DE3885579T2

DE3885579T2 - Densonukleosis hervorrufende Plasmide, Verfahren zu deren Herstellung sowie dessen Verwendung zur Bekämpfung von Insektenplagen.

Info

Publication number: DE3885579T2
Application number: DE88403030T
Authority: DE
Inventors: Max Bergoin; Bruno Dumas; Monica Gervais; Mireille Jourdan; Francoise Xaviere Jousset
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1987-12-03
Filing date: 1988-12-01
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2008-12-02
Also published as: ATE97161T1; JP2717825B2; FR2624121A1; DE3885579D1; FR2624121B1; JPH022360A; EP0319418A1; EP0319418B1; CA1340779C

Description

Die Erfindung betrifft neue Plasmide, die Densonucleosen hervorrufen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur biologischen Bekämpfung von schädigenden Insekten.
Densonucleosen sind Krankheiten, die eine große Anzahl von Invertebraten, insbesondere Insekten, befallen, und die durch Densoviren hervorgerufen werden. Der Ausdruck "Densonucleose" beschreibt die charakteristische Hypertrophie der Zellkerne, in denen sich die Densoviren vermehren. Unter natürlichen Bedingungen kann eine Mortalität von annähernd 100% in vier oder fünf Tagen erreicht werden.
Diese Viren, die der Gattung Densovirus angehören, stellen mit den zwei Vertebraten-Parvovirus-Gattungen Parvovirus und Dependovirus die Familie der parvoviridae dar.
Die Densoviren sind kleine isometrische hüllenlose DNA- Viren, die für mehrere Arten von schädigenden Insekten mit wirtschaftlicher Bedeutung, insbesondere die Lepidoptera, bei denen sie ursprünglich entdeckt wurden, pathogen sind. In natürlichen Milieus sind sie für Tierseuchen, die wirksam in die Regulation der Populationen ihrer Wirte eingreifen, verantwortlich. Gegenwärtig wurden etwa 20 Densoviren aus Insekten verschiedener Gruppen, Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Dictyoptera, aus allen Regionen des Globus isoliert.
Die Densoviren bieten somit sehr interessante Möglichkeiten bei der Verwendung gegen Insekten mit ökonomischer Bedeutung und insbesondere gegen Lepidoptera, wobei dieses neue Mittel zur mikrobiologischen Schädlingsbekämpfung die chemischen Schädlingsbekämpfungsmittel ersetzen oder komplettieren kann.
Außerdern ist es wichtig zu betonen, daß trotz ihrer starken Virulenz gegenüber Insekten, vorläufige Versuche und mehrjährige Experimente im Labor keine pathogenen Wirkungen für den Menschen nachgewiesen haben.
Präparate auf der Basis anderer entomopathogener Viren, wie dem Baculovirus, werden gegenwärtig im Handel vertrieben.
Die Verfahren zur industriellen Herstellung dieser Viren, die auf der Infektion von Insekten in einer Massenzucht beruhen, sind mit erhöhten Produktionskosten verbunden. Die Versuche, diese Viren in Zellkulturen in Massen zu produzieren, stießen auf die gleichen Probleme der Gestehungskosten.
Wie für die Baculoviren, wird die Multiplikation der Densoviren normalerweise in Larven erhalten, (Ann. Rev. Entomol. 1979, 24 : 63 87) was erhöhte Produktionskosten mit sich bringt.
Außerdem können unter Berücksichtigung der großen Schwierigkeiten, die zur Einsetzung der Kunstmedien, die zur industriellen Aufzucht notwendig sind, mehrere Densovirenstämme nicht in ihren Wirten vermehrt werden.
Es wäre somit sehr interessant, andere Produktionswege für das infektiöse Material zu finden, ohne daß dazwischen im Wirt vermehrt werden muß. Sonst ist es möglich, die Densoviren auf gentechnischem Weg zu produzieren. In der Tat ist die Größe ihres Genoms mit einer Insertion in ein bakterielles Plasmid kompatibel, während diese für ein Virus mit einem Genorn mit einem sehr hohen Molekulargewicht, wie das Baculovirus, nicht in Betracht gezogen werden kann.
Gegenstand der Erfindung sind somit neue rekombinante Plasmide mit der Fähigkeit zur Replikation in Escherichia coli, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine vollständige oder teilweise, doppel- oder einzelsträngige DNA- Sequenz eines Densovirus, das bei einem empfindlichen Insekt eine Densovirose hervorrufen kann, enthalten.
