操作の後、最終構築体の中で使用すべきDNA配列を制限処理し、そし て次の配列に連結する。各部分構築体は同一又は異なるプラスミドの中にクロー ンできる。 植物細胞宿主への構築体の導入のために様々な技術が有用、且つ当業者に公知 である。これらの技術には、感染因子としてＡ．トゥメファシエンス又はＡ．リ ゾゲンス（A．rhizogenes）を採用するDNAによるトランスフェクション、プロト プラスト融合、注入、エレクトロポレーション、粒子加速化、等が含まれる。ア グロバクテリ アによる形質転換のため、Ti−プラスミド、特にT-DNAと相同性のDNAを含むプラ スミドをＥ．コリの中で調製できる。このプラスミドはアグロバクテリアの中で 複製可能でも不能でもよく、即ち、それは転写カセットをTi−プラスミドに組込 むか、又は独立プラスミド上に保持するかにある程度に依存して、例えばpRK290 の如くの広域原核複製系を有しても有していなくてもよい。アグロバクテリア宿 主はT-DNAの植物細胞への輸送にとって必要であるvir遺伝子を有するプラスミド を含み、そして完全T-DNAを有しても有していなくてもよい。Ti−又はRi−プラ スミドのT-DNAの少なくとも右側の境界、及び往々にして右側及び左側の両方の 境界は、転写構築体にフランキング領域として連結されている。植物細胞の形質 転換のためのT-DNAの利用はかなり研究されており、そしてEPA第120,516号、Hoe kema：The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.V.，Albl asserdam，1985、第Ｖ章、Knanfら、Genetic Analysis of Host Range Expressi on by Agrobacterium：Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interactio n，Puhler，A.編、Springer-Verlag，N.Y．1983，p245及びAn.らEMBO J.（1985 ）４：277-284に豊富に記載されている。 感染、粒子加速化及びエレクトロポレーションのため、特にT-DNA領域におい て見い出させる腫瘍遺伝子を欠く無害のTi−プラスミドを植物細胞の中に導入し てよい。ヘルパープラスミドにより、この構築体はＡ．トゥメファシエンスに導 入することができ、そして得られるトランスフェクト生物は植物細胞をトランス フェクトするのに使用される。植物細胞への転写カセットの導入を可能とするた め、外植体を形質転換Ａ．トゥメファシエンス又はＡ．リゾジェンスを伴って培 養してよい。他方、植物ゲノムへの組込みを高めるため、トランスポゾンの末端 反復をトランスポサーゼに関する境界と して用いてよい。この状況において、トランスポサーゼの発現は、転写構築体が ゲノムの中に組込まれたときに、それが比較的に安定的に組込れるべきであるよ うに、誘発性であるべきである。遺伝子導入植物細胞を次に遺伝子導入細胞の選 別のために適当な選択培地の中に入れ、それらをカルスとなるまで成長させ、菌 条を成長させ、そしてその菌条から発生した苗木を苗条用培地の中で成長させる 。 遺伝子導入細胞及び植物の中での導入遺伝子の存在を確認するため、当業者に 公知の方法を利用してサザンブロット分析を実施してよい。導入遺伝子の発現生 成物は生成物の種類に応じて任意の様々な方法で検出でき、そしてそれには免疫 アッセイ、酵素アッセイ又は目視検査（例えば適当な植物器官又は細胞の中での 色素の生成の検出）が含まれる。遺伝子導入植物が一但得られたら、それらを成 長させて所望の表現型を有する植物組織又は器官を生成する。この植物組織又は 植物器官を集穫する及び／又は種子を回収してよい。種子は所望の特性を有する 組織又は器官を有する更なる植物を成長させるための起源を担いうる。遺伝子導 入植物及び遺伝子導入細胞なる語は、遺伝子導入植物又は遺伝子導入細胞のいづ れかに由来する植物及び細胞を含む。 ここで提供する様々な配列は、例えば同一又は異なる植物起源由来の近縁の転 写開始領域を獲得するため、本発明において有用でありうるその他の配列の単離 のための分子プローブとして利用されうる。