JPH0124769B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、一般に新規なインフルエンザ・ウイ
ルスの生長反応媒体に関し、及び特に該媒体をイ
ンフルエンザ・ワクチンの製造に使用する方法に
関する。 インフルエンザのワクチンは、1940年代初期以
来人間のワクチン接種に及び1960年代後期以来馬
のワクチン接種に使用されてきた。現在使用され
ているすべてのインフルエンザ・ワクチンは、ワ
クチン用のウイルス種をニワトリの受精卵中で生
長させることによつて製造している。この結果得
られるウイルス種は、生きたウイルスのワクチン
製造に使用され、或いは死亡されたウイルスのワ
クチン（killed virus vaccine）を製造するため
処理される。 ウイルス学者は、一般にインフルエンザ・ウイ
ルスが細胞培養では非常に限られた程度しか生長
しないということを知つている。この生長は“一
段生長サイクル”として言及されるもので、元々
の感染させた細胞だけしかウイルスを再生しな
い。この現象は、例えばデービス（Davis）ら
著、“Microbiology”、ハーバー・アンド・ロウ
出版社（Haper and Row Publishers）、第44
章、1138〜39頁（1968年）に記述されている。
元々の感染させた細胞のウイルスは同一の細胞培
養において連続的に多数の細胞に感染することが
できないから、得られる収量は非常に低すぎてウ
イルス・ワクチンの製造に有用でない。即ち液体
細胞培養（liquid cell cultures）は、インフルエ
ンザ・ウイルスのワクチンの商業的生産に使用さ
れていない。 ニワトリの受精卵は、ワクチンの製造に有用な
ほど十分に高い力価でウイルスを製造するために
使用されている。しかし悪いことに、ニワトリの
卵で生長させたウイルスは、普通濃縮を必要と
し、また人間のワクチンの場合には望ましからぬ
卵の蛋白質による毒性反応を減ずるためにある種
の精製をも必要とする。ワクチンの製造に卵を用
いることは、時間と労力がかかり、原料費が比較
的高く、また一個の卵からの収量が通常凡そ１〜
1.5人の投薬量に等しいワクチンを製造するのに
十分な量にすぎない。即ち億の単位の投薬量に等
しいワクチンを製造するには、億の単位の受精卵
が必要である。 最近、人間、馬、豚及び鳥類を含む多種類のイ
ンフルエンザＡ型ウイルスは、犬の腎臓細胞のイ
スタブリツシユド・ライン（establihed line）に
おいてトリプシンを含有する重量媒体下に生産的
に生長し、且つ過去の継代接種の前歴と関係なく
明確に定義される斑（plaques）を生成するとい
うことが示された。参照、K.トビタ（Tobita）
ら著、“Plaque Assay and Primary Isolation
of Influenza Ａ Viruses in an Establised
line of Canine Kidney Cell（MDCK）in the
Presence of Trypsin”、Med.Microbiol.
Immunol.162、９〜14（1975）；及びハンス−デイ
ター・クレンク（Hans−Dieter Klenk）ら著、
“Activation of Influenza Ａ Virus by
Typsin Treatment”、Virology68、426〜439
（1975）。上述の報文において、トリプシンのイン
フルエンザ・ウイルスの生長反応に及ぼす影響は
斑生成の分析及び分離技術により準固体培養にお
いて観察されるが、それは液体細胞培養或いはワ
クチンを製造するためのインフルエンザ・ウイル
スの大規模な又は商業的な生長反応を暗示してい
ないということを特に記述しておかなければなら
ない。ここに本明細書で用いる液体細胞培養と
は、化学的に定義された液体媒体中における、細
胞の試験内生長及びウイルスの生長反応を意味す
る。 全く驚くことに、今回同一の細胞培養において
連続的に多数の細胞の感染を容易にするために、
蛋白質分解酵素も液体細胞培養に使用できること
が発見された。斯くして過去の液体細胞培養法の
“一段生長サイクル”の限界を克服した結果、プ
ロテアーゼで処理されていない培養法の場合より
も約1000〜10000倍も多いインフルエンザ・ウイ
ルスの収量を達成することができた。この本発明
の方法は、インフルエンザ・ワクチンの商業的生
産に対して、液体細胞培養法を使用すること及び
その結果ニワトリの受精卵の使用に付随する欠点
を回避することを可能にする。本培養媒体、ウイ
ルス生長反応技術、及びワクチンの製造及び使用
法の詳細は本明細書において明らかにされる。 本発明のインフルエンザ・ウイルスの生長反応
媒体は、インフルエンザ・ウイルスを感染せしめ
うる細胞培養体、インフルエンザ・ウイルス、及
び蛋白質加水分解酵素を含んでなる。この酵素の
量はウイルスの一段生長サイクルを克服するのに
十分な量である。本発明のウイルス生長反応技術
は、液体のインフルエンザ・ウイルスの細胞培養
体にインフルエンザ・ウイルスを接種し又は感染
させ、この接種体を、最高のウイルス生長〔又は
最高の細胞変性効果（cytopathic effect）〕を保
証するのに十分な条件下に蛋白質加水分解酵素を
存在させて培養し、及びウイルスを採取する工程
を含んでなる。細胞のウイルスによる感染は、細
胞の単層が生成する前に又は後に、或いは他に細
胞の液体懸濁液を単に感染させることにより行な
われる。本発明のワクチンは、採取されたウイル
スを死亡させる工程、或いは該ウイルスをワクチ
ンに用いるために更なる細胞培養継代接種（cell
culture passge）を行なつて弱体化させる後続の
工程も含む。特に好適な具体例は種々のインフル
エンザ・ウイルスを生長させるためにプロテアー
ゼ・トリプシンを犬の腎臓の細胞ライン（cell
line）と一緒に使用することを含む。 第１〜５図は、図に示したウイルス種を種々の
量の代表的なプロテアーゼ、即ちトリプシンの存
在下に液体細胞培養で培養する場合に達成される
力価の増加を示す棒グラフである。結果は幾何平
均の力価として報告されている。 本明細書で開示されるインフルエンザ・ウイル
ス及びワクチン製造技術は、インフルエンザ・ウ
イルスのワクチンの使用法を意図している。本明
細書で用いる如きインフルエンザ・ウイルスと
は、呼吸器症候、粘膜の炎症及びしばしば全身的
な連累症で示される動物（人間を含む）の熱性の
病状を引き起こしうるウイルスを含む。本開示の
媒体及び方法は、人間、馬、豚、及び鳥類を含め
て、種々のインフルエンザ・ウイルスの製造に特
に有用である。代表的なＡ型及びＢ型インフルエ
ンザ・ウイルスの製造例は下記の通りである。 本開示の意図するワクチン調製剤は、インフル
エンザによる病気に対して免疫性を付与し或いは
それを人為的に増加させるために投与することの
できる死亡させた、生きているが弱体化した又は
完全に生きていて発病力のあるインフルエンザ・
ウイルスの調製剤を包含する。好適な具体例にお
いて、ワクチンは、そのまま使用できる形のウイ
ルス粒子の水性懸濁液を含む。 本発明の本質を遂行する際に有用であると考え
られる細胞培養は、一種又はそれ以上のインフル
エンザ・ウイルス株で感染することができそして
該ウイルス種を再生することのできる、動物の細
胞ライン又は細胞株を含む。多くのそのような細
胞は公知でありそして本明細書に開示されている
技法に有用であると考えられるけれど、カツター
研究所の犬の腎臓（Cutter Laboratories Dog
Kidney）（CLDK）の細胞ラインとして知られる
既定の細胞ラインを用いる場合に特に良好な結果
が得られる。CLDK細胞ラインは、米国農業局に
より獣類のワクチンの製造に使用しうることが証
明されており、及びメイデイン・ダーバイ・ドツ
グ（Madin Darby Dog）の腎臓の細胞ライン
（ATCC No.CCL34）及びA.ブラウン（Brown）
による米国特許第3616203号に記述されている犬
の腎臓の細胞ラインに類似している。実施例の細
胞ラインに使用されるマスター細胞原料
（master cell stock）の短期間の履歴及び記述は
後述する通りである。本明細書に開示される技術
はインフルエンザ・ウイルスに感染させる細胞培
養に関して有用であることを理解すべきである。 カツター研究所の犬の腎臓（CLDK）の細胞ラ
イン 履 歴 カリフオルニア州バークレー市のカツター研究
所において、デービス市のカリフオルニア大学か
ら手に入れた見かけ上正常のビーグル犬の腎臓か
らCLDKの親ライン（parent line）を得、これ
を保有した。このラインを、アールズ・バランス
ド塩溶液（Earle′s balanced salt solution）中
0.5％ラクトアルブミン加水分解物及び0.2％イー
スト抽出物、及び５％の子牛、ヒツジ又は馬の血
清及び抗生物質と一緒に保ち、J.S.ヤンガー
（Younger）の方法によつて培養した（Proc.of.