Alle Densoviren, von denen eine vollständige oder teilweise DNA-Sequenz in den erfindungsgemäßen Plasmiden enthalten ist, sind in Intervirology 23: 61-73 (1985) zitiert. Die am meisten untersuchten Densoviren der Lepidoptera sind die Junonia-, Galleria- und Agraulis-Densoviren.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere Plasmide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine vollständige oder teilweise, doppel- oder einzelsträngige Sequenz eines Junonia-, Galleria- oder Agraulis-Densovirus enthalten, und insbesondere Plasmide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine vollständige oder teilweise, doppeloder einzelsträngige DNA-Sequenz des Junonia-Densovirus (=J-DNV) enthalten. Diese zuletzt genannten Plasmide werden nachstehend im Text pJ genannt.
Das Genom des Densovirus besteht aus einem einzelsträngigen linearen DNA-Molekül mit 5.000 bis 6.000 Basen. Im Verlauf der viralen Morphogenese umkapseln die Densovirus Virionen ohne Unterschied, aber immer getrennt und in äquimolaren Verhältnissen, Plusketten und Minusketten. Die Extraktion der DNA aus einer derartigen viralen Population unter Bedingungen mit erhöhter Ionenstärke (0,1 SSC) führt zur Bildung doppelsträngiger Moleküle durch Paarung der komplementären Ketten (Truffaut et al (1967) und Arch. Ges. Virusforsch. 21, 469-474. und Barvise, A.H., und Walker, 1.0. (1970). FEBS Lett. 6, 13-16).
Durch ihr geringes Molekulargewicht und ihre Eigenschaft, Doppelstränge zu bilden, eignen sich so diese Genome besonders gut zur Integration in Plasmide. Es ist zu betonen, daß die doppelsträngige DNA, die aus den Virionen extrahiert wurde, infektiös ist, sowohl in Zellkulturen als auch bei Transfektion von Larven einer empfindlichen Art (JOUSSET, 1er, Congr. Soc. fr. Microbiol., Toulouse (France), April 1986, CP59, S. 44 und JOUSSET Soc. Invertebr. Pathol., 1986, S. 121. Colloq. Invertebr., Veldhoven (The Netherlands), August 1986).
Die Klonierung der doppelsträngigen DNA des Junonia- Densovirus wurde somit durchgeführt und ist nachstehend im experimentellen Teil beschrieben.
Die so erhaltene klonierte Genom-Sequenz wurde nach üblichen Methoden bestimmt (Sanger et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 S. 5463 - Maxam A.M. et Gilbert W. (1980) Methods Enzymol. 65 S. 499).
Gegenstand der Erfindung ist somit auch die vollständige Sequenz des viralen Genoms des Densovirus J-DNV, die in Figur 1 angegeben ist.
Sie betrifft insbesondere die vollständige Sequenz der viralen DNA des Densovirus J-DNV entsprechend der in Figur 1 angegebenen Sequenz, worin die beiden Enden "X" und "Z" entfernt sind.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere die Plasmide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die vollständige Sequenz des viralen Genoms des Densovirus J-DNV, wie in Figur 1 angegeben, enthalten.
Weiterhin betrifft die Erfindung insbesondere die Plasmide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die vollständige oder teilweise, doppel- oder einzelsträngige DNA- Sequenz des Galleria-Densovirus enthalten. Diese Plasmide werden in der nachstehenden Beschreibung pG genannt. Unter den vorstehend definierten pJ-Vektoren ist der Vektor pBRJ der bevorzugte Vektor.
Dieses Plasmid ist dadurch gekennzeichnet, daß es die vollständige Sequenz der viralen DNA des Densovirus J-DNV, kloniert entsprechend der in Figur 1 angegebenen Sequenz, worin die beiden Enden "x" und "Z" entfernt sind, umfaßt. Das Konstruktionsprinzip des Plasmids ist nachstehend in der Beschreibung angegeben, und dessen Konstruktion ist in dem Versuchsteil näher erläutert.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Plasmide greift auf üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendete Techniken zurück. Diese Techniken sind diejenigen, die beispielsweise in Maniatis Molecular cloning: A - Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) oder in Basics methods in molecul biology Davis - Dibner Battney - Elsevier (1986) beschrieben sind.
Der zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Plasmide verwendete Ausgangsvektor ist bevorzugt pBR322, aber jeder andere klassische Klonierungsvektor kann verwendet werden, wie beispielsweise der Vektor PUC&sub1;&sub8; [Norrander, J. et al, Gene 26, 101 - 106 (1983)] oder der Vektor pAT&sub1;&sub5;&sub3; [Twigg - A.J. und Sheratt D., Nature 283, 216 - 218 (1980)].
Dieser Ausgangsvektor wird durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme an einer Klonierungsstelle, die bevorzugt eine einmal vorhandene Stelle ist, gespalten.
