DE3788352T2

DE3788352T2 - Verfahren zur herstellung eines heterologen proteins in insektenzellen.

Info

Publication number: DE3788352T2
Application number: DE87906361T
Authority: DE
Inventors: David Miller
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1986-09-09
Filing date: 1987-09-09
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2007-09-10
Also published as: JPH02500402A; DE3788352D1; EP0323974B1; AU601232B2; EP0323974A1; ES2008204A6; EP0323974A4; AU8032387A; CA1330426C; WO1988002030A1; ZA876696B

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung heterologer Proteine in Insektenzellen, insbesondere in Insekten-Wirten selbst.
Jüngste Fortschritte in der Genmanipulation von Baculoviren ermöglichten die Herstellung heterologer Proteine in Insekten-Wirtszellen, die in in vitro Kultur gezüchtet wurden. Eine Vorgehensweise, die ein gewisses Maß an Erfolg zeitigte, beinhaltet (I) Herstellung eines rekombinanten Baculovirus, das eine DNA-Sequenz enthält, die das heterologe Protein codiert, die funktionell mit dem Baculovirus Polyhedrin-Promotor verbunden ist; (2) Infizieren kultivierter Insekten-Wirtszellen mit dem rekombinantem Virus; (3) Züchten der infizierten Insektenzellen unter zur viralen Replikation und Expression des Proteins geeigneten Bedingungen und (4) Rückgewinnen des dabei exprimierten, erwünschten, heterologen Proteins aus den Insektenzellen oder dem Kulturmedium; siehe beispielsweise EP-A1 0 155 476 und Miller et al. 1986, nachstehend. Mit der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise kann das erwünschte Protein relativ hoch exprimiert werden, teilweise deshalb, weil der Polyhedrin-Promotor ein äußerst starker Promotor ist.
Bei der Betrachtung der bei dieser Vorgehensweise involvierten biologischen Vorgänge sollte berücksichtigt werden, daß Baculoviren im allgemeinen in zwei Formen verpackt werden: die Nucleocapside können in dem Kern infizierter Zellen in Teilchen eingeschlossen vorliegen, die als "Polyhedrale Einschlußkörper" (PIBs) bekannt sind, wobei das darin hauptsächlich vorkommende Strukturprotein das Polyhedrin ist, oder sie können sich von der Membran der infizierten Zellen ablösen, um dabei einen Membranmantel zu erhalten und nichteingeschlossene Viruspartikel (NOV) ausbilden. Als ein Ergebnis der üblichen Deletion des Gesamten oder eines Teils des Polyhedrin-Strukturgens oder einer Insertion des heterologen Gens in den Polyhedrin-Genlocus, die bei der Verwendung des Virus als Expressionsvektor auftreten, kann das in der vorstehend erwähnten Vorgehensweise verwendete Baculovirus nicht länger dazu verwendet werden, die Synthese eines funktionellen Polyhedrins in infizierten Zellen zu steuern. Die horizontale Weitergabe der viralen Infektion auf der Stufe des Organismus, d. h. von Insekt zu Insekt, kommt in der Abwesenheit der PIB-Form des Virus, die ohne sein Haupt-Strukturprotein Polyhedrin nicht hergestellt werden kann, im allgemeinen nicht vor. Infolgedessen ermöglicht die Infektion mit dem rekombinanten Virus die Herstellung von nicht-eingeschlossenen viralen Nachkommen (NOVs), die die Infektion innerhalb eines infizierten Insekts oder einer Zellkultur von Zelle zu Zelle, nicht jedoch von Insekt zu Insekt, weitergeben können.
Da das vorstehend beschriebene rekombinante Baculovirus zur Herstellung eines heterologen Proteins in kultivierten Insektenzellen oder in einem geeigneten, infizierten, einzelnen Insekten-Wirt verwendet werden kann, würde die Synthese des Proteins in wirtschaftlich bedeutenden Mengen in Insekten selbst und/oder die horizontale Weitergabe des rekombinanten Baculovirus die Infizierung einer großen Anzahl einzelner Insekten erfordern. Derartige außergewöhnliche Anforderungen an die Arbeitskraft, die Zeit und die finanziellen Mittel machen derartige Verfahren unausführbar.
Es wurde nun ein neues gemischtes virales System gefunden, das zum ersten Mal die tatsächliche Herstellung eines heterologen Proteins in biologisch und/oder wirtschaftlich bedeutenden Mengen in Insekten erlaubt, sowie die horizontale Weitergabe rekombinanter Baculoviren unter Verwendung eines rekombinanten Baculovirus ermöglicht, das Polyhedrin selbst nicht mehr herstellen kann. Diese Erfindung liefert unerwartete Vorteile bezüglich der kontrollierbaren Persistenz des viralen Systems, was ein Gleichgewicht zwischen der Wirksamkeit und biologischen Sicherheitsbedenken erlaubt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen polyhedralen Einschlußkörper (PIB) zur Verfügung, der ein Gemisch von Nucleocapsiden von zwei genetisch unterschiedlichen Baculoviren enthält. Diese gemischte PIB-Zusammensetzung (mPIB) enthält Nucleocapside eines "rekombinanten" Baculovirus, das in infizierten Insektenzellen Polyhedrin nicht herstellen kann (phänotypisch "PIB&supmin;") und Nucleocapside eines anderen Baculovirus, das ein Wildtyp, ein mutiertes oder ein genetisch verändertes Virus sein kann, in jedem Falle jedoch in der Lage ist in