Exp.Biol.、and Med.、v85、202）。 続いての細胞ラインの142番目の継代接種
（passage）を凍結したアンプルを、75cm2（250
ml）のフアルコン・フラスコ中において、アール
ズ・バランスド塩溶液の最小必須媒体（MEM）
及び10％の牛の胎児の血清のなる組織培養媒体に
植えつけた。細胞を同一の方法及び媒体で二次培
養して凍結したマスター細胞原料を148番目の継
代接種で製造した。 マスター細胞原料のアンプルを解凍し、植えつ
け、及び連続的に20回二次培養して168番目の継
代接種のピン培養（bottle culture）を行なつた。
次いでこれらの細胞を凍結した。 マスター細胞原料（MCS）の記述 元の組織からの連続二次培養の数：148回 凍結媒体：減少させたビカーボネート（1.65mg／
）80％；牛の胎児の血清10％；ジメチルスル
ホキシド10％を含むアルーズBSS中最小必須媒
体（Eagle）。 生存能力：約75％（染料排除）。 培養媒体：減少させたビカーボネート（1.65mg／
）90％；牛の胎児の血清２〜10％；抗生物質
ペニシリン及びストレプトマイシン100Uすな
わちγ／ml。 解凍細胞の生長特性：密閉系中、37℃において上
記培養媒体中で培養した３×106の生育しうる
細胞／mlの接種ウイルスは５日間で約６〜８倍
に増加した。 形態：上皮様。 細胞核：染色体の頻数分布100個の細胞：2N＝
72。 細 胞：１ １ ２ ４ ６ ９ 69 ５
３ 細 胞：１ １ ２ ４ ６ ９ 69 ５
３ ―――――――――――――――――――――――――
――― 細 胞：１ １ ２ ４ ６ ９ 69 ５
３ ―――――――――――――――――――――――――
――― 染色体：60 65 68 69 70 71 72
73 74 ノー・マーカ染色体（no marker
chromosomes） 殺菌試験：ミコプラズマ、バクテリヤ及び菌を含
まない。 種：免疫螢光試験により犬の種として確認。 ウイルス感染性：インフルエンザ・ウイルス、狂
犬病ウイルス、感染性の牛の鼻性気管支炎、感
染性の犬の肝炎、犬のジステンパー・ウイルス
及び可能ならば他のウイルスに感染。 本発明の開示の目的に有用であると考えられる
蛋白質加水分解酵素（蛋白質分解酵素又はプロテ
アーゼ）は、十分公知のプロテアーゼ例えばトリ
プシン、キモトリプシン、ペブシン、パンクレア
チン、パパイン、プロナーゼ、カルボキシペプチ
ダーゼなどを含み、トリプシンが特に好適な酵素
である。トリプシンの如きプロテアーゼがインフ
ルエンザ・ウイルスの感染性を高める正確な機構
は十分に公知でない。一つの可能な機構は、クレ
ンクらによる上述の刊行物に提案されている。 以下に述べるように、連続的な感染性を高める
ために必要とされる活性プロテアーゼの量は、一
段階生長サイクルの限界を克服するのに少くとも
十分であるが、但し融合した単層培養の場合には
組織培養容器の表面（即ちローラービンの内表
面）から融合した細胞を腐肉形成させる程多くな
い量であるべきである。以下の実施例で用いる酵
素の場合、酵素の量は液体組織培養媒体１ml当り
約４〜25μｇ、好ましくは約10μｇ／mlであるこ
とが好適である。 ウイルスの生長反応法 本開示のインフルエンザ・ウイルスの生長反応
法は、液体細胞培養の細胞の一部をインフルエン
ザ・ウイルスで感染させ、この細胞を最高細胞変
性（CP）効果を保証するのに十分な条件下に且
つ蛋白質分解酵素を存在させて培養し、及びウイ
ルスを培養体から採取する一般的な３工程を含ん
でなる。ワクチン調製法は、生きて活性のある、
弱体化した、又は死亡させた（不活性化した）ワ
クチンの製造に対して公知の方法によつて採取し
たウイルスを改変する後続の工程を含む。本ワク
チンは、稀釈剤と混合しうる乾燥形で、又はその
まま使用できる液体形で存在していてよい。適当
な助剤は、後述する如く免疫遺伝性を高めるため
に含有せしめてもよい。 プロテアーゼは、水性懸濁液細胞培養体に、或
いは一体化した（confluent）単層培養体の形成
前に又は後に添加することができる。種々の生長
反応法のいくつかの例は下記の通りである。 方法Ａ−前形成単層の感染 １ 技術的に公知の細胞培養生長媒体を用いるこ
とにより、細胞を生長させて培養容器例えばロ
ーラービン（roller bottles）、ポビツキー・フ
ラスコ（Povitsky flask）、又はルクス・ビン
（Roux bottles）中で一体化するまで成長させ
る。 ２ 感染前に、細胞単層から生長媒体を除去す
る。 ３ インフルエンザ・ウイルスの原種を、更なる
ビタミン、必須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミ
ン、デキストローズ及び抗生物質を含有し且つ
PHを6.6〜6.8に調節した生長媒体に薄める。 ４ ウイルスを含有する稀釈剤のある量を、最終
的な採取量の10〜100％の量で細胞単層に添加
する。 ５ 感染した単層を１〜72時間34〜37℃で培養す
る。 ６ プロテアーゼを、単独で又はウイルス生長反
応媒体と組合せて、細胞の腐肉形成をもたらさ
ずに多段生長サイクルを刺激するであろう濃度
で添加する。トリプシンに対しては、この最適
の濃度は約８〜15μｇ／mlである。 ７ ウイルスの生長容器を、最高細胞変性効果が
観察されるまで、再び34〜37℃で培養する。こ
の時点で、ウイルス流体を採取する。 ８ 採取は容器を激しく振とうして細胞を除去し
及び更に処理するために流体及び細胞を殺菌し
た容器に移すことを含む。 方法Ｂ−単層形成前の液体細胞懸濁液の感染 １ 通常の方法を用いることにより、細胞を生長
容器から取り出す。 ２ 細胞を遠心分離で濃縮し、次いで更なるビタ
ミン、必須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミン、
デキストローズ及び抗生物質を含有する新しい
生長媒体のある量に再び懸濁させる。 ３ 次いでこの濃縮した細胞懸濁液にインフルエ
ンザ・ウイルスを添加する。 ４ 細胞ウイルス懸濁液を、殺菌した密閉容器
（例えばスクリユー・キヤツプ付きエルレンマ
イヤー・フラスコ）中において、磁器撹拌機又
は回転振とう機で10分間〜４時間混合しながら
培養する（25〜37℃）。 ５ 細胞ウイルス懸濁液の一部分を、Ｂ−２で示
す成分及び５％の牛の胎児の血清を含有する媒
体の全容量と一緒に、生長容器（ローラービ
ン、ルクス・ビン、ポビツキー・フラスコ）中
に入れる。 ６ この生長容器を、融合した単層が形成される
まで（約２〜４日間）34〜37℃で培養する。 ７ 単層が形成された後、細胞の腐肉形成を生じ
させずに多段サイクル生長を刺激するであろう
濃度でプロテアーゼを添加する。 ８ この生長容器を、最高の細胞変性効果が観察
されるまで34〜37℃で培養する。次いでウイル
スを採取する。 ９ 採取は、容器を激しく振とうして細胞を除去
し、次いで更に処理するために細胞と流体を殺
菌した容器に移すことを含む。 方法Ｃ−液体懸濁液培養の感染 １ 懸濁液培養に適した細胞を、懸濁液生長容器
中の生長媒体において、最適数で生長させる。 ２ 細胞を遠心分離にかけ、更なるビタミン、必
須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミン、デキスト
ローズ及び抗生物質を含有するある量の新しい
媒体に再び懸濁させる。 ３ 次いでインフルエンザ・ウイルスを添加し、
培養体を10分〜数時間34〜37℃に保温する。 ４ 子牛の胎児の血清を添加してもよく、この培
養懸濁液を更に１〜７時間34〜37℃に保温す
る。 ５ プロテアーゼを、細胞に致命的な影響を与え
ずに多段生長サイクルを可能にするであろう濃
度で添加する。トリプシンの場合、最適な濃度
は４〜25μｇ／mlである。 ６ 34〜37℃での培養を、最高細胞変性効果が観
察されるまで継続し、この時点で流体を採取す
る。 ７ 採取は更なる処理のために流体を殺菌した容
器中に移すことを含む。 本発明のインフルエンザ・ウイルスの選択され
た種の生長反応に対する技術及び媒体を用いる実
施例は後述の通りである。この場合、断らない限
り公知の通常の組織培養法を使用する。細胞及び
媒体の調製技術の双方は十分公知であるから、本
明細書において詳細に記述しない。 実施例 １ マイアミ株と言われるA2型の馬のインフルエ
ンザ・ウイルスをマイアミ大学の馬から原ウイル
スとして分離した。本ウイルスはニワトリの受精
卵で６回継代接種したもので、ペンシルバニヤ医
科大学から入手したものであつた。次いで７回目
の継代接種をレダール研究所（Lederle
Laboratories）で行ない、それを手に入れた。こ
の株を更にニワトリの受精卵で継代接種し、11〜
16回目の継代接種に使用した。 A2型の組織培養による生長反応の現在の好適
な方法は、CLDK細胞の若い融合単層を感染させ
る方法である。細胞は、次の成分を含有するハン
ク（Hank）の最小必須媒体（MEMH）を用い
ることによりローラービンroller bottle）中に植
えつけられる： 牛の胎児の血清、10ml／ 必須でないアミノ酸、10ml／（Gibco） Ｌ−グルタミン、10ml／（Gibco） ネオマイシンサルフエート、30000mcg／ ポリミキシンＢ、30000単位／ ミコスタチン、25000単位／ 細胞は普通72時間で一体化する。この時点で媒
体を流去し、細胞を感染させる。接種する媒体
は、次の成分を補充したMEMHで約103.0／mlの
エツグ・インフエクテイブ・ドーズ50（Egg
Infective Dose50）（EID50）の力価まで薄められ