Die Wahl dieser Spaltstelle wird durch die vorherige Kenntnis hinsichtlich der Kartierung des viralen Genoms des Densovirus bestimmt. So können die pJ-Plasmide, die bereits früher definiert wurden, ausgehend von dem Ausgangsvektor pBR322, der durch Enzyme, die glatte Enden erzeugen, wie beispielsweise EcoRV oder Nru I, oder durch Enzyme, die klebrige Enden erzeugen, wie beispielsweise Pst I gespalten wurde, konstruiert werden.
Diese verschiedenen Möglichkeiten ergeben sich aus der Kartierung des viralen Genoms J-DNV, die in der Figur 2 angegeben ist.
Die gleiche Klonierungsstrategie kann natürlich auch auf andere erfindungsgemäße Plasmide angewandt werden, wie beispielsweise auf die pG-Plasmide, die bereits vorstehend definiert wurden, die unter Verwendung des Restriktionsenzyms PstI konstruiert wurden.
Die Konstruktion des bevorzugten erfindungsgemäßen Plasmids, des Plasmids pBRJ, ist in Figur 3 näher erläutert. Die virale DNA wurde ausgehend von dem Junonia-Virus nach bekannten Extraktions- und Reinigungstechniken erhalten. Die gereinigte DNA wird nach Behandlung mit einer Polymerase in eine einzige EcoRV-Spaltstelle von linearisiertem pBR322 integriert.
Nach Transformation in Escherichia coli werden nur die ampicillinresistenten und tetracyclinempfindlichen Kolonien selektioniert.
Mini-Lysen der rekombinanten Bakterien werden durchgeführt, um nur die Kolonien zurückzubehalten die die Plasmide beherbergen, in die ein Fragment mit einer Größe von etwa der der genomischen DNA insertiert wurde.
Das Konstruktionsschema von pBRJ ist in Figur 3 angegeben. Außerdem betrifft die Erfindung bakterielle Wirte Escherichia coli, die durch die rekombinanten Plasmide mit der Fähigkeit zur Replikation in Escherichia coli transformiert wurden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine vollständige oder teilweise, doppel- oder einzelsträngige DNA-Sequenz eines Densovirus, welches bei einem empfindlichen Insekt eine Densovirose hervorruft, enthalten. Sie betrifft insbesondere Bakterien, die durch die pJ-Plasmide transformiert wurden, und insbesondere solche, die durch das Plasmid pBRJ transformiert wurden.
Alle vorstehend definierten Plasmide und insbesondere die pJ-Plasmide und darunter das Plasmid pBRJ können zur Bekämpfung schädigender Insekten verwendet werden.
Die im experimentellen Teil beschriebenen Assays zeigen in der Tat, daß die Transfektion durch Injektion des Plasmids pBRJ in die Hämolymphe der Spodoptera-Larven eine Densovirose, die derjenigen, die durch Inokulation des Virions oder der viralen J-DNA hervorgerufen wird, identisch ist, hervorruft.
Die gleiche Empfindlichkeit gegenüber pBRJ wurde an Spodoptera-Stämmen, die gegenüber chemischen Insektiziden, wie Deltametrin, resistent sind, gezeigt.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Plasmide und insbesondere der pJ-Plasmide und darunter die Verwendung des Plasmids pBRJ zur biologischen Bekämpfung von schädigenden Insekten.
Die Insekten mit ökonomischer Bedeutung, die von einer derartigen Anwendung betroffen sind, sind bestimmte Diptera-Vektoren, die von medizinischem und veterinär-medizinischem Interesse sind, und die Lepidoptera und Coleoptera, die Schädlinge von der Ernährung dienenden und industriellen Kulturen sind (Baumwolle, Mais, Soja, Ölpalme, Bananenstaude).
Die Erfindung umfaßt allgemein alle insektiziden Formulierungen, die einer derartigen Anwendung angepaßt sind.
Die ädaquaten Formulierungen sind diejenigen, die eine Umhüllung der DNA der erfindungsgemäßen Plasmide gestatten. Die Träger, die diese DNA umhüllen, müssen mehreren Kriterien gehorchen:
- interne hydrophile Kavität mit ausreichendem Durchmesser;
- Gewährleistung des Schutzes der Plasmid-DNA in dem Intestinaltrakt;
- Freisetzung ihres Gehalts in den Zielzellen, beispielsweise den Zellen des Darmmilieus.
Derartige Träger sind beispielsweise Niosomen, Liposomen, Gelatine-Mikrokapseln oder wasserlösliche Polymere oder Acryl-Amidpolymere oder jeder andere Typ von Mikrokapseln, die mit den vorstehend definierten Kriterien kompatibel sind. Verkapselungsformen in den einzelsträngigen Phagen des Typs M 13 sind auch in Betracht zu ziehen.
Die nachstehend angegebenen Versuchsergebnisse erläutern die Erfindung näher, ohne sie in irgendeiner Weise zu beschränken.