本発明において供される配列から獲 得できる近縁の５′非コード領域は少なくとも約60％の相同性を示し、そしてよ り好ましい領域はこのプローブと更に高い相同性のパーセンテージを示すであろ う。特に重要なのは、本明細書に記載の時期及び組織パラメーターを有する近縁 の転写開始コントロール領域を獲得する能力にある。 例えば、プローブpZ130を利用することにより少なくとも７つの更なるクローン が同定されたが、しかし更に特性化はしていない。即ち、本願に記載の技術及び 当業界公知のその他の技術（例えばManiatisら、Molecular Cloning；A Laborat ory Manual（Cold Spring Harbor，New York）1982）を採用することにより、本 発明において述べられている通りの転写及び／又は発現のコントロール誘発の可 能なその他の転写開始領域が決定されうる。この構築体は植物細胞及び植物を獲 得するために植物再生系と一緒に利用することもできる；この構築体は植物組織 及びそれにより生成される植物器官の表現型を改質するためにも利用できうる。 本発明は特定の組織、例えば果実又は種子における、他の組織、例えば葉、幹 又は根に比しての優先的又は少なくとも実質的に特異的な発現を供するように、 核酸フラグメントの転写又は発現をコントロールするのに特に有用である。「少 なくとも実質的に」とは、特定の組織又は器官の中での課題の核酸フラグメント の発現が、植物の他の組織又は器官の中でのこの核酸フラグメントの発現の約10 0倍高いことを意味する。「果実」とは、花の成熟した子房壁及び任意の密着部 分を意味する（Weirer，T.E.ら編、Botany：An Introduction to Plant Biology （第６版）（John Wiley & Sons，1982）；Tootill & Backmore、編、TheFacts on a file Dictionary of Botany（Market Home Books Ltd.，1984）を参照のこ と）。以下の実施例は例示のために提供し、限定するものではない。 実施例 実施例１ ACMV発現カセットの調製 ACMV（一般名CLV）の完全ヌクレオチド配列DNA1及びDNA2が公開 されている（Stanley and Gay，1983，Nature 301，260-262）。ACP調節性要素 のコントロールのもとにあるウィルストランス作用性因子AC２、ウィルスコート タンパク質調節性要素のコントロールのもとにある月桂樹由来のＣ12特異的チオ エステラーゼ及びCaMV 35Sプロモーターのコントロールのもとにあるカナマイシ ン耐性遺伝子を含む植物形質転換のためのバイナリーベクターを構築するため、 以下の構築体を作った。 コートタンパク質（AV１）調節性配列（ラベル化CP５′及びCP３′）を、鋳型 として以下のオリゴヌクレオチド及びpETA092を用いるPCRにより獲得した。pETA 092（J.Stanley，John Innes Inst.，Norwich，UKより獲得）はクローニングベ クターpIB120（International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT）のMlu Ｉ部位におけるACMV DNA1の完全クローンである。コートタンパク質５′は＃355 8、５′−CTGGAGCTCATGTTGACCAAGTCAATTGG−３′及び＃3560、５′−GCTACTAGTG GATCCCACATTGCGC−３′とし、そしてそれらは共通領域及びコートタンパク質転 写開始部位を含むヌクレオチド2752と299との間のACMV DNA1配列を増幅するため にデザインしてある。オリゴヌクレオチド＃3558はPCRフラグメントの５′末端 にSacＩ制限部位を含んでおり、そしてオリゴ＃3560はサブクローニングのため にフラグメントの３′末端にSpeＩ部位を含んでいる。