たA2型ウイルスを含有する： 50％デキストローズ、2.6ml／ MEMビタミン、30ml／（Gibco） 必須でないアミノ酸、10ml／（Gibco） Ｌ−グルタミン、10ml／（Gibco） ネオマイシンサルフエート、30000mcg／ ポリミキシンＢ、30000単位／ ミコスタチン、25000単位／ 最終容量の14％に相当する接種媒体を各ローラ
ービンに添加し、これらの容器を72時間34〜35℃
に保温する。この時点で、殺菌したトリプシン
（シグマ、１：250）溶液（0.1ｇ／100ml）12μ
ｇ／mlを含む残りの媒体（86％）を各ローラービ
ンに添加する。次いで容器を最高細胞変性効果が
観察されるまで（48〜72時間）再び34〜35℃に保
温し、続いて流体を採取する。この採取に際して
は、各ローラービンを激しく振とうして付着した
細胞を除き、次いで更なる処理を行行なうために
細胞とウイルス流体を殺菌したバツチ容器に移
す。 この技法を用いて生長させたA2型インフルエ
ンザ・ウイルスの採取EID50力価を第１表に示
す。更に第１図も参照のこと。比較例はトリプシ
ンを添加せずに同一の方法で生長させたA2型ウ
イルスを用いて行なつたものである。
ルスの生長反応媒体に関し、及び特に該媒体をイ
ンフルエンザ・ワクチンの製造に使用する方法に
関する。 インフルエンザのワクチンは、1940年代初期以
来人間のワクチン接種に及び1960年代後期以来馬
のワクチン接種に使用されてきた。現在使用され
ているすべてのインフルエンザ・ワクチンは、ワ
クチン用のウイルス種をニワトリの受精卵中で生
長させることによつて製造している。この結果得
られるウイルス種は、生きたウイルスのワクチン
製造に使用され、或いは死亡されたウイルスのワ
クチン（killed virus vaccine）を製造するため
処理される。 ウイルス学者は、一般にインフルエンザ・ウイ
ルスが細胞培養では非常に限られた程度しか生長
しないということを知つている。この生長は“一
段生長サイクル”として言及されるもので、元々
の感染させた細胞だけしかウイルスを再生しな
い。この現象は、例えばデービス（Davis）ら
著、“Microbiology”、ハーバー・アンド・ロウ
出版社（Haper and Row Publishers）、第44
章、1138〜39頁（1968年）に記述されている。
元々の感染させた細胞のウイルスは同一の細胞培
養において連続的に多数の細胞に感染することが
できないから、得られる収量は非常に低すぎてウ
イルス・ワクチンの製造に有用でない。即ち液体
細胞培養（liquid cell cultures）は、インフルエ
ンザ・ウイルスのワクチンの商業的生産に使用さ
れていない。 ニワトリの受精卵は、ワクチンの製造に有用な
ほど十分に高い力価でウイルスを製造するために
使用されている。しかし悪いことに、ニワトリの
卵で生長させたウイルスは、普通濃縮を必要と
し、また人間のワクチンの場合には望ましからぬ
卵の蛋白質による毒性反応を減ずるためにある種
の精製をも必要とする。ワクチンの製造に卵を用
いることは、時間と労力がかかり、原料費が比較
的高く、また一個の卵からの収量が通常凡そ１〜
1.5人の投薬量に等しいワクチンを製造するのに
十分な量にすぎない。即ち億の単位の投薬量に等
しいワクチンを製造するには、億の単位の受精卵
が必要である。 最近、人間、馬、豚及び鳥類を含む多種類のイ
ンフルエンザＡ型ウイルスは、犬の腎臓細胞のイ
スタブリツシユド・ライン（establihed line）に
おいてトリプシンを含有する重量媒体下に生産的
に生長し、且つ過去の継代接種の前歴と関係なく
明確に定義される斑（plaques）を生成するとい
うことが示された。参照、K.トビタ（Tobita）
ら著、“Plaque Assay and Primary Isolation
of Influenza Ａ Viruses in an Establised
line of Canine Kidney Cell（MDCK）in the
Presence of Trypsin”、Med.Microbiol.
Immunol.162、９〜14（1975）；及びハンス−デイ
ター・クレンク（Hans−Dieter Klenk）ら著、
“Activation of Influenza Ａ Virus by
Typsin Treatment”、Virology68、426〜439
（1975）。上述の報文において、トリプシンのイン
フルエンザ・ウイルスの生長反応に及ぼす影響は
斑生成の分析及び分離技術により準固体培養にお
いて観察されるが、それは液体細胞培養或いはワ
クチンを製造するためのインフルエンザ・ウイル
スの大規模な又は商業的な生長反応を暗示してい
ないということを特に記述しておかなければなら
ない。ここに本明細書で用いる液体細胞培養と
は、化学的に定義された液体媒体中における、細
胞の試験内生長及びウイルスの生長反応を意味す
る。 全く驚くことに、今回同一の細胞培養において
連続的に多数の細胞の感染を容易にするために、
蛋白質分解酵素も液体細胞培養に使用できること
が発見された。斯くして過去の液体細胞培養法の
“一段生長サイクル”の限界を克服した結果、プ
ロテアーゼで処理されていない培養法の場合より
も約1000〜10000倍も多いインフルエンザ・ウイ
ルスの収量を達成することができた。この本発明
の方法は、インフルエンザ・ワクチンの商業的生
産に対して、液体細胞培養法を使用すること及び
その結果ニワトリの受精卵の使用に付随する欠点
を回避することを可能にする。本培養媒体、ウイ
ルス生長反応技術、及びワクチンの製造及び使用
法の詳細は本明細書において明らかにされる。 本発明のインフルエンザ・ウイルスの生長反応
媒体は、インフルエンザ・ウイルスを感染せしめ
うる細胞培養体、インフルエンザ・ウイルス、及
び蛋白質加水分解酵素を含んでなる。この酵素の
量はウイルスの一段生長サイクルを克服するのに
十分な量である。本発明のウイルス生長反応技術
は、液体のインフルエンザ・ウイルスの細胞培養
体にインフルエンザ・ウイルスを接種し又は感染
させ、この接種体を、最高のウイルス生長〔又は
最高の細胞変性効果（cytopathic effect）〕を保
証するのに十分な条件下に蛋白質加水分解酵素を
存在させて培養し、及びウイルスを採取する工程
を含んでなる。細胞のウイルスによる感染は、細
胞の単層が生成する前に又は後に、或いは他に細
胞の液体懸濁液を単に感染させることにより行な
われる。本発明のワクチンは、採取されたウイル
スを死亡させる工程、或いは該ウイルスをワクチ
ンに用いるために更なる細胞培養継代接種（cell
culture passge）を行なつて弱体化させる後続の
工程も含む。特に好適な具体例は種々のインフル
エンザ・ウイルスを生長させるためにプロテアー
ゼ・トリプシンを犬の腎臓の細胞ライン（cell
line）と一緒に使用することを含む。 第１〜５図は、図に示したウイルス種を種々の
量の代表的なプロテアーゼ、即ちトリプシンの存
在下に液体細胞培養で培養する場合に達成される
力価の増加を示す棒グラフである。結果は幾何平
均の力価として報告されている。 本明細書で開示されるインフルエンザ・ウイル
ス及びワクチン製造技術は、インフルエンザ・ウ
イルスのワクチンの使用法を意図している。本明
細書で用いる如きインフルエンザ・ウイルスと
は、呼吸器症候、粘膜の炎症及びしばしば全身的
な連累症で示される動物（人間を含む）の熱性の
病状を引き起こしうるウイルスを含む。本開示の
媒体及び方法は、人間、馬、豚、及び鳥類を含め
て、種々のインフルエンザ・ウイルスの製造に特
に有用である。代表的なＡ型及びＢ型インフルエ
ンザ・ウイルスの製造例は下記の通りである。 本開示の意図するワクチン調製剤は、インフル
エンザによる病気に対して免疫性を付与し或いは
それを人為的に増加させるために投与することの
できる死亡させた、生きているが弱体化した又は
完全に生きていて発病力のあるインフルエンザ・
ウイルスの調製剤を包含する。好適な具体例にお
いて、ワクチンは、そのまま使用できる形のウイ
ルス粒子の水性懸濁液を含む。 本発明の本質を遂行する際に有用であると考え
られる細胞培養は、一種又はそれ以上のインフル
エンザ・ウイルス株で感染することができそして
該ウイルス種を再生することのできる、動物の細
胞ライン又は細胞株を含む。多くのそのような細
胞は公知でありそして本明細書に開示されている
技法に有用であると考えられるけれど、カツター
研究所の犬の腎臓（Cutter Laboratories Dog
Kidney）（CLDK）の細胞ラインとして知られる
既定の細胞ラインを用いる場合に特に良好な結果
が得られる。CLDK細胞ラインは、米国農業局に
より獣類のワクチンの製造に使用しうることが証
明されており、及びメイデイン・ダーバイ・ドツ
グ（Madin Darby Dog）の腎臓の細胞ライン
（ATCC No.CCL34）及びA.ブラウン（Brown）
による米国特許第3616203号に記述されている犬
の腎臓の細胞ラインに類似している。実施例の細
胞ラインに使用されるマスター細胞原料
（master cell stock）の短期間の履歴及び記述は
後述する通りである。本明細書に開示される技術
はインフルエンザ・ウイルスに感染させる細胞培
養に関して有用であることを理解すべきである。 カツター研究所の犬の腎臓（CLDK）の細胞ラ
イン 履 歴 カリフオルニア州バークレー市のカツター研究
所において、デービス市のカリフオルニア大学か
ら手に入れた見かけ上正常のビーグル犬の腎臓か
らCLDKの親ライン（parent line）を得、これ
を保有した。このラインを、アールズ・バランス
ド塩溶液（Earle′s balanced salt solution）中
0.5％ラクトアルブミン加水分解物及び0.2％イー
スト抽出物、及び５％の子牛、ヒツジ又は馬の血
清及び抗生物質と一緒に保ち、J.S.ヤンガー
（Younger）の方法によつて培養した（Proc.of.