infizierten Zellen Polyhedrin herzustellen (phänotypisch "PIB&spplus;") . Ein "rekombinantes" Baculovirus, wie dieser Ausdruck hier verwendet wird, bezeichnet ein Baculovirus, dem das funktionelle Polyhedringen fehlt und das wenigstens ein heterologes ("insertiertes") Gen aufweist (phänotypisch "PIB&supmin;", Insert&spplus;) . Ein "heterologes Gen", wie dieser Ausdruck hier verwendet wird, bezeichnet ein Gen, das in dem Baculovirus normalerweise nicht vorhanden ist oder, wenn es normalerweise vorhanden ist, bezüglich des rekombinanten Baculovirus an einem anderen Locus in dem Genom des Wildtyp-Baculovirus oder unter der transkriptionellen Kontrolle eines anderen Promoters oder beides vorzufinden ist. Ein "funktionelles Polyhedrin Gen", wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezeichnet ein Gen, das ein Polyhedrinprotein codiert, das ein PIB ausbilden kann. Die Biologie und der Lebenszyklus zahlreicher nuklearer polyhedraler Viren und entsprechender Insekten und Wirtszellen sind im Stand der Technik bekannt. Weiterhin sind zur Herstellung rekombinanter Baculoviren eine Vielfalt von Übertragungsvektoren und Verfahren zu deren Verwendung im Stand der Technik bekannt; siehe beispielsweise EP-A1 0 155 476, Pennock et al. und Miller et al., nachstehend.
Das Aufnehmen der erfindungsgemäßen mPIBs, die Nucleocapside eines PIB&supmin;, Insert&spplus;-Baculovirus und eines PIB&spplus;- Baculovirus enthalten, durch Insekten-Wirte, führt in dem Insekt zu einer gemischten viralen Infektion, so daß in den infizierten Zellen beide Baculoviren replizieren. Während des Verlaufs der Replikation (a) steuern das recombinante (PIB&supmin;, Insert&spplus;) Baculovirus und dessen Nachkommen die Expression des heterologen Gens (des "Inserts"), wobei das dadurch codierte Protein hergestellt wird; und (b) stellt das PIB&spplus;-Baculovirus Polyhedrin her. Dies führt sehr häufig dazu, daß die Nachkommen-Nucleocapside in PIBs eingeschlossen werden und so zusätzliche Kopien der mPIB herstellen. Das so hergestellte heterologe Protein kann anschließend aus dem Insekt wiedergewonnen und, wenn erwünscht, weiter gereinigt werden. Jedes heterologe Protein, für das eine korrespondierende Nukleotidsequenz erhalten werden kann, kann auf diese Weise in Insekten hergestellt werden. Zu diesen Proteinen gehören therapeutische Proteine zur medizinischen oder tiermedizinischen Anwendung, Impfstoffe, funktionelle Enzyme und Proteine, die für wenigstens einige Insektenarten toxisch sind. Im letzteren Fall können die das mPIB enthaltenden Zusammensetzungen als biologische Insektizide gegen das Insekt eingesetzt werden oder gegen Insekten, die für das Virus geeignete Wirte darstellen und für die das heterologe Protein toxisch ist.
Insbesondere stellt die Erfindung, wie nachfolgend erläutert, ein mPIB zur Verfügung, das ein Gemisch von Nucleocapsiden zwei genetisch unterschiedlicher Baculoviren enthält. Das erste Baculovirus enthält ein Polyhedrin codierendes Gen, das mit einer Sequenz zur Kontrolle der Expression funktionell verbunden ist, was dem Baculovirus die Steuerung der Polyhedrinsynthese in der infizierten Zelle ermöglicht. Das erste Baculovirus kann somit phänotypisch als PIB&spplus; gekennzeichnet werden. Das PIB&spplus;-Baculovirus kann ein Wildtyp-Stamm eines nuklearen polyhedralen Virus (NPV) sein, beispielsweise AcNPV, BmNPV, RoNPV, OpNPV, DwNPV, TnNPV, SINPV, SfNPV, LdNPV, HzNPV, HvNPV und dergleichen oder eine Deletions- oder Insertionsvariante davon, so lange es in der Lage ist (i) zu replizieren (es enthält beispielsweise die zur Replikation benötigten genetischen "cis"-Funktionen), (ii) in das mPIB verpackt zu werden und (iii) in infizierten Insektenzellen die Synthese eines funktionellen Polyhedrins zu steuern. Dem zweiten Baculovirus fehlt ein funktionelles Polyhedringen, beispielsweise aufgrund einer Änderung wie einer Deletion, einer Substitution oder einer Insertion in dem Polyhedringen- Locus, gleichgültig ob in dessen codierenden und/oder regulatorischen Region. Das zweite Baculovirus enthält jedoch das zuvor erwähnte heterologe Gen, das mit einer Kontrollsequenz zur Expression funktionell verbunden ist und so dem Baculovirus in infizierten Zellen die Steuerung der Synthese des durch das heterologe Gen codierten heterologen Proteins ermöglicht. Das zweite Baculovirus ist als PIB&supmin;, Insert&spplus; gekennzeichnet. Es wird im allgemeinen bevorzugt, daß der Wirt oder das Zielinsekt jedes Virus innerhalb des mPIB vollständig oder wenigstens teilweise akzeptiert.