Konstruktion des Plasmids pBRJ

1. Reinigung der Virus-DNA
2. Klonierung der Virus-DNA
3. Sequenz der Virus-DNA
4. Ergebnisse der Transfektionen von Larven von Spodoptera littoralis durch die DNA des Densovirus, welche in pBR322, kloniert wurde oder nicht kloniert wurde.

1. Reinigung der DNA

a) Reinigung des Virus

20 bis 30 Larven von Spodoptera littoralis, die durch das Junonia-Densovirus infiziert wurden, wurden in einer Pottervorrichtung in einem Puffer aus 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, und 2% Ascorbinsäure zerkleinert. Das Zerkleinerungsgut wurde durch zehnminütige Zentrifugation bei 10.000 g geklärt. Die Virionen wurden anschließend durch 90-minütige Zentrifugation bei 35.000 UpM in einem SW41-Rotor bei 4ºC zusarnmengeballt. Der Bodensatz wurde aufgenommen und auf einen 20 bis 76%-igen Renographiegradienten aufgebracht und 15 Stunden lang bei 35.000 UpM in einem SW41-Rotor zentrifugiert. Die in dem unteren Drittel des Gradienten lokalisierte Virusbande wurde gewonnen und anschließend drei Tage lang gegen einen TE-Puffer (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) mit Pufferwechsel alle 12 Stunden dialysiert. Die Reinheit der viralen Suspensionen wurde anschließend elektronenmikroskopisch und durch UV-Spektrophotometrie kontrolliert. Ihre Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm abgeschätzt. Eine OD-Einheit bei 260 nm entspricht 100 µg Virion pro ml.