Exp.Biol.、and Med.、v85、202）。 続いての細胞ラインの142番目の継代接種
（passage）を凍結したアンプルを、75cm2（250
ml）のフアルコン・フラスコ中において、アール
ズ・バランスド塩溶液の最小必須媒体（MEM）
及び10％の牛の胎児の血清のなる組織培養媒体に
植えつけた。細胞を同一の方法及び媒体で二次培
養して凍結したマスター細胞原料を148番目の継
代接種で製造した。 マスター細胞原料のアンプルを解凍し、植えつ
け、及び連続的に20回二次培養して168番目の継
代接種のピン培養（bottle culture）を行なつた。
次いでこれらの細胞を凍結した。 マスター細胞原料（MCS）の記述 元の組織からの連続二次培養の数：148回 凍結媒体：減少させたビカーボネート（1.65mg／
）80％；牛の胎児の血清10％；ジメチルスル
ホキシド10％を含むアルーズBSS中最小必須媒
体（Eagle）。 生存能力：約75％（染料排除）。 培養媒体：減少させたビカーボネート（1.65mg／
）90％；牛の胎児の血清２〜10％；抗生物質
ペニシリン及びストレプトマイシン100Uすな
わちγ／ml。 解凍細胞の生長特性：密閉系中、37℃において上
記培養媒体中で培養した３×106の生育しうる
細胞／mlの接種ウイルスは５日間で約６〜８倍
に増加した。 形態：上皮様。 細胞核：染色体の頻数分布100個の細胞：2N＝
72。 細 胞：１ １ ２ ４ ６ ９ 69 ５
３ 細 胞：１ １ ２ ４ ６ ９ 69 ５
３ ―――――――――――――――――――――――――
――― 細 胞：１ １ ２ ４ ６ ９ 69 ５
３ ―――――――――――――――――――――――――
――― 染色体：60 65 68 69 70 71 72
73 74 ノー・マーカ染色体（no marker
chromosomes） 殺菌試験：ミコプラズマ、バクテリヤ及び菌を含
まない。 種：免疫螢光試験により犬の種として確認。 ウイルス感染性：インフルエンザ・ウイルス、狂
犬病ウイルス、感染性の牛の鼻性気管支炎、感
染性の犬の肝炎、犬のジステンパー・ウイルス
及び可能ならば他のウイルスに感染。 本発明の開示の目的に有用であると考えられる
蛋白質加水分解酵素（蛋白質分解酵素又はプロテ
アーゼ）は、十分公知のプロテアーゼ例えばトリ
プシン、キモトリプシン、ペブシン、パンクレア
チン、パパイン、プロナーゼ、カルボキシペプチ
ダーゼなどを含み、トリプシンが特に好適な酵素
である。トリプシンの如きプロテアーゼがインフ
ルエンザ・ウイルスの感染性を高める正確な機構
は十分に公知でない。一つの可能な機構は、クレ
ンクらによる上述の刊行物に提案されている。 以下に述べるように、連続的な感染性を高める
ために必要とされる活性プロテアーゼの量は、一
段階生長サイクルの限界を克服するのに少くとも
十分であるが、但し融合した単層培養の場合には
組織培養容器の表面（即ちローラービンの内表
面）から融合した細胞を腐肉形成させる程多くな
い量であるべきである。以下の実施例で用いる酵
素の場合、酵素の量は液体組織培養媒体１ml当り
約４〜25μｇ、好ましくは約10μｇ／mlであるこ
とが好適である。 ウイルスの生長反応法 本開示のインフルエンザ・ウイルスの生長反応
法は、液体細胞培養の細胞の一部をインフルエン
ザ・ウイルスで感染させ、この細胞を最高細胞変
性（CP）効果を保証するのに十分な条件下に且
つ蛋白質分解酵素を存在させて培養し、及びウイ
ルスを培養体から採取する一般的な３工程を含ん
でなる。ワクチン調製法は、生きて活性のある、
弱体化した、又は死亡させた（不活性化した）ワ
クチンの製造に対して公知の方法によつて採取し
たウイルスを改変する後続の工程を含む。本ワク
チンは、稀釈剤と混合しうる乾燥形で、又はその
まま使用できる液体形で存在していてよい。適当
な助剤は、後述する如く免疫遺伝性を高めるため
に含有せしめてもよい。 プロテアーゼは、水性懸濁液細胞培養体に、或
いは一体化した（confluent）単層培養体の形成
前に又は後に添加することができる。種々の生長
反応法のいくつかの例は下記の通りである。 方法Ａ−前形成単層の感染 １ 技術的に公知の細胞培養生長媒体を用いるこ
とにより、細胞を生長させて培養容器例えばロ
ーラービン（roller bottles）、ポビツキー・フ
ラスコ（Povitsky flask）、又はルクス・ビン
（Roux bottles）中で一体化するまで成長させ
る。 ２ 感染前に、細胞単層から生長媒体を除去す
る。 ３ インフルエンザ・ウイルスの原種を、更なる
ビタミン、必須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミ
ン、デキストローズ及び抗生物質を含有し且つ
PHを6.6〜6.8に調節した生長媒体に薄める。 ４ ウイルスを含有する稀釈剤のある量を、最終
的な採取量の10〜100％の量で細胞単層に添加
する。 ５ 感染した単層を１〜72時間34〜37℃で培養す
る。 ６ プロテアーゼを、単独で又はウイルス生長反
応媒体と組合せて、細胞の腐肉形成をもたらさ
ずに多段生長サイクルを刺激するであろう濃度
で添加する。トリプシンに対しては、この最適
の濃度は約８〜15μｇ／mlである。 ７ ウイルスの生長容器を、最高細胞変性効果が
観察されるまで、再び34〜37℃で培養する。こ
の時点で、ウイルス流体を採取する。 ８ 採取は容器を激しく振とうして細胞を除去し
及び更に処理するために流体及び細胞を殺菌し
た容器に移すことを含む。 方法Ｂ−単層形成前の液体細胞懸濁液の感染 １ 通常の方法を用いることにより、細胞を生長
容器から取り出す。 ２ 細胞を遠心分離で濃縮し、次いで更なるビタ
ミン、必須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミン、
デキストローズ及び抗生物質を含有する新しい
生長媒体のある量に再び懸濁させる。 ３ 次いでこの濃縮した細胞懸濁液にインフルエ
ンザ・ウイルスを添加する。 ４ 細胞ウイルス懸濁液を、殺菌した密閉容器
（例えばスクリユー・キヤツプ付きエルレンマ
イヤー・フラスコ）中において、磁器撹拌機又
は回転振とう機で10分間〜４時間混合しながら
培養する（25〜37℃）。 ５ 細胞ウイルス懸濁液の一部分を、Ｂ−２で示
す成分及び５％の牛の胎児の血清を含有する媒
体の全容量と一緒に、生長容器（ローラービ
ン、ルクス・ビン、ポビツキー・フラスコ）中
に入れる。 ６ この生長容器を、融合した単層が形成される
まで（約２〜４日間）34〜37℃で培養する。 ７ 単層が形成された後、細胞の腐肉形成を生じ
させずに多段サイクル生長を刺激するであろう
濃度でプロテアーゼを添加する。 ８ この生長容器を、最高の細胞変性効果が観察
されるまで34〜37℃で培養する。次いでウイル
スを採取する。 ９ 採取は、容器を激しく振とうして細胞を除去
し、次いで更に処理するために細胞と流体を殺
菌した容器に移すことを含む。 方法Ｃ−液体懸濁液培養の感染 １ 懸濁液培養に適した細胞を、懸濁液生長容器
中の生長媒体において、最適数で生長させる。 ２ 細胞を遠心分離にかけ、更なるビタミン、必
須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミン、デキスト
ローズ及び抗生物質を含有するある量の新しい
媒体に再び懸濁させる。 ３ 次いでインフルエンザ・ウイルスを添加し、
培養体を10分〜数時間34〜37℃に保温する。 ４ 子牛の胎児の血清を添加してもよく、この培
養懸濁液を更に１〜７時間34〜37℃に保温す
る。 ５ プロテアーゼを、細胞に致命的な影響を与え
ずに多段生長サイクルを可能にするであろう濃
度で添加する。トリプシンの場合、最適な濃度
は４〜25μｇ／mlである。 ６ 34〜37℃での培養を、最高細胞変性効果が観
察されるまで継続し、この時点で流体を採取す