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform wird das heterologe Gen in die Region des Polyhedringens des zweiten Baculovirus dergestalt inseriert, daß sich das heterologe Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des Polyhedringen- Promotors befindet. In einer anderen Ausführungsform kann das heterologe Gen in das Genom des Baculovirus innerhalb des Polyhedringen-Bereichs inseriert und mit einem anderen Promotor als dem Polyhedrinpromotor verknüpft werden, beispielsweise mit dem RSV-LTR-, TED-LTR- oder mit einem anderen Baculoviruspromotor als dem Polyhedrinpromotor, so lange der Promotor in infizierten Insektenzellen funktionell ist. In ähnlicher Weise kann das heterologe Gen an einer anderen Stelle als dem Polyhedrin-Genlocus insertiert werden, so lange das so erhaltene rekombinante Baculovirus in der Lage ist zu replizieren, das heterologe Gen zu exprimieren und in mPIBs verpackt zu werden, jedoch nicht alleine die PIBs ausbilden kann.
Erfindungsgemäße mPIBs wurden durch gleichzeitiges in Kontakt bringen der NOVs von jedem der Baculoviren, die in mPIBs verpackt werden sollen, mit in vitro wachsenden Insekten- Wirtszellen hergestellt (d. h. ein PIB&spplus;-Virus und ein PIB&supmin;, Insert&spplus;-Virus). In einer anderen Ausführungsform kann das in Kontakt bringen durch Injizieren der einzubringenden Viren in die Insekten selbst bewirkt werden. Das in Kontakt bringen sollte unter Bedingungen ablaufen, welche eine baculovirale Infektion des Wirts oder der Wirtszellen erlauben. Die zur Coinfektion verwendeten Viren werden nachstehend im allgemeinen als die "einzubringenden"-Viren bezeichnet. Die Insekten- Wirtszellen werden unter Verwendung herkömmlicher, im Stand der Technik bekannter Methoden gezüchtet, beispielsweise in Suspensionskultur in Schüttelbehältern oder Fermentationsgefäßen oder angeheftet an die Oberfläche des Behälters in Gewebekulturflaschen oder -Schalen. Die verschiedenen Verfahren, die zur Züchtung der Insekten oder Insektenzellen, zur Infizierung mit Baculoviren, zur viralen Replikation, zum Durchsuchen und Ernten der viralen Nachkommenschaft verwendet werden, sind im Stand der Technik bekannt, beispielsweise im wesentlichen wie beschrieben in Miller et al., Genetic Engineering Vol. 8, 277-298, Herausgeber J.K. Setlow und A. Hollaender (Plenum Press, 1986). Die Gesamtmenge des zugesetzten Virus sowie das Verhältnis des in der anfänglichen Infektion verwendeten PIB&spplus;-(beispielsweise Wildtyp) zu PIB&supmin;, Insert&spplus;-(verändertes) Virus kann sich abhängig von der erwünschten Zusammensetzung der gebildeten mPIBs ändern. Üblicherweise bewegt sich das Verhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 10 : 1, verändertes Virus : Wildtyp, obwohl für bestimmte Anwendungen andere Verhältnisse verwendet werden können.
Zahlreiche Baculovirenstämme und Mutanten sowie entsprechende akzeptierende Insektenwirte wurden gefunden. Eine Vielzahl derartiger Stämme ist frei verfügbar, beispielsweise die L-1 Mutante von Autographa californica NPV und der Bm-5 Stamm von Bombyx mori NPV, und können als der PIB&spplus;-Virus in den erfindungsgemäßen mPIBs verwendet werden. Das Insert&spplus;, PIB&supmin;- Baculovirus kann unter Verwendung irgendeines der im Stand der Technik bekannten verschiedenen Übertragungsvektoren und Verfahren erhalten werden, siehe beispielsweise die veröffentlichte Europäische Anmeldung Nr. 0 155 416; G. D. Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 4 (3) (1984), 399-406; S. Maeda et al., Nature 315 (1985), 592-594. Ein derartiger Übertragungsvektor, pIVEV, der zur Insertion einer PassagiercDNA in den Polyhedrin-Locus des Genoms des Baculovirus Autographa californica nützlich ist, wurde bei der "American Type Culture Collection" hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 39991 erhältlich.
In einem beispielhaften Experiment wurden in einem Schüttelbehälter in Suspensionskultur wachsende Spodoptera frugiperda (Sf)-Zellen mit dem Wildtyp- und einem rekombinanten, einzubringenden-Baculovirus angeimpft. Die L-1 Variante des nuklearen polyhedralen Virus A. californica stellte den Wildtyp-Virus dar. Das rekombinante Virus war eine genotypisch veränderte Variante von AcNPV-L-1, die anstelle eines funktionellen Polyhedringens eine cDNA enthält, die den menschlichen Gewebe-spezifischen Plasminogenaktivator (t-PA) codiert. Das rekombinante Baculovirus wurde als 3h8 bezeichnet und bei der "American Type Culture Collection" (ATCC) unter der ATCC Nr. VR2096 hinterlegt. Dieses Virus kann phänotypisch als PIB&supmin;, t-PA&spplus; bezeichnet werden. Die Coinfektion der Sf-Zellen wurde bei Verhältnissen von Wildtyp : Rekombinante von 1 : 1 und 1 : 10 durchgeführt, d. h. bei einer Multiplizität der Infektion von 1 oder 10 für das jeweilige Virus, je nach dem Verhältnis der beiden Typen.