b) Extraktion der DNA

Der Puffer der viralen Suspension wurde auf 4 mM EDTA, auf 100 µg Proteinase K pro ml und auf 2% Sarkosyl eingestellt.
Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37ºC wurde die Suspension drei Mal mit dem gleichen Volumen an Phenol gesätttigtem TE-Puffer extrahiert. Die wäßrige Phase wurde gewonnen und anschließend gegen TE-puffer dialysiert. Die DNA wurde anschließend durch Zugabe von Natriumacetat oder Lithiumchlorid mit einer Endkonzentration von 0,2 M und 2 Volumina Ethanol zwölf bis sechzehn Stunden lang bei -20ºC ausgefällt. Der DNA-Bodensatz wurde drei Mal mit 70%-igem Alkohol gespült und dann in TE-Puffer aufgenommen. Die Reinheit der viralen DNA-Lösung wurde kontrolliert und ihre Konzentration UV-spektrophotometrisch bestimmt.

2. Klonierung der Virus-DNA

a) Herstellung der Virus-DNA

Die Enden des Virus wurden durch die DNA-Polymerase des Klenow-Fragments von E. coli repariert.
3 µg Virus-DNA wurden in einem Volumen von 75 µl mit Hilfe von 7,5E DNA der E.coli-Polyrnerase (Boehringer Mannheim Biochemicals = BMB Kat.-Nr. 1014531) repariert. Der Reparaturpuffer enthielt Desoxyadenosin, Desoxycytosin, Guanosin und Thymidin in einer Konzentration von 40 µm, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM Betamercaptoethanol, 100 µg/ml Rinderserumalbumin und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Der Reaktionsansatz wurde eine Stunde lang bei 25ºC inkubiert. Nach einer Stunde bei 65ºC wurde der Reaktionsansatz mit mit Phenol gesättigtem 0,1 M Tris, pH 7,5, extrahiert und anschließend in Gegenwart eines 0,3 M Acetatvolumens und zwei Volumina 100%-igem Ethanol präzipitiert.

b)Herstellung der DNA des Vektors pBR322

Die DNA von pBR322 wurde nach dem von Maniatis und Mitarbeitern, Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschriebenen Verfahren hergestellt. 2,5 µg DNA von pBR322 wurden durch das Restriktionsenzym EcoRV gemäß den von den Herstellern BMB beschriebenen Bedingungen unter Verwendung von 18E/µg DNA des Enzyms in einem Volumen von 50 µl während vier Stunden bei 37ºC gespalten. Die Spaltung der DNA wurde mittels eines 1%-igen Agarosegels bestätigt. Die DNA wurde anschließend mit alkalischer Kälberdarm-Phosphatase dephosphoryliert. Dann wurden 2 µl alkalische Phosphatase BMB Katalog Nr. 713023 in einer Konzentration von 22E/µl zugesetzt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch eine 45-minütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. Nach einer Extraktion mit mit Phenol gesättigtem 0,1M Tris, pH 7,5, wurde die wäßrige Phase mit Ethanol in Gegenwart von 0,3 M Acetat gefällt.

c) Ligierung der DNA des Junonia-Virus in den durch das

Restriktionsenzym EcoRV linearisierten Vektor pBR322

Nach Präzipitation und Trocknung wurde die Vektor-DNA in einer Konzentration von 40 ng/µl, die Virus-DNA in einer Konzentration von 1 µg/µl aufgenommen. Die Ligierung wurde in einem Volumen von 25 µl unter den vom Hersteller (New England Biolabs) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Nach einer Inkubation von einer Nacht bei 4ºC war das Gemisch zur Transformation der Escherichia coli Bakterien (MC1061) bereit (Casabadan MJ. Methods in Enzymol. (1983) 100 S. 293-3080).