る。 ７ 採取は更なる処理のために流体を殺菌した容
器中に移すことを含む。 本発明のインフルエンザ・ウイルスの選択され
た種の生長反応に対する技術及び媒体を用いる実
施例は後述の通りである。この場合、断らない限
り公知の通常の組織培養法を使用する。細胞及び
媒体の調製技術の双方は十分公知であるから、本
明細書において詳細に記述しない。 実施例 １ マイアミ株と言われるA2型の馬のインフルエ
ンザ・ウイルスをマイアミ大学の馬から原ウイル
スとして分離した。本ウイルスはニワトリの受精
卵で６回継代接種したもので、ペンシルバニヤ医
科大学から入手したものであつた。次いで７回目
の継代接種をレダール研究所（Lederle
Laboratories）で行ない、それを手に入れた。こ
の株を更にニワトリの受精卵で継代接種し、11〜
16回目の継代接種に使用した。 A2型の組織培養による生長反応の現在の好適
な方法は、CLDK細胞の若い融合単層を感染させ
る方法である。細胞は、次の成分を含有するハン
ク（Hank）の最小必須媒体（MEMH）を用い
ることによりローラービンroller bottle）中に植
えつけられる： 牛の胎児の血清、10ml／ 必須でないアミノ酸、10ml／（Gibco） Ｌ−グルタミン、10ml／（Gibco） ネオマイシンサルフエート、30000mcg／ ポリミキシンＢ、30000単位／ ミコスタチン、25000単位／ 細胞は普通72時間で一体化する。この時点で媒
体を流去し、細胞を感染させる。接種する媒体
は、次の成分を補充したMEMHで約103.0／mlの
エツグ・インフエクテイブ・ドーズ50（Egg
Infective Dose50）（EID50）の力価まで薄められ
たA2型ウイルスを含有する： 50％デキストローズ、2.6ml／ MEMビタミン、30ml／（Gibco） 必須でないアミノ酸、10ml／（Gibco） Ｌ−グルタミン、10ml／（Gibco） ネオマイシンサルフエート、30000mcg／ ポリミキシンＢ、30000単位／ ミコスタチン、25000単位／ 最終容量の14％に相当する接種媒体を各ローラ
ービンに添加し、これらの容器を72時間34〜35℃
に保温する。この時点で、殺菌したトリプシン
（シグマ、１：250）溶液（0.1ｇ／100ml）12μ
ｇ／mlを含む残りの媒体（86％）を各ローラービ
ンに添加する。次いで容器を最高細胞変性効果が
観察されるまで（48〜72時間）再び34〜35℃に保
温し、続いて流体を採取する。この採取に際して
は、各ローラービンを激しく振とうして付着した
細胞を除き、次いで更なる処理を行行なうために
細胞とウイルス流体を殺菌したバツチ容器に移
す。 この技法を用いて生長させたA2型インフルエ
ンザ・ウイルスの採取EID50力価を第１表に示
す。更に第１図も参照のこと。比較例はトリプシ
ンを添加せずに同一の方法で生長させたA2型ウ
イルスを用いて行なつたものである。
【表】
【表】
. .
15 10３ １ 10８ ９
501
生長媒体中にトリプシンを導入すると、マイア
ミ株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾何平均
で3.2対数倍すなわち1711倍増加した。 実施例 ２ 発病力のあるA1型の馬のインフルエンザ・ウ
イルスの試料をペンシルバニヤ医科大学から得
た。ペンシルバニヤ（A1型）と言われる種は、
馬から分離し、ニワトリの受精卵で６回継代接種
したものであつた。この株を更にニワトリの受精
卵での継代接種に供し、継代接種12〜17回目にお
いて組織培養に使用した。 A1型種の組織培養による生長反応の好適な方
法では、CLDK細胞の懸濁液を単層の形成前に感
染させる。次いで下記の成分を補充したハンクの
最小必須媒体（MEMH）中EID50力価103.0／ml
〜105.0／mlのペンシルバニヤ株ウイルス約105.5／
mlの濃度において、CLDK細胞を、密閉した殺菌
済みのエルレンマイヤーフラスコ中、磁気撹拌機
で混合しながら25℃以下に培養する。２〜３時間
の培養期間中PHを1NHClで6.7〜6.8に維持する。 補充されたMEMH 50％デキストローズ、2.6ml／ MEMビタミン、30ml／（Gibco） 必須でないアミノ酸、10ml／（Gibco） Ｌ−グルタミン、10ml／（Gibco） ネオマイシンサルフエート、30000meq／ ポリミキシンＢ、30000単位／ ミコスタチン、25000単位／ この懸濁液の接種後、上述の如く補充した
MEMH1を含有し及び５％の牛の胎児の血清
を含有するローラービンに、細胞ウイルス懸濁液
10ml画分を添加する。このローラービンを、単層
が一体化する（confluent）まで（約48〜72時間）
34〜35℃に保温し、次いで殺菌した１mg／mlのト
リプシン溶液（シグマ１：250）20mlを各ローラ
ービンに添加する。続いてローラービンを最高の
シトバシツク効果が観察されるまで（３〜５日
間）35〜35℃に保温する。各ローラービンを激し
く振とうして付着したまま残つている細胞を除去
し、更なる処理のために細胞と流体を殺菌した容
器に移すことによつてビールス流体を採取する。 この技法を用いることによつて生長させたA1
型インフルエンザ・ウイルスの採取EID50力価を
第２表に示す。更に第２図も参照のこと。比較例
はトリプシンを除外して同一の方法により生長さ
せたA1型ウイルスを用いて行なつたものである。
15 10３ １ 10８ ９
501
生長媒体中にトリプシンを導入すると、マイア
ミ株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾何平均
で3.2対数倍すなわち1711倍増加した。 実施例 ２ 発病力のあるA1型の馬のインフルエンザ・ウ
イルスの試料をペンシルバニヤ医科大学から得
た。ペンシルバニヤ（A1型）と言われる種は、
馬から分離し、ニワトリの受精卵で６回継代接種
したものであつた。この株を更にニワトリの受精
卵での継代接種に供し、継代接種12〜17回目にお
いて組織培養に使用した。 A1型種の組織培養による生長反応の好適な方
法では、CLDK細胞の懸濁液を単層の形成前に感
染させる。次いで下記の成分を補充したハンクの
最小必須媒体（MEMH）中EID50力価103.0／ml
〜105.0／mlのペンシルバニヤ株ウイルス約105.5／
mlの濃度において、CLDK細胞を、密閉した殺菌
済みのエルレンマイヤーフラスコ中、磁気撹拌機
で混合しながら25℃以下に培養する。２〜３時間
の培養期間中PHを1NHClで6.7〜6.8に維持する。 補充されたMEMH 50％デキストローズ、2.6ml／ MEMビタミン、30ml／（Gibco） 必須でないアミノ酸、10ml／（Gibco） Ｌ−グルタミン、10ml／（Gibco） ネオマイシンサルフエート、30000meq／ ポリミキシンＢ、30000単位／ ミコスタチン、25000単位／ この懸濁液の接種後、上述の如く補充した
MEMH1を含有し及び５％の牛の胎児の血清
を含有するローラービンに、細胞ウイルス懸濁液
10ml画分を添加する。このローラービンを、単層
が一体化する（confluent）まで（約48〜72時間）
34〜35℃に保温し、次いで殺菌した１mg／mlのト
リプシン溶液（シグマ１：250）20mlを各ローラ
ービンに添加する。続いてローラービンを最高の
シトバシツク効果が観察されるまで（３〜５日
間）35〜35℃に保温する。各ローラービンを激し
く振とうして付着したまま残つている細胞を除去
し、更なる処理のために細胞と流体を殺菌した容
器に移すことによつてビールス流体を採取する。 この技法を用いることによつて生長させたA1
型インフルエンザ・ウイルスの採取EID50力価を
第２表に示す。更に第２図も参照のこと。比較例
はトリプシンを除外して同一の方法により生長さ
せたA1型ウイルスを用いて行なつたものである。
【表】
. .