Diese Infektion führte zur Herstellung von NOVs jedes Typs des einzubringenden Virus. Ebenso führte sie zur Herstellung von mPIBs, die Nuclocapside von beiden einzubringenden Viren enthielten. Diese Ergebnisse wurden wie folgt nachgewiesen. Um den Typ des vorhandenen NOV zu analysieren, wurde der Zellüberstand, der die Nachkommen-NOVs enthielt, auf eine einzellige Schicht von Sf-Zellen ausgesät und der Phänotyp der so erhaltenen Plaques aufgezeichnet. Die Plaques, die PIBs enthielten, wurden durch das Wildtyp Virus erzeugt und jene, die keine PIBs enthielten durch das rekombinante Virus, das t- PA enthielt. Um die Zusammensetzung der mPIBs zu untersuchen, wurden die mPIBs zuerst aus anderem, in der Zellkultur vorkommenden Material isoliert. Dies wurde durch Zentrifugation des Inhalts der Schüttelflaschen bewirkt, um das große Material, wie die PIBs, von dem kleineren Material, wie den NOVs, abzutrennen. Der Niederschlag, der die PIBs enthielt, wurde anschließend mehrmals mit einer SDS-enthaltenden Lösung gewaschen, um Zellbruchstücke aufzulösen und zu entfernen, die den PIB-Niederschlag verunreinigen. Die PIBs widerstehen dieser Behandlung und werden im wesentlichen frei von Zellbruchstücken isoliert. Die PIBs sind zur Herstellung viraler DNA geeignet, wie im folgenden gezeigt wird. Der PIB-Niederschlag wird in Natriumcarbonat wiederaufgenommen. Durch diese Behandlung werden die PIBs aufgelöst, wobei die eingeschlossenen viralen Nucleocapside in die Lösung freigesetzt werden. Die Nucleocapside werden wiedergewonnen und mittels Ultrazentrifugation konzentriert. Der aus Capsiden bestehende Niederschlag wurde in einer Lösung aus SDS, Tris und EDTA wiederaufgenommen und Proteinase K zugegeben. Die Lösung wurde bei 37ºC inkubiert. Durch diese Behandlung wurde die virale DNA von den Capsiden befreit. Die DNA wurde durch eine übliche Phenolextraktion und Ethanolausfällung weiter gereinigt.
Eine genotypische Analyse der gereinigten DNA wurde durchgeführt, indem die gereinigte DNA zuerst einer herkömmlichen Spaltung mit einer Restriktionsendonuclease (REN) unterworfen wurde. Die mit der REN gespaltene DNA wurde auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und die getrennte DNA gemäß dem Verfahren von Southern (Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) auf einen Membranfilter überführt. Es ist gegenwärtig am zweckmäßigsten, das Gel bidirektionell zu blotten. Auf diese Weise können die zwei Filter-Kopien des Gels mit der einen oder der anderen Sequenz untersucht werden, die für das jeweilige virale Genom kennzeichnend ist. Dieses Verfahren offenbart den Genotyp der in den mPIBs enthaltenen Virenpartikel, d. h. die Gegenwart oder das Fehlen eines Polyhedringens und des exogenen DNA-Inserts.
Infolgedessen können mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren baculovirale PIBs hergestellt werden, die nach Aufnahme durch einen geeigneten Insekten-Wirt in dem Wirt eine gemischte virale Infektion hervorrufen können, was zur Synthese von Nachkommen-NOVs, Nachkommen-mPIBs und einem heterologen Protein in dem infizierten Insekt führt. Baculovirale mPIBs werden vorzugsweise mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren entworfen und hergestellt, so daß der erwünschte Insekten-Wirt mit den bestimmten verwendeten Baculoviren infiziert werden kann und deren virale Replikation unterstützt.
Wie zuvor erwähnt sind im Stand der Technik eine Vielzahl von Baculoviren und entsprechende permissive Insekten-Wirte bekannt.
Während mPIBs zur Herstellung von therapeutischen Proteinen, Immunogenen für Impfstoffe, Enzymen und anderen nützlichen Proteinen im großen Maßstab in Insekten verwendet werden können, ist diese Erfindung insbesondere gut zur biologischen Kontrolle von Insektenplagen geeignet. Wie in anderen Ausführungsformen enthält das bioinsektizide mPIB PIB&spplus; und PIB&supmin;, Insert&spplus;-Baculoviren, die das Zielinsekt (den Wirt) infizieren können. Wie kürzlich erwähnt, enthält das PIB&supmin;, Insert&spplus;-Baculovirus von bioinsektiziden mPIBs DNA (das Insert), die ein für das Zielinsekt toxisches Protein codiert. Das Toxin kann für das Zielinsekt letal, lähmend oder auf andere Art und Weise schädlich sein. Derartige Toxine können aus Pflanzen oder natürlichen Parasiten oder aus Feinden des Zielinsekts oder verwandter Insekten isoliert und gereinigt werden. Zu den natürlichen Parasiten oder Feinden von Insekten gehören Bakterien, Viren, Pilze und andere Insekten. Potentielle Toxine können in den Zielinsekten auf ihre Toxizität hin untersucht und anschließend mittels herkömmlicher Verfahren cloniert werden. Beispiele für Toxine sind die toxischen Proteine aus vielen Bacillus thuringiensis Stämmen. Aus Hymenoptera, Skorpionen und Spinnen isolierte Toxine sind ebenfalls geeignet. Darüber hinaus kann das Toxin ein Enzym sein, von dem bekannt ist, daß es die Anfälligkeit für Infektionen verstärkt oder das für das Zielinsekt selbst schädlich ist, beispielsweise Chitinase. In derartigen Fällen kann das mPIB eine Transkriptionseinheit für solch ein Toxin enthalten, entweder allein oder zusammen mit einer Transkriptionseinheit für ein zweites Toxin.