d) Transformation von kompetenten Bakterien

Die kompetenten Bakterien wurden nach dem von Hanahan (Maniatis 1982) beschriebenen Protokoll hergestellt und bei - 70ºC in Form von 200 µl-Fraktionen aufbewahrt. Ein 100 µl Aliquot kompetenter Bakterien wurde bei 37ºC, ohne 0ºC zu übersteigen, aufgetaut und mit 1 µl der vorstehenden Lösung, die die Virus-DNA und den Vektor pBR322 enthielt, versetzt. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 0ºC und einem anschließenden 5-minütigen thermischen Schock bei 37ºC wurden 900 µl LB-Medium (10 g Bactotrypton DIFCO, 5 g Hefeextrakt DIFCO, 5 g NaCl pro Liter, autoklaviert bei 120ºC) zugegeben. Die rekombinanten Bakterien wurden auf den Gefäßen mit einem gelosehaltigen LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, selektioniert. Unter 253 ampicillinresistenten Kolonien wurden 50 tetracyclinempfindliche Kolonien selektioniert.

e) Mini-Lyse der rekombinanten Bakterien und Gewinnung von pBRJ

Unter diesen tetracyclinempfindlichen rekombinanten Bakterien, trug ein einziges die Virus-DNA in die EcoRV-Spaltstelle kloniert. Ausgehend von einer Kultur (1,5 ml) in LB-Medium mit jedem der rekombinanten Klone wurden die Plasmid-DNAV's nach dem Alkali-Verfahren (Maniatis 1982) hergestellt. Jede der DNA's wurde durch das Restriktionsenzym EcoR1 gespalten. Eine einzige Kolonie beherbergte die Plasmid-DNA entsprechend einer DNA von pBR322 mit dem Junonia-Densovirus in Insertion in die EcoRV-Spaltstelle, die während der Klonierung zerstört wurde. Das entsprechende pBRJ-Plasmid wurde in großer Menge aus einem Liter einer mit dem LB-Medium gesättigten Kultur nach dem Natriumhydroxid- und dem Natriumdodecylsulfat-Verfahren (Maniatis 1982) hergestellt. Die Spaltungen durch die Restriktionsenzyme BamH1, Pvu2, Bgl2, Nru1, Acc1, Pvu1, BstE2, Sph1, EcoR1, Hind3, Rsa1, Bgl1 gestatteten die Feststellung, daß die DNA des Densovirus in die EcoRV- Spaltstelle, die während der Klonierung zerstört wurde, in der in Figur 3 beschriebenen Orientierung insertiert worden war.

3) DNA-Sequenz des Junonia-Densovirus

Der größte Teil der DNA-Sequenz des Virus wurde nach dem Sanger-Verfahren (Sanger 1977) bestimmt. Die Verbindung des pBR322-Virus mit der Hind3-Spaltstelle von pBR322 wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren sequenziert.

a) Sanger-Verfahren

1) Zufallsklonierung

- Enzymatisches Verfahren

Die Zufallsklonierungen wurden mit den Restriktionsenzymen Sau3A1, Xho2, Alu1, Hae3, Acc1 durchgeführt. Die Virus-DNA wurde durch diese Restriktionsenzyme, die die DNA des Junonia-Densovirus häufig spalten, abgebaut, um Fragmente in der Größenordnung von 100 Basenpaaren (bp) bis 1000 bp zu erhalten. Die erhaltenen Fragmente wurden in die Vektoren M13mp8 und M13mp9 (Messing, J. et Viera, Gene, 19, 259-268 (1982)), welche durch das Enzym BamH1 (Spaltungen Sau3A, Xho2) durch das Enzym Sma1 (Spaltungen Alu1, Hae3) und durch das Enzym Acc1 (Spaltung Acc1) gespalten worden waren, subkloniert.