20 10３ ２ 10８ ２ 31
6
生長媒体中にトリプシンを導入すると、ペンシ
ルバニヤ株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾
何平均で2.3対数倍すなわち187倍増加した。 実施例 ３ Ｂ型／ホンコン／５／72（BX−１）と言われ
る人間のインフルエンザ・ウイルス株をジヨージ
ア州アトランタ市のザ・センター・フオー・デイ
ジーズ・コントローラ（The Center for
Disease Control）から得た。これをニワトリの
受精卵で一回継代接種し、原種ウイルスとして−
70℃で凍結した。 Ｂ型／ホンコン／５／72種の組織培養の生長反
応に対する好適な方法は、実施例１と同様に
CLDK細胞の若い融合した単層を感染させること
からなる。細胞は実施例１に記述したように生長
せしめる。生長媒体を細胞から除去し、捨てる。
次いでこの細胞に、実施例１に示した接種媒体で
約103.0〜5.0／mlのEID50力価まで薄めたウイルスを
感応させる。この接種は最終採取容量の33.3％に
等しい容量からなる。容器を40〜48時間34〜35℃
に保温し、続いてトリプシン溶液（0.1ｇ／100
ml）12μｇ／mlを含有する残りの媒体（66.7％）
を各容器に添加する。次いで最高細胞変性効果が
観察されるまで（48〜72時間）34〜35℃での培養
を継続し、この時点でウイルス流体を採取する。
この採取は、各容器を激しく振とうして細胞を除
去し及び更に処理するために細胞及び流体を殺菌
した容器に移すことを含む。 この技法を用いて生長させたＢ型／ホンコン／
５／72のインフルエンザ・ウイルスの採取EID50
力価を第３表に示す。更に第３図も参照のこと。
比較例は、トリプシンを使用せずに同一の方法で
生長させた種を用いて行なつたものである。
20 10３ ２ 10８ ２ 31
6
生長媒体中にトリプシンを導入すると、ペンシ
ルバニヤ株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾
何平均で2.3対数倍すなわち187倍増加した。 実施例 ３ Ｂ型／ホンコン／５／72（BX−１）と言われ
る人間のインフルエンザ・ウイルス株をジヨージ
ア州アトランタ市のザ・センター・フオー・デイ
ジーズ・コントローラ（The Center for
Disease Control）から得た。これをニワトリの
受精卵で一回継代接種し、原種ウイルスとして−
70℃で凍結した。 Ｂ型／ホンコン／５／72種の組織培養の生長反
応に対する好適な方法は、実施例１と同様に
CLDK細胞の若い融合した単層を感染させること
からなる。細胞は実施例１に記述したように生長
せしめる。生長媒体を細胞から除去し、捨てる。
次いでこの細胞に、実施例１に示した接種媒体で
約103.0〜5.0／mlのEID50力価まで薄めたウイルスを
感応させる。この接種は最終採取容量の33.3％に
等しい容量からなる。容器を40〜48時間34〜35℃
に保温し、続いてトリプシン溶液（0.1ｇ／100
ml）12μｇ／mlを含有する残りの媒体（66.7％）
を各容器に添加する。次いで最高細胞変性効果が
観察されるまで（48〜72時間）34〜35℃での培養
を継続し、この時点でウイルス流体を採取する。
この採取は、各容器を激しく振とうして細胞を除
去し及び更に処理するために細胞及び流体を殺菌
した容器に移すことを含む。 この技法を用いて生長させたＢ型／ホンコン／
５／72のインフルエンザ・ウイルスの採取EID50
力価を第３表に示す。更に第３図も参照のこと。
比較例は、トリプシンを使用せずに同一の方法で
生長させた種を用いて行なつたものである。
【表】
. .
８ 10３ ５ ＞10１０ ２ ＞10
000
生長媒体中にトリプシンを導入すると、Ｂ型／
ホンコン株の生長反応中にウイルス粒子が幾何平
均で3.1対数倍すなわち1412倍増加した。 実施例 ４ Ａ型／テキサス／１／77と言われる人間のイン
フルエンザ・ウイルス株をジヨージア州アトラン
タ市のザ・センター・フオー・デイジーズ・コン
トロールから得た。これをニワトリの受精卵で一
度継代接種し、原種ウイルスとして−70℃で凍結
した。 Ａ型／テキサス／１／77の組織培養による生長
反応の好適な方法は、総合的に実施例３に記述さ
れているものである。 この技法を用いて生長させたＡ型／テキサス／
１／77の人間のインフルエンザ・ウイルスの採取
EID50力価を第４表に示す。更に第４図も参照の
こと。比較例は、トリプシンを添加せずに同一の
方法で生長させた株を用いて行なつたものであ
る。
８ 10３ ５ ＞10１０ ２ ＞10
000
生長媒体中にトリプシンを導入すると、Ｂ型／
ホンコン株の生長反応中にウイルス粒子が幾何平
均で3.1対数倍すなわち1412倍増加した。 実施例 ４ Ａ型／テキサス／１／77と言われる人間のイン
フルエンザ・ウイルス株をジヨージア州アトラン
タ市のザ・センター・フオー・デイジーズ・コン
トロールから得た。これをニワトリの受精卵で一
度継代接種し、原種ウイルスとして−70℃で凍結
した。 Ａ型／テキサス／１／77の組織培養による生長
反応の好適な方法は、総合的に実施例３に記述さ
れているものである。 この技法を用いて生長させたＡ型／テキサス／
１／77の人間のインフルエンザ・ウイルスの採取
EID50力価を第４表に示す。更に第４図も参照の
こと。比較例は、トリプシンを添加せずに同一の
方法で生長させた株を用いて行なつたものであ
る。
【表】
. .
8 10４ １ ＞10１０ ２ ＞100
000
. .
10 10３ ０ 10８ ３
1259
. .
10 10２ ０ 10９ ８ 39
811
生長媒体にトリプシンを導入すると、Ａ型／テ
キサス株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾何
平均で4.1対数倍すなわち12590倍増加した。 実施例 ５ Ａ型／USSR／90／77と言われる人間のインフ
ルエンザ・ウイルス株をジヨージア州アトランタ
市のザ・センター・フオー・デイジーズ・コント
ロールから得た。これをニワトリの受精卵で一回
継代接種し、原種ウイルスとして−70℃で凍結し
た。 Ａ型／USSR／90／77株の組織培養による生長
反応の好適な方法は、総合的に実施例３に記述し
た通りである。 この技法を用いて生長させたＡ型／USSR／
90／70の人間のインフルエンザ・ウイルスの採取
EID50力価を第５表に示す。更に第５図も参照の
こと。比較例は、トリプシンを添加せずに同一の
方法で生長させた株を用いて行なつたものであ
る。
8 10４ １ ＞10１０ ２ ＞100
000
. .
10 10３ ０ 10８ ３
1259
. .
10 10２ ０ 10９ ８ 39
811
生長媒体にトリプシンを導入すると、Ａ型／テ
キサス株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾何
平均で4.1対数倍すなわち12590倍増加した。 実施例 ５ Ａ型／USSR／90／77と言われる人間のインフ
ルエンザ・ウイルス株をジヨージア州アトランタ
市のザ・センター・フオー・デイジーズ・コント
ロールから得た。これをニワトリの受精卵で一回
継代接種し、原種ウイルスとして−70℃で凍結し
た。 Ａ型／USSR／90／77株の組織培養による生長
反応の好適な方法は、総合的に実施例３に記述し
た通りである。 この技法を用いて生長させたＡ型／USSR／
90／70の人間のインフルエンザ・ウイルスの採取
EID50力価を第５表に示す。更に第５図も参照の
こと。比較例は、トリプシンを添加せずに同一の
方法で生長させた株を用いて行なつたものであ
る。
【表】
. .
10 10４ ０ 10９ ０ 501
. .