Diese Erfindung umfaßt weiterhin, wie vorstehend beschrieben, bioinsektizide mPIBs-enthaltende Zusammensetzungen als Zusatz zu landwirtschaftlich verträglichen Exzipientien einschließlich Vehikeln, Trägern, Bindemitteln, UV-Blockern, Klebmitteln, Benetzungsmitteln, Lockstoffen für Insekten und dergleichen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Derartige Zusammensetzungen können trocken oder in Form einer Suspension, einer Emulsion oder als Schaum auf typische Nahrungsbereiche der Zielinsekten aufgebracht werden, einschließlich der Vegetation, von Pflanzen, Früchten, Samen, dem Boden oder von Wassergebieten. Diese Zusammensetzungen können ebenfalls herkömmliche insektizide Mittel enthalten und/oder in Verbindung mit herkömmlichen insektiziden Mitteln angewendet werden.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen mPIBs ist ihre begrenzte wirksame Persistenz bei fortgesetzter Weitergabe durch Insekten-Wirte. Im besonderen wurde im Verlauf der Forschung, die zu dieser Erfindung führte, beobachtet, daß sich die Zusammensetzung der mPIBs von Generation zu Generation bei fortgesetzter Weitergabe innerhalb der Insekten ändert, wobei das Verhältnis von PIB&spplus; zu PIB&supmin;, Insert&spplus; in der nachfolgenden Nachkommenschaft beständig ansteigt. Wenn also das PIB&spplus;- Baculovirus ein Wildtyp ist, enthalten die nachfolgenden Generationen von mPIBs immer weniger rekombinantes (PIB&supmin;, Insert&spplus;) Virus, bis die Umwandlung zum Wildtyp allein schließlich vollständig ist. Die Anzahl der Generationen bis zum Verlust des PIB&supmin;, Insert&spplus;-Genotyps kann in einfacher Weise abgewandelt werden, indem das Verhältnis der einzubringenden NOVs, die zur Coinfektion der kultivierten Zellen bei der Herstellung der mPIBs verwendet wurden und/oder die Zahl der an die Insekten verfütterten mPIBs eingestellt wird. Je größer das Verhältnis der einzubringenden PIB&supmin;/Insert&spplus;-NOVs zu den einzubringenden PIB&spplus;-NOVs ist und/oder je höher die Zahl der an die Insekten verfütterten mPIBs ist, desto länger kann eine wirksame Dauer (bezüglich nachfolgender Generationen) des PIB&supmin;, Insert&spplus;-Genotyps der mPIBs sein. Der allmähliche Verlust des rekombinanten Phänotyps ist vorteilhaft, da er jegliches mögliche Risiko aus einer zufälligen oder vorsätzlichen Freisetzung der mPIBs in die Umgebung begrenzt. Es wurde weder erwartet, daß die Persistenz so lange wie beobachtet dauern würde, für ein wirksames Bioinsektizid tatsächlich lang genug, noch daß die Dauer der Persistenz einfach zu kontrollieren sein würde, was eine Abwägung zwischen Wirksamkeit und biologischer Sicherheit erlaubt.
Ein anderer Vorteil dieser Erfindung stellt die Möglichkeit zur Änderung oder Umgehung der Wirtsspezifität eines bestimmten Baculovirus dar. Beispielsweise kann ein rekombinantes Virus, das so manipuliert wurde, daß es ein heterologes Gen enthält, aufgrund natürlich vorkommender Wirtsbereich-Begrenzungen nicht in der Lage sein, in einem bestimmten Wirt zu replizieren oder vollständig zu replizieren. Als Folge könnte das heterologe Gen nicht bis zu einer höheren Kopienzahl repliziert werden oder die virale Nachkommenschaft könnte nicht ordnungsgemäß in PIBs eingeschlossen werden. Derartige Wirts-Beschränkungen beruhen in vielen Fällen auf der fehlenden Befähigung des nicht oder nur teilweise susceptiblen Wirts einen vollständigen Replikationszyklus des Virus zu unterstützen.
Eine Lösung für dieses Problem ist die Verwendung eines nicht-veränderten Baculovirus, das in der erwünschten Wirt/Zielspezies replizieren kann, bei der gemischten PIB- Methode. NOVs des Virus, das in dem Wirt/Ziel gut replizieren kann, werden zur Infektion einer Zellinie verwendet, in der sie ebenfalls gut replizieren können. Die Zellinie wird gleichzeitig, gemäß dem bereits beschriebenen Verfahren, mit dem veränderten Virus coinfiziert. Es wird vermutet, daß das kompetente Virus die Funktionen liefert (durch Komplementierung), die das dazu nicht befähigte Virus benötigt, worauf beide Viren replizieren. Das veränderte Virus wird in PIBs verpackt, die durch das Wildtypvirus gebildet werden. Dies erlaubt die so erhaltenen mPIBs als Mittel zu verwenden, das genetisch veränderte Virus zu dem Wirt/Zielinsekt zu bringen. In dieser Situation würden sich die mPIBs im Mitteldarm des Insekts auflösen und Zellen werden gleichzeitig mit beiden Viren infiziert werden. Das Phänomen der Komplementierung sollte wiederum die Replikation des veränderten Virus und die Expression des heterologen Gens in dem Wirt/Zielinsekt erlauben. Wenn keine Zellinie zur Verfügung stehen sollte, in der das unveränderte Virus replizieren kann, kann dieses Verfahren in lebenden Insekten durchgeführt werden. In diesem Falle würden den Insekten NOVs beider Arten von Viren injiziert werden. Die so erhaltenen PIBs werden dann eine gemischte Zusammensetzung aufweisen.
Die nachfolgenden Beispiele werden angegeben, um die Erfindung weiter zu erläutern, sollen aber weder den durch die nachfolgenden Patentansprüche definierten Schutzbereich der Erfindung beschränken, noch so ausgelegt werden.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung und Verwendung von mPIB:3h8/L-1
(a) Die beiden zur Herstellung von mPIB:3h8/L-1 verwendeten Viren waren die folgenden:

PIB&spplus;-Baculovirus: L-1-Variante von AcNPV

Die L-1-Variante des nuklearen polyhedralen Virus Autographa californica (AcNPV) bildet gewöhnlich NPV-Plaques, die unter dem Lichtmikroskop eine hohe Lichtbrechung aufweisen, was auf die Erzeugung von PIBs in infizierten Zellen zurückzuführen ist. Andere Polyhedrin-erzeugende Varianten von AcNPV oder andere NPVs können ebenfalls verwendet werden.

PIB&supmin;, Insert&spplus;-Baculovirus: 3h8

Das rekombinante NPV, 3h8, kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. VR2096 erhalten werden. 3h8 stellt eine rekombinante Variante von AcNPV dar, in welcher der größte Teil des Polyhedrinstrukturgens entfernt und durch eine cDNA ersetzt wurde, die, unter der transkriptionellen Kontrolle des AcNPV Polyhedrinpromotors, den menschlichen Gewebe-Plasminogen- Aktivator (t-PA) codiert. 3h8 kann nicht die Synthese von Polyhedrin oder PIBs steuern und erzeugt infolgedessen virale Plaques, die das Licht nicht brechen.
(b) Restriktionsendonuklease (REN)-Analyse viraler DNA
Die L-1-Variante und das rekombinante Virus 3h8, können durch ihre unterschiedlichen Plaque-Morphologien und ihre elektrophoretisch auf Agarosegelen analysierten REN-Muster unterschieden werden. Ein einfaches Verfahren zur Durchführung der letzteren Unterscheidung stellt ein herkömmlicher Southern blot von mit REN gespaltener DNA dar. Für diese Analyse ist EcoRI gut geeignet, wobei das etwa 7,5 kb große AcNPV-REN- Fragment, das als das EcoRI-Fragment bezeichnet wird, eine geeignete Sonde darstellt. Das Wildtyp-L-1-Virus enthält das intakte, einzelne EcoRI-Fragment. Das rekombinante Virus, 3h8, ergibt zwei inserierte Fragmente mit 4,5 kb und 3,5 kb Länge, da das inserierte t-PA-Gen mehr als eine EcoRI-Schnittstelle aufweist. Ein Gemisch dieser beiden Viren, L-1 und 3h8, ergibt bei Analyse der mit EcoRI erzeugten DNA-Fragmente alle drei Banden. Die relative Intensität der drei Banden auf dem Autoradiogramm ist ein Hinweis auf das Verhältnis des rekombinanten zum Wildtyp-Virus.
(c) Herstellung und Analyse der mPIBs
Zur Herstellung der PIBs mit gemischter Zusammensetzung werden Spodoptera frugiperda-Zellen in einem Schüttelbehälter mittels herkömmlicher Verfahren mit NOVs von sowohl dem Wildtyp L-1 als auch dem rekombinanten 3h8-Virus bei relativ hoher Multiplizität der Infektion infiziert. Beide Viren etablieren eine Infektion in jeder Zelle. In der späten Phase des Infektionszyklus, wenn das Polyhedrin üblicherweise hergestellt wird, steuert das 3h8-Virus die Expression des fremden Gens, das es enthält (t-PA), und der Wildtyp steuert die Expression des Polyhedrinproteins und die Bildung der PIBs. Sobald sich die PIBs aus dem Polyhedrinprotein bilden und das Wildypvirus einschließen, schließen sie gleichzeitig auch das rekombinante 3h8-Virus ein. Das Verhältnis der einzubringenden Wildtyp-L-1 zu den rekombinanten 3h8-NOVs kann so verändert werden, daß es das Verhältnis der zwei Virentypen in den PIB-Nachkommen beeinflußt.
Dieses Verfahren kann experimentell wie folgt gezeigt werden. Am Ende des Infektionszyklus werden die Nachkommen- NOVs, die sich in dem Überstand des Schüttelkolbens befinden, durch Ausplattieren auf neue Zellen charakterisiert. Der Anstieg des erhaltenen Titers zeigt, daß sich das Virus vermehrt. Das Verhältnis von PIB&spplus;- zu den PIB&supmin;-Nachkommenschafts-Viren im Plaquetest spiegelt das Verhältnis der eingebrachten Viren wieder.