- Ultraschallverfahren

Die DNA des Virus wurde bis zum Erhalt von Fragmenten in der Größenordnung von 500 bp beschallt. Die erhaltenen Fragmente wurden mit Hilfe der DNA-Polymerase des E.coli Klenow-Fragments nach dem vorstehend beschriebenen Protokoll repariert. Die so erhaltenen Fragmente wurden anschließend in die Vektoren M13mp8 und M13mp9, die durch das Enzym Sma1 gespalten worden waren, subkloniert.

2) Subklonierung der nach der Restriktionskartierung clonierten Fragmente

Die Subklonierung der identifizierten Restriktionsfragmente, deren Größe kleiner 2000bp war, die durch Abbau mit den Restriktionsenzymen (siehe die in Figur 2 angegebene Restriktionskarte) BamH1, EcoR1, Hind3-BstE2, BstE2-BamH1, BstE2-Hind3, Hind3-Pvu2, Xba1-BstE2, xba1, Hae3, Pvu2- Hae3, EcoR1-Xba1, xba1-BstE2, Hae3-EcoR1, Hae3-Xba1, EcoR1-Pvu2, Hae3-BstE2, durchgeführt. Die durch Spaltung mit den vorstehend angegebenen Restriktionsenzymen erhaltenen Fragmente mit einem Molekulargewicht von 110bp bis 2000bp wurden subkloniert und anschließend stückweise unter Verwendung von Startersequenzen sequenziert (Sanger (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 S. 5463; Biggin (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. 80 S. 3963).

b) Maxam-Gilbert-Verfahren

Ein 375bp Hind3- und BsteII-Fragment nahe der EcoR1-Spaltstelle von pBR322 erwies sich als mit dem Sanger-Verfahren nicht sequenzierbar. Die Sequenz dieses Fragments wurde von der Hind3-Spaltstelle und der BstE2-Stelle aus unter Markierung mit der T4 DNA-Polynucleotid-Kinase und ³²P-ATP oder mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase und ³²P- dTTP oder ³²P-dCTP (Maxam und Gilbert) erhalten. Die Reaktionsprodukte ließ man auf einem denaturierten harnstoffhaltigen Acrylamidgel (Sanger and Carbon (1978) F.E.B.S. Lett. 87, S. 107) in Gegenwart von 40%-igem Formamid wandern.

c) Anordnung der Sequenzen

Die erhaltenen Sequenzen wurden in einen Computer vom Typ Microvax2 eingegeben. Sie wurden mit Hilfe der Programme DB SYSTEM, geschrieben von R.STADEN (Nucleic Acids Research 12 (1) Juni 1987, S. 387-395) verglichen.
Nach Editieren der Sequenzen mit Hilfe des Editionsprogrammes EDIT auf VAX/VMS wurden die Sequenzen untereinander mit Hilfe des Programmes DBCOMP von STADEN verglichen und anschließend mit Hilfe des Programmes DBUTIL angeordnet. Die so erhaltene Consensus-Sequenz ist in Figur 1 angegeben.

4) Ergebnisse der Transfektionen von Spodoptera-littoralis-Larven mittels DNA des Densovirus, die in pBR322 kloniert ist, oder nicht kloniert ist

a) Protokoll der Transfektion durch Inokulation

Unterschiedliche Konzentrationen an J-DNA oder pBRJ wurden in junge Spodoptera-littoralis-Larven (Stadium 2 oder 3) in einem TE-Puffer, pH 8,0 (10 mM Tris, 1 mM EDTA), welcher mit DEAE-Dextran (2 mg/ml Endkonzentration) versetzt war, inokuliert.