３′オリゴヌクレオチド は＃3564、５′-CCACTGCAGCGACGTTGAAAATACG−３′及び＃3559、５′−CACACTAG TCAATGTAATTAGAGCTGC−３′とした。これらはACMV DNA1を、そのフラグメントの ５′及び３′末端上にそれぞれPstＩ及びSpeＩを有するヌクレオチド1175〜1315 から増幅するようにデザインされている。このフラグメントはコートタンパク質 遺伝子のための潜在的ポリアデニル化シグナルを含む。PCR条件は：94℃で10min 、72℃で７min,，Taqポリメラーゼの添加 、次いで30サイクルにわたる94℃で15sec、50℃で30sec及び72℃で30secとした 。 PstＩ及びSpeＩによるPCR DNAの切断及びこれもPstＩ及びSpeＩにより切っ てある改質クロラムフェニコール耐性pCGN565（pCGN3288）へのリゲーションに より、pCGN3289を作るためにコートタンパク質３′配列をPCR反応（上記）から サブクローンした。pCGN3288をHindIII及びPstＩによるpCGN565の消化（他の特 許明細書に記載）並びにHindIII，SpeＩ及びPstＩ部位を含む合成リンカーのリ ゲーションにより構築した。このリンカーは合成オリゴヌクレオチド５′−AGCT TCCACTAGTGGCTGCA-３′及び５′−GCCACTAGTCCA−３′をアニールすることによ り作った。月桂樹チオエステラーゼコード配列をBamHＩ完全及びPstＩ部分消化 によりpCGN3826（CGN82-4WO特許明細書に記載）から単離した。単離した1.27kb のチオエステラーゼ配列を次にコートタンパク質３の上流に、BamHＩ及びPstＩ で消化したpCGN3289を有する単離化チオエステラーゼフラグメントのリゲーショ ンにより、クローンした。チオエステラーゼ配列及びCP３′を含むプラスミドを pCGN3291と命名する。 コートタンパク質の５′配列を、SacＩ及びSpeＩによる消化並びにSacＩ及びS peＩにより切ってあるpCGN3290という名の改質Bluescript II KS（−）ベクター （Stratagene，La Jolla，CA）へのリゲーションによりPCR DNAからサブクロー ンした。pCGN3290はBamHＩ及びSpeＩによるpBluescriptII KS（-）の消化並びに BamHＩ及びSpeＩで切っておいたpCGN3291とのリゲーションにより作った。得ら れるプラスミドはCP５′、チオエステラーゼ遺伝子及びアンピシリン耐性骨格中 のCP３′より成る発現カセットを含む。 AC２オープンリーディングフレームは以下の配列を有するプライマーを用いる PCRにより獲得した：AC２オープンリーディングフレ ームのATG開始コドンを囲むヌクレオチド1774〜1754及び停止コドンを囲むヌク レオチド1386〜1364に相当する、５′−TGCTGAATTCAGAATGCAATCTTCATCACCC−３ ′及び５′−TGCTCTGCAGCTAAAGACCCTTAAGAAAAGACC−３′。これらのプライマー は更なるクローニング段階のためにそれぞれの末端上にEcoRＩ及びPstＩ部位を 有する。PCRのための鋳型は30サイクルとし、次いで72℃で10minとした。得られ るPCRフラグメント（410bp）をpBluescriptII SK（−）の中に、EcoRＩ及びPst Ｉによる消化によってサブクローンした。AC２オープンリーディングフレームを 、EcoRＩ及びPstＩによる消化並びにEcoRＩ及びPstＩにより切っておいたpCGN19 77へのリゲーションによりACP発現カセットpCGN1977（Schererら1992，Plant Mo lecular Biology 18，591-594）の中に挿入した。 CP５′／TE／CP３′カセットをACP５′／AC２／ACP３′カセットと、SacＩ及 びSpeＩ並びにAsp718及びSacＩによる対応の消化、並びにそのプラスミドのAsp7 18及びXbaＩ切断バイナリーベクター、例えばpC2GN1557（McBride and Summerfe lt，1990，Plant Molecular Biology 14，269-276）とのリゲーションにより、 組合せた。