Die Zusammensetzung der Nachkommenschafts-PIBs in den infizierten Zellen kann durch Analyse der Genomstruktur der in der Nachkommenschafts-PIBs enthaltenen Viruspartikel bestimmt werden. Diese PIBs werden durch Zentrifugation der infizierten Zellen und nachfolgende Reinigung der darin enthaltenen PIBs gesammelt. Die in den PIBs enthaltenen Virus-Nucleocapside werden durch Auflösung mittels Alkali freigesetzt. Die virale DNA wird gereinigt und mit EcoRI gespalten und die so erhaltenen Restriktionsfragmente durch Agarosegel- Elektrophorese aufgetrennt. Southern-blotting des Gels und hybridisieren des Blots mit dem viralen EcoRI-Fragment als Sonde gemäß üblicher Methoden zeigte die Anwesenheit beider viralen Genome. Die Intensität der Banden zeigt ihre relative Häufigkeit.
Beispiel 2: Horizontale Weitergabe einer gemischten viralen Infektion
mPIB:3h8/L-1 wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 bei zwei unterschiedlichen L-1 : 3h8-Verhältnissen der Multiplizität der Infektion hergestellt, d. h. bei 1 : 1 und 1 : 10. Am Ende des Infektionszyklus wurden die mPIBs geerntet und die geernteten mPIBs an Heliothis virescens-Raupen verfüttert. Das Verfüttern wurde ausgeführt, indem die mPIBs auf die Oberfläche der künstlichen Nahrung aus gebracht wurden, mit der die Raupen aufgezogen wurden. Im allgemeinen wurden auf die Futterquelle 10&sup5;-10&sup6; mPIBs/Raupe ausgebracht. Die Raupen starben im allgemeinen innerhalb von 5 Tagen an der Virusinfektion. Die toten oder sterbenden Raupen wurden gesammelt und in einem Zellkulturmedium, TC-100, homogenisiert, das so eingestellt worden war, daß es 5mM Cystein enthielt (ungefähr 5 Raupen/5 ml Medium). Das Homogenisat wurde bei 10000xg zentrifugiert, um die PIB-enthaltenden Zellfragmente als Niederschlag zu erhalten. Der Überstand, der die NOVs enthielt, wurde zur Entfernung mikrobieller Verunreinigungen durch einen 0,45 Micron Filter filtriert und anschließend auf frische Spodoptera frugiperda-Zellen ausplattiert. Nach etwa 5 Tagen hatten sich die Plaques ausreichend entwickelt, so daß ihre Morphologie (PIB&spplus; gegenüber PIB&supmin;, Insert&spplus;) und das L-1 : 3h8 Verhältnis bestimmt werden konnte.
Um die PIBs zu reinigen wurde der bei 10000xg erhaltene Niederschlag in 20 ml 0,1% SDS aufgenommen, homogenisiert und durch zwei Schichten eines Nesseltuchs filtriert. Das Filtrat wurde 10 Minuten bei 6000xg zentrifugiert und der Niederschlag in 0,1% SDS wieder aufgenommen. Der Zentrifugationsschritt wurde erneut durchgeführt und der Niederschlag in Wasser wieder aufgenommen. Diese Suspension wurde erneut zentrifugiert und der Niederschlag erneut in Wasser aufgenommen, um eine PIB- Suspension herzustellen. Eine Analyse des Nucleocapsidinhalts der so hergestellten PIBs (gemäß der zuvor für in Zellkultur erzeugte mPIBs beschriebenen Methoden) zeigte, daß diese Nachkommen-PIBs beide eingebrachten Nucleocapside enthielten. Das Verhältnis des Wildtyps zum 3h8-Virus war jedoch im Verhältnis zu dem ursprünglich eingebrachten Verhältnis erhöht. Es wurde auch gefunden, daß die durch fortgesetzte Weitergabe durch Raupen erzeugten nachfolgenden Nachkommen-mPIBs beide Arten von Nucleocapsiden enthielten, jedoch wiederum mit einem allmählichen Anstieg des Verhältnisses Wildtyp zu 3h8-Virus.