b) Überwachung der Larven

Die transfizierten Larven und diejenigen einer Kontrollcharge wurden individuell in einem axenischen Medium bei 25ºC aufgezogen. Täglich
- wurden die gestorbenen Larven entnommen;
- wurde das Datum der Nymphose notiert;
- wurden die Nymphen 6 Tage nach der Nymphose entnommen.

c) Kontrolle der transfizierten Insekten

Jedes Individuum wurde einzeln in 1 ml PBS mit 2% Natriumazid zerkleinert. Die Zerkleinerungsgute wurden geklärt, und das Vorhandensein des gewunschten Virus in den Überständen wurde durch das indirekte ELISA-Verfahren unter Verwendung von Anti-Junonia-Densovirus-Antikörpern, die in Mäusen hergestellt worden waren, und Maus-Anti-IgGs, die mit Peroxidase markiert waren, bestimmt. Manche Proben wurden elektronenmikroskopisch kontrolliert.

d) Ergebnisse

Die Transfektion der jungen Spodoptera-littoralis-Larven durch Inokulation mit J-DNA oder pBRJ-DNA in Konzentrationen von 30 ng J-DNA pro Larve und 56 ng pBRJ/Larve führte zu einem Infektionsprozentsatz über 80% in beiden Fällen. Vergleichbare Ergebnisse werden bei Transfektion von Spodoptera littoralis-Larven aus Madagaskar, die deltametrinresistent sind, erhalten.
Desweiteren zeigte sich keine Infektion bei den Kontrollchargen, die entweder mit TE-Extraktionspuffer oder mit pBR322-DNA in einer Konzentration von 30 ng pro 1 g Larve inokuliert worden waren.
Beispiel für eine insektizide Zusammensetzung.
Liposomen auf der Grundlage von:
Phosphatidyl-Cholin... 5 mg
Phosphatidyl-Serin... 5 mg
Cholesterin... 2,5 mg
pRBJ 28... µg
Wasser q.s. auf... 1 ml

Claims

1) Vollständige Sequenz des viralen Genoms des Junonia-Densovirus (J-DNV)

worin X und Z für die Basen A, C, G oder T stehen, n für eine ganze Zahl zwischen 0 und 50, und p zwischen 0 und 130 stehen, wobei diese Zählung die Basen X und Z nicht berücksichtigt, und M für die Basen A oder C steht, und Y für die Basen C oder T steht.

2) Vollständige Sequenz der viralen DNA des Densovirus J- DNV, cloniert entsprechend der Sequenz nach Anspruch 1, worin die zwei Enden "x" und "Z" entfernt sind.

3) Recombinante Plasmide mit der Fähigkeit zur Replikation in Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine vollständige oder teilweise, doppel- oder einzelsträngige DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthalten, welche bei einem empfindlichen lnsekt eine Densovirose hervorrufen.

4) Plasmide nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die vollständige Sequenz des viralen Genoms des Densovirus J-DNV nach Anspruch 2 enthalten.

5) plasmid pBRJ nach Anspruch 4 und dargestellt in Figur 3.

6) Bakterieller Wirt Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein Plasmid nach Anspruch 3 transformiert wurde.

7) Bakterieller Wirt Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein plasmid nach Anspruch 4 transformiert wurde.

8) Bakterieller Wirt Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß er durch das Plasmid pBRJ nach Anspruch 5 transformiert wurde.

9) Verwendung der Plasmide nach Anspruch 3 zur biologischen Bekämpfung von schädigenden Insekten.

10) Verwendung der Plasmide nach Anspruch 4 zur biologischen Bekämpfung von schädigenden Insekten.

11) Verwendung des plasmids pBRJ nach Anspruch 5 zur biologischen Bekämpfung von schädigenden Insekten.

12) Insektizide Formulierungen, enthaltend die Plasmide nach Anspruch 3.

13) Insektizide Formulierungen, enthaltend die Plasmide nach Anspruch 4.

14) Insektizide Formulierungen, enthaltend das plasmid pBRJ nach Anspruch 5.