得られるバイナリーベクターは：ゲンタマイシン耐性骨格中の、左側 境界−35ｓ／NPT11／tm１−ACP５′／AC２／ACP3-CP５′／TE/CP３′右側境界発 現カセット、を含む。バイナリーベクターをアグロバクテリア トゥメファシエ ンスに形質転換して、アブラナ植物を生産するのに利用できる。 上記の発明は、植物細胞において発育調節を担う遺伝子由来の５′コード領域 を、トランス作用性調節タンパク質をエンコードするジェミニウィルス遺伝子の 天然プロモーターの代わりに使用することによる、核酸フラグメントのコントロ ール発現を供するためのジェミニウィルスベクターの利用に関する。これにより 、ジェミニウ ィルスのコートタンパク質プロモーターからの所望の生成物の示差的な細胞生産 を可能にする転写カセット及び発現カセットを製造することができる。即ち、特 定の植物器官の表現型を、調節化生成物が全ての組織の中で生産される（これは 、植物の成長、健康及び生産能力に様々な有害な影響をもたらしうる）必要なく 、改質することができる。特に、様々な組織の表現型特性を改質するための組織 特異的転写開始能力を提供する。 本明細書の中で言及した公開物及び特許明細書に全て引用することで本明細書 に組入れる。 本発明は請求の範囲を逸脱することなく様々な変更及び改良が施されうること を当業者は理解するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ノーフ，ビク シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95694, ウィンターズ，ヒルビュー レーン 1015 (72)発明者 ブルーニング，ジョージ アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, ディビス，ブラウン ドライブ 1439

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ジェミニウィルスゲノムを含んで成るジェミニウィルストランスファーベ クターであって、ここで前記ゲノム中のコートタンパク質についてのコード配列 は欠失しており、そして制限部位に置き換えられており、そして前記ゲノム中の ジェミニウィルストランス作用性因子遺伝子は正常に機能できないものである、 前記ベクター。 ２．前記ジェミニウィルスが機能的なトランス作用性因子タンパク質を生産で きないように前記ジェミニウィルストランス作用性因子をエンコードするDNA配 列が改質されている、請求項１記載のベクター。 ３．前記トランス作用性因子の転写開始領域をエンコードするDNA配列が、１ 又は複数種の植物細胞の中で構成的でなく発現される遺伝子の転写開始領域によ り置き換えられている、請求項１記載のベクター。 ４．課題のDNA配列が前記制限部位の中に挿入されている、請求項１記載のベ クター。 ５．前記課題のDNA配列の発現生成物が植物の表現型を改質できるものである 、請求項４記載のベクター。 ６．前記課題のDNA配列の転写生成物が植物の表現型を改質できるものである 、請求項４記載のベクター。 ７．前記ジェミニウィルスゲノムが少なくとも1.2回反復している、請求項１ 記載のベクター。 ８．右側T-DNA境界を更に含んで成る、請求項７記載のベクター。 ９．前記ジェミニウィルスがアフリカン・カッサバ・モザイク・ ウィルスである、請求項１記載のベクター。 10．請求項１記載のジェミニウィルストランスファーベクターを含んで成る植 物細胞。 11．トランス作用性発現カセットであって、作動連結成分として、５′から３ ′の転写方向において： １又は複数種の植物細胞の中で構成的でなく発現される植物遺伝子の５′非コ ード領域より獲得できる転写開始領域； ジェミニウィルスコートタンパク質作用性因子をエンコードするDNAフラグメ ント；及び 転写終止領域； を含んで成る、前記トランス作用性発現カセット。 12．