Claims

1. Polyhedraler Einschlußkörper (PIB) gemischter Zusammensetzung, welcher umfaßt:

(a) ein erstes Baculovirus, das ein Polyhedrin codierendes Gen enthält, das mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verbunden ist, die dem Baculovirus ermöglicht, die Synthese von Polyhedrin in infizierten Zellen zu steuern, und

(b) ein zweites Baculovirus, das allein nicht die Synthese von PIBs steuern kann, jedoch ein heterologes Gen enthält, das mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verknüpft ist, die dem Raculovirus erlaubt, die Bildung des durch das heterologe Gen codierten heterologen Proteins in einer infizierten Zelle zu steuern.

2. PIB nach Anspruch 1, bei dem das erste Baculovirus ein Wildtyp eines nuclearen Polyhedrosisvirus (NPV) ist.

3. PIB nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das zweite Baculovirus ein heterologes Gen enthält, das in den Polyhedringen-Locus inseriert ist.

4. PIB nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Expressionskontrollsequenzen den Polyhedrinpromotor umfassen.

5. PIB nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das zweite Baculovirus eine Deletion von wenigstens einem Teil des Polyhedringens aufweist.

6. PIB nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das heterologe Gen ein Enzym oder ein therapeutisches Protein codiert.

7. Verfahren zur Herstellung von PIBs nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man eine Zellkultur von Baculovirus-permissiven Zellen mit den genetisch unterschiedlichen Baculoviren infiziert und die infizierten Zellen unter geeigneten Bedingungen züchtet, die eine virale Replikation und die PIB-Herstellung gestatten.

8. Verfahren zur Herstellung von PIBs nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man ein Insekt mit den genetisch unterschiedlichen Baculoviren unter Bedingungen infiziert, die geeignet sind, eine virale Replikation und PIB-Herstellung in Zellen des infizierten Insekts zu gestatten.

9. Verfahren zur Coinfektion eines Insekten-Wirts mit einem ersten Baculovirus, das die Herstellung von Polyhedrin in infizierten Zellen steuern kann und mit einem zweiten Baculovirus, dem ein funktionelles Polyhedrin codierendes Gen fehlt, das jedoch ein heterologes Gen enthält, das ein heterologes Protein codiert, wobei man bei dem Verfahren dem Insekten-Wirt ermöglicht, eine wirksame Menge an PIBs nach einem der Ansprüche 1 bis 8 aufzunehmen, die die Bildung einer gemischten viralen Infektion in dem Insekten-Wirt gestattet.

10. Verfahren zur Herstellung eines bei der Synthese eines heterologen Proteins nützlichen PIB, bei dem man einen Insekten-Wirt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 9 coinfiziert und das Insekt unter geeigneten Bedingungen und für eine angemessene Zeitspanne züchtet, die die virale Replikation und die PIB-Herstellung gestattet.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 10, das weiter umfaßt, auf diese Weise hergestellte PIBs aus der infizierten Insektenzellkultur oder dem Insekt wiederzugewinnen.

12. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins in einem Insekt, bei dem man das Insekt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 9 coinfiziert und das Insekt unter geeigneten Bedingungen und für eine wirksame Zeitspanne züchtet, die eine virale Replikation und die Bildung des durch das in einem der Baculoviren vorhandene, heterologe Gen codierten heterologen Proteins ermöglicht.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das weiter umfaßt, das heterologe Protein aus dem Insekt wiederzugewinnen, in dem es gebildet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, das weiter umfaßt, die so wiedergewonnenen heterologen Proteine zu reinigen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das heterologe Protein ein therapeutisches Protein oder ein Enzym ist.