10 10４ ５ 10８ ４ 126
生長媒体にトリプシンを導入すると、Ａ型／
USSR株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾何
平均で2.4対数倍すなわち251倍増加した。 ワクチンの調製 実施例 ６ ウイルスの弱体化 実施例１の採取した流体からのウイルスの弱体
化は、化学的に、或いは終末稀薄継代接種法
（terminal dilution passage technique）を含む
標準的な連続継代接種により、即ち免疫遺伝を失
なわせずにウイルスを発病菌でなくならしめるま
で十分な回数の継代接種を感染性の細胞培養で行
なう方法により、達成される。これらの方法で調
製したワクチンは、通常発病要因による臨床的的
な微候を重大な程度まで誘発することなしに、病
気に感染しやすい動物の免疫応答を刺激するであ
ろう。生長反応はその前継代接種に用いたものと
同一の又は異なる組織で行なうことができる。 実施例 ７ ウイルスの不活性化 採取したウイルス流体を0.1％濃度（0.05〜0.2
％範囲）のホルムアルデヒドで不活性化すること
によつて更に処理し及びこの処理した物質を10〜
14日間４℃で培養する以外実施例１及び２に記述
した技法に従つた。最終的に不活性化されたウイ
ルス調製剤を試験すると、これは生きたウイルス
を含まないことがわかる。この場合、技術的に公
知の助剤、例えば水酸化アルミニウム、ミヨウバ
ン、燐酸アルミニウム、フロインズ
（Freund′s）、又は米国特許第3790665号及び第
3919411号に記述されているものも添加できる。
本ワクチンに使用される好適な助剤は、上記特許
に記述されているものと同様に、ポリアリールサ
ツカライド（Carbopol934p）で架橋されたアク
リル酸重合体である。 実施例 ８ 不活性ウイルスのワクチンの調製と使用法 馬の投薬剤1.0mlはペンシルバニヤ（A1）株
0.45ml、マイアミ（A2）株0.45ml及びCarbopol
助剤0.10mlからなる。実施例７から得た不活性化
ワクチン種同一部を混合し、筋肉内投与により１
ml画分を19頭の馬に投与する。ワクチン投与後、
どの馬にもインフルエンザの臨床的な病気又は微
候は認められなかつた。馬のインフルエンザA1
型及びA2型の双方に対する抗体力価を、ワクチ
ン接種の２、４及び８周間後に、すべての動物の
血清に対して測定した。これらの結果を、ヘマグ
ルチネーシヨン禁止試験（haemagglutination
inhibition test）〔参照、Diagnostic Procedures
for Viral and Rickettsial Infectins、第４版；
レンネツト（Lennette）及びシユミツト
（Schmidt）著、665〜66頁（1969）、Ameican
Public Health Association N.Y.、N.Y.10019〕
を用いることにより、接種前の値と比較する（第
６表）。
10 10４ ０ 10９ ０ 501
. .
10 10４ ５ 10８ ４ 126
生長媒体にトリプシンを導入すると、Ａ型／
USSR株の生長反応中にウイルス粒子／mlは幾何
平均で2.4対数倍すなわち251倍増加した。 ワクチンの調製 実施例 ６ ウイルスの弱体化 実施例１の採取した流体からのウイルスの弱体
化は、化学的に、或いは終末稀薄継代接種法
（terminal dilution passage technique）を含む
標準的な連続継代接種により、即ち免疫遺伝を失
なわせずにウイルスを発病菌でなくならしめるま
で十分な回数の継代接種を感染性の細胞培養で行
なう方法により、達成される。これらの方法で調
製したワクチンは、通常発病要因による臨床的的
な微候を重大な程度まで誘発することなしに、病
気に感染しやすい動物の免疫応答を刺激するであ
ろう。生長反応はその前継代接種に用いたものと
同一の又は異なる組織で行なうことができる。 実施例 ７ ウイルスの不活性化 採取したウイルス流体を0.1％濃度（0.05〜0.2
％範囲）のホルムアルデヒドで不活性化すること
によつて更に処理し及びこの処理した物質を10〜
14日間４℃で培養する以外実施例１及び２に記述
した技法に従つた。最終的に不活性化されたウイ
ルス調製剤を試験すると、これは生きたウイルス
を含まないことがわかる。この場合、技術的に公
知の助剤、例えば水酸化アルミニウム、ミヨウバ
ン、燐酸アルミニウム、フロインズ
（Freund′s）、又は米国特許第3790665号及び第
3919411号に記述されているものも添加できる。
本ワクチンに使用される好適な助剤は、上記特許
に記述されているものと同様に、ポリアリールサ
ツカライド（Carbopol934p）で架橋されたアク
リル酸重合体である。 実施例 ８ 不活性ウイルスのワクチンの調製と使用法 馬の投薬剤1.0mlはペンシルバニヤ（A1）株
0.45ml、マイアミ（A2）株0.45ml及びCarbopol
助剤0.10mlからなる。実施例７から得た不活性化
ワクチン種同一部を混合し、筋肉内投与により１
ml画分を19頭の馬に投与する。ワクチン投与後、
どの馬にもインフルエンザの臨床的な病気又は微
候は認められなかつた。馬のインフルエンザA1
型及びA2型の双方に対する抗体力価を、ワクチ
ン接種の２、４及び８周間後に、すべての動物の
血清に対して測定した。これらの結果を、ヘマグ
ルチネーシヨン禁止試験（haemagglutination
inhibition test）〔参照、Diagnostic Procedures
for Viral and Rickettsial Infectins、第４版；
レンネツト（Lennette）及びシユミツト
（Schmidt）著、665〜66頁（1969）、Ameican
Public Health Association N.Y.、N.Y.10019〕
を用いることにより、接種前の値と比較する（第
６表）。
【表】
第６表から理解できるように、接種を受けた馬
の場合両ウイルス抗原に対して抗体が発現した。
これらのワクチン接種は、馬のインフルエンザに
対して免疫となるであろう。その理由は、米国農
業局の国立獣類サービス研究所（National
Veterinary Services Laboratories）により、
A2に対して１：20及びA1に対して１：60の過剰
の抗体力価がインフルエンザの予防となる値とし
て認められているからである。 種々の品種及び年令の420頭の馬に対して臨床
的に試行した結果、本ワクチンは安全であり、筋
肉内接種後副作用がなかつた。 実施例 ９ 弱体化したウイルス・ワクチンの使用法 実施例６の生きているが弱体化した馬のインフ
ルエンザA2型ワクチン株５mlを３頭の馬に鼻孔
から投与した。ワクチン接種後、いずれの馬にも
インフルエンザの臨床的な病気又は微候は認めら
れなかつた。ワクチン種に対する抗体の力価を、
接種から１、２及び４周間後にすべての動物の血
清に対して測定し、標準的なヘマグルチネーシヨ
ン禁止試験（HAI）を用いることにより接種前
の値と比較する。
の場合両ウイルス抗原に対して抗体が発現した。
これらのワクチン接種は、馬のインフルエンザに
対して免疫となるであろう。その理由は、米国農
業局の国立獣類サービス研究所（National
Veterinary Services Laboratories）により、
A2に対して１：20及びA1に対して１：60の過剰
の抗体力価がインフルエンザの予防となる値とし
て認められているからである。 種々の品種及び年令の420頭の馬に対して臨床
的に試行した結果、本ワクチンは安全であり、筋
肉内接種後副作用がなかつた。 実施例 ９ 弱体化したウイルス・ワクチンの使用法 実施例６の生きているが弱体化した馬のインフ
ルエンザA2型ワクチン株５mlを３頭の馬に鼻孔
から投与した。ワクチン接種後、いずれの馬にも
インフルエンザの臨床的な病気又は微候は認めら
れなかつた。ワクチン種に対する抗体の力価を、
接種から１、２及び４周間後にすべての動物の血
清に対して測定し、標準的なヘマグルチネーシヨ
ン禁止試験（HAI）を用いることにより接種前
の値と比較する。
【表】
この場合にも、得られた抗体力価は、予防に必
要とされるものよりも大きい。 本発明の開示は、新規なインフルエンザの培養
系及び新規なインフルエンザ・ワクチンを製造す
るための媒体の使用法に関するものであることを
強調しなければならない。本発明で用いる液体細
胞培養系は、感染性の細胞、インフルエンザ・ウ
イルス、栄養媒体及び蛋白質分解酵素を使用する
ものであるが、過去の系（例えばトビタ等の参考
文献参照）と違つて系を準固体状態に変える寒天
の使用を必要としない。即ち寒天を使用しないか
ら、通常の公知の技法における大規なウイルスの
製造が可能となり、ワクチンの製造に十分高い力
価のウイルス流体が製造される。 インフルエンザ・ワクチンの調製剤自体は、与
えられたインフルエンザ・ウイルス粒子１種又は
それ以上及び製薬学的に許容しうる担体を有効量
で含有する。全同製剤は、好ましくは水性形で、
実質的に卵の蛋白質のような反応性蛋白質を含ま
ない。本明細書に用いる如き“実質的に卵の蛋白
質を含まない”とは、ワクチン調製剤中の唯一の
存在する卵蛋白質源が原種ウイルス液に含まれて
いたもので、それが＞１：100000に薄められた蛋
白質であるということを意味する。 本ワクチンは、種々の方法、即ち筋肉内、静脈
内、皮下、気官支内、鼻孔内、投与を含む方法に
より、或いはエーロゾル・スプレーにより動物に
投与される。また本ワクチンは、人間、馬、豚及
び鳥類を含む種々の動物に対する有益な用途が意
図されている。 本発明によつて製造されるウイルスの調製剤
は、その能力を調節するために水で稀釈すること
ができ、及びシユークローズ、デキストローズ、
ラクトース、又は他の無毒性物質のような安定剤
が添加されていてもよい。ウイルス調製剤は、貯
蔵の目的のために又は続く弱体化したワクチンへ
処方する目的のために凍結乾燥によつて脱水する
ことができ、或いは死亡したウイルスのワクチン
を製造するために化学的に不活性化させてもよ
い。 上述の実施例は単なる例示であり、及び本開示
の範囲は特許請求の範囲によつて限定されるだけ
であるということを理解すべきである。
要とされるものよりも大きい。 本発明の開示は、新規なインフルエンザの培養
系及び新規なインフルエンザ・ワクチンを製造す
るための媒体の使用法に関するものであることを
強調しなければならない。本発明で用いる液体細
胞培養系は、感染性の細胞、インフルエンザ・ウ
イルス、栄養媒体及び蛋白質分解酵素を使用する
ものであるが、過去の系（例えばトビタ等の参考
文献参照）と違つて系を準固体状態に変える寒天
の使用を必要としない。即ち寒天を使用しないか
ら、通常の公知の技法における大規なウイルスの
製造が可能となり、ワクチンの製造に十分高い力
価のウイルス流体が製造される。 インフルエンザ・ワクチンの調製剤自体は、与
えられたインフルエンザ・ウイルス粒子１種又は
それ以上及び製薬学的に許容しうる担体を有効量
で含有する。全同製剤は、好ましくは水性形で、
実質的に卵の蛋白質のような反応性蛋白質を含ま
ない。本明細書に用いる如き“実質的に卵の蛋白
質を含まない”とは、ワクチン調製剤中の唯一の
存在する卵蛋白質源が原種ウイルス液に含まれて
いたもので、それが＞１：100000に薄められた蛋
白質であるということを意味する。 本ワクチンは、種々の方法、即ち筋肉内、静脈
内、皮下、気官支内、鼻孔内、投与を含む方法に