前記構成的でなく発現される植物遺伝子が、 ACP，Bce4、ナピン、ポリガラクツロナーゼ、2A11，pZ7，hsp80，EF-1，ssu 及びEA9より成る群から選ばれるポリペプチドについてコードする遺伝子である 、請求項11記載のトランス作用性発現カセット。 13．前記ジェミニウィルスがアフリカン・カッサバ・モザイク・ウィルスであ る、請求項11記載のトランス作用性発現カセット。 14．請求項11記載のトランス作用性発現カセットを含んで成る植物細胞。 15．トランス作用化性カセットであって、作動連結成分として、５′から３′ の転写方向において： ジェミニウィルスコートタンパク質遺伝子より獲得できる転写開始領域； 前記コートタンパク質遺伝子の全長コード配列ではなく、且つ植物の表現型を 改質することのできる課題のDNA配列；及び 転写終止領域； を含んで成る、トランス作用化性カセット。 16．前記ジェミニウィルスがアフリカン・カッサバ・モザイク・ウィルスであ る、請求項15記載のトランス作用化性カセット。 17．前記課題のDNA配列がポリペプチドをエンコードする、請求項15記載のト ランス作用化性カセット。 18．前記ポリペプチドが： アシル−ACPチオエステラーゼ；アシル−ACPデサチュラーゼ；ACCD；ポリガラ クツロナーゼ；及びブロモキシニル；より成る群から選ばれる、請求項17記載の トランス作用化性カセット。 19．前記課題のDNA配列が内因性植物酵素である、請求項15記載のトランス作 用化性カセット。 20．前記内因性植物酵素が： アシル−ACPチオエステラーゼ；アシル−ACPデサチュラーゼ；及びポリガラク ツロナーゼ；より成る群から選ばれる、請求項19記載のトランス作用化性カセッ ト。 21．請求項15記載のトランス作用化性カセットを含んで成る植物細胞。 22．バイナリープラスミドであって： （１）ジェミニウィルスコートタンパク質遺伝子より獲得できる転写開始領域 ；前記コートタンパク質遺伝子の全長コード配列ではなく、且つ植物表現型を改 質することのできる課題のDNA配列；及び転写終止領域；より本質的に成るトラ ンス作用化性カセット；並びに （２）１又は複数種の植物細胞において構成的でなく発現される植物遺伝子の ５′非コード領域より獲得できる転写開始領域；コートタンパク質トランス作用 性因子をエンコードするDNAフラグメント；及び転写終止領域；より本質的に成 るトランス作用性発現カセ ット； を含んで成るバイナリープラスミド。 23．右側T-DNA境界を更に含んで成る、請求項22記載のバイナリーベクター。 24．植物選択マーカーを更に含んで成る、請求項22記載のバイナリーベクター 。 25．請求項22記載のバイナリーベクターを含んで成る植物細胞。 26．バイナリーベクターであって： （１）ジェミニウィルスゲノム、ここでこのゲノムの中のコートタンパク質遺 伝子におけるコード配列は欠失して制限部位により置き換えられており、そして ジェミニウィルストランス作用性因子をエンコードするDNA配列は、前記ジェミ ニウィルスが機能的なトランス作用性因子タンパク質を生産できないように改質 されている； （２）１又は複数種の植物細胞において構成的でなく発現される植物遺伝子の ５′非コード領域より獲得できる転写開始領域；ジェミニウィルスコートタンパ ク質トランス作用性因子をエンコードするDNAフラグメント；及び転写終止領域 ；より本質的に成るトランス作用性発現カセット；並びに （３）右側T-DNA境界領域； を含んで成るベクター。 27．ジェミニウィルストランスファーベクターを製造するための方法であって 、 ジェミニウィルスゲノムにおいて、コートタンパク質遺伝子のコード配列を、 植物の表現型を改質することのできる課題のDNA配列に置き換え；そして 前記ジェミニウィルスのコートタンパク質トランス作用性因子の正常な機能を 不活性化する； ことを含んで成る方法。 28．前記ジェミニウィルスが機能的なコートタンパク質トランス作用性因子を 生産できないものである、請求項27記載の方法。 29．前記コートタンパク質作用性因子の転写開始領域を、１又は複数種の植物 細胞において構成的でなく発現される遺伝子の転写開始領域に置き換える、請求 項27記載の方法。