より、或いはエーロゾル・スプレーにより動物に
投与される。また本ワクチンは、人間、馬、豚及
び鳥類を含む種々の動物に対する有益な用途が意
図されている。 本発明によつて製造されるウイルスの調製剤
は、その能力を調節するために水で稀釈すること
ができ、及びシユークローズ、デキストローズ、
ラクトース、又は他の無毒性物質のような安定剤
が添加されていてもよい。ウイルス調製剤は、貯
蔵の目的のために又は続く弱体化したワクチンへ
処方する目的のために凍結乾燥によつて脱水する
ことができ、或いは死亡したウイルスのワクチン
を製造するために化学的に不活性化させてもよ
い。 上述の実施例は単なる例示であり、及び本開示
の範囲は特許請求の範囲によつて限定されるだけ
であるということを理解すべきである。
第１〜５図は、図示したウイルス種を、種々の
量のトリプシンの存在下に液体細胞培養で培養す
る場合に達成される力価の増加を示す棒グラフで
ある。
量のトリプシンの存在下に液体細胞培養で培養す
る場合に達成される力価の増加を示す棒グラフで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞がインフルエンザウイルスで感染され、
ウイルスが該細胞中で増やされ、次いでウイルス
が単離されそして単離されたウイルスからワクチ
ンが製造されることによつて、実質的に卵アルブ
ミンを含有しないインフルエンザウイルスワクチ
ンを製造する方法であつて、 液体細胞培養物の細胞の一部分をインフルエン
ザウイルスで感染せしめそして感染された培養物
を、液体細胞培養物１ml当り４〜25μｇの蛋白質
分解酵素の存在下で培養することを特徴とする方
法。 ２ 蛋白質分解酵素として、トリプシン、キモト
リプシン、ペプシン、パンクレアチン、パパイ
ン、プロナーゼ又はカルボキシペプチダーゼが用
いられる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 培養が動く培養容器中で実施される特許請求
の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４ 蛋白質分解酵素が予め感染せしめられた培養
物に対して添加される特許請求の範囲第１項又は
第３項に記載の方法。 ５ 蛋白質分解酵素としてペプシンが液体細胞培
養物に対して８〜15μｇ／mlの量で添加され、そ
して培養が回転フラスコ中で実施される特許請求
の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ６ ウイルスとして馬インフルエンザウイルス又
はヒトインフルエンザウイルスが使用される特許
請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。 ７ 液体細胞培養物中の細胞として、犬腎臓細胞
が使用される特許請求の範囲第１〜６項のいずれ
かに記載の方法。 ８ 液体細胞培養物の細胞の一部分をインフルエ
ンザウイルスで感染せしめそして感染された培養
物を、液体細胞培養物１ml当り４〜25μｇの蛋白
質分解酵素の存在下で培養し、インフルエンザウ
イルス粒子を収穫し、弱体化するか又は死亡させ
そして薬学的に許容しうる担体と一緒にされる方
法によつて製造されたことを特徴とする、実質的
に卵アルブミンを含有しないインフルエンザワク
チン調製物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3923679A | 1979-05-15 | 1979-05-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55153723A JPS55153723A (en) | 1980-11-29 |
| JPH0124769B2 true JPH0124769B2 (ja) | 1989-05-15 |
Family
ID=21904398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6235780A Granted JPS55153723A (en) | 1979-05-15 | 1980-05-13 | Manufacture of influenza virus vaccine in liquid cell culture |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0019218B2 (ja) |
| JP (1) | JPS55153723A (ja) |
| AR (1) | AR220838A1 (ja) |
| AT (1) | ATE16454T1 (ja) |
| AU (1) | AU535804B2 (ja) |
| CA (1) | CA1122527A (ja) |
| DE (1) | DE3071225D1 (ja) |
| DK (1) | DK154749C (ja) |
| ES (1) | ES8104405A1 (ja) |
| IL (1) | IL60063A0 (ja) |
| NO (1) | NO801443L (ja) |
| RO (1) | RO79525B (ja) |
| YU (1) | YU41923B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5753489A (en) * | 1994-11-10 | 1998-05-19 | Immuno Ag | Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture |
| US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
| JP3158157B2 (ja) * | 1994-11-10 | 2001-04-23 | バクスター・アクチエンゲゼルシャフト | 無蛋白培養における生物製剤の製造法 |
| US5698433A (en) * | 1994-11-10 | 1997-12-16 | Immuno Ag | Method for producing influenza virus and vaccine |
| WO1996015232A1 (en) * | 1994-11-16 | 1996-05-23 | St. Jude Children's Research Hospital | Novel replication process |
| DE19612966B4 (de) | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| DE19612967A1 (de) * | 1996-04-01 | 1997-10-02 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren |
| DE10144906B4 (de) | 2001-09-12 | 2013-11-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh | Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen |
| US6830917B2 (en) | 2001-12-10 | 2004-12-14 | Baxter Healthcare S.A. | Method of isolation and purification of trypsin from pronase protease and use thereof |
| AU2005314563B2 (en) | 2004-11-03 | 2011-06-30 | Seqirus UK Limited | Influenza vaccination |
| EP2022849A4 (en) | 2006-05-11 | 2010-10-06 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | METHOD FOR PROLIFERATION OF INFLUENZA VIRUS |
| US8506966B2 (en) | 2008-02-22 | 2013-08-13 | Novartis Ag | Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use |
| TW201012930A (en) * | 2008-06-16 | 2010-04-01 | Intervet Int Bv | Method of replicating viruses in suspension |
| CN102307590A (zh) | 2009-02-10 | 2012-01-04 | 诺华有限公司 | 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2262962B1 (ja) * | 1974-03-05 | 1977-11-04 | Science Union & Cie |
-
1980
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- 1980-04-30 AR AR280860A patent/AR220838A1/es active
- 1980-05-08 DE DE8080102525T patent/DE3071225D1/de not_active Expired
- 1980-05-08 AT AT80102525T patent/ATE16454T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-05-08 EP EP80102525A patent/EP0019218B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1980-05-09 AU AU58244/80A patent/AU535804B2/en not_active Expired
- 1980-05-13 JP JP6235780A patent/JPS55153723A/ja active Granted
- 1980-05-13 IL IL60063A patent/IL60063A0/xx unknown
- 1980-05-13 YU YU1265/80A patent/YU41923B/xx unknown
- 1980-05-13 RO RO101109A patent/RO79525B/ro unknown
- 1980-05-14 NO NO801443A patent/NO801443L/no unknown
- 1980-05-14 DK DK212580A patent/DK154749C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-05-14 ES ES491517A patent/ES8104405A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0019218A3 (en) | 1981-03-25 |
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| DK154749C (da) | 1989-05-16 |
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