KR830002615B1 - 세포배양액내에서 인플루엔자 왁진의 제조방법 - Google Patents

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Description

세포배양액내에서 인플루엔자 왁진의 제조방법

도면 1-5는 비루스 균주를 세포배양액내에서 전형적인 프로테아제, 트립신 존재하에 배양시켰을 때 나타나는 역가(titer)의 증가를 막대그라프로 표시한 것. 결과는 기하평균 역가로 표시.

본 발명은 인플루엔자 비루스 왁진을 제조하는 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 왁진은 일찌기 1940년대 이후로 인간의 예방접종에 사용되어 왔으며 1960년대 후반기부터 말의 예방접종에도 사용되어 왔다. 최근 사용되는 모든 인플루엔자 왁진은 왁진 비루스 균주를 미성숙한 계란에서 성장시킴으로써 만들어졌다. 생성된 비루스 균주는 살아있는 비루스 왁진을 만드는데 사용될 뿐만 아니라 죽은 비루스 왁진을 만드는데도 사용된다.

인플루엔자 비루스는 세포배양액내에서 제한된 한계까지 성장한다. 이 성장을 "일단계 성장 사이클(one step growth cycle)"라고 부르며 이는 초기 감염된 세포만이 비루스를 복제(replicate)한다는 것을 의미한다. 이 현상은 다음 참고문헌에 기술되어 있다[참조 : 데비스등의 "Microbiology", Harper and Row Fublishers, Chapter 44, pp.1138-39(1968)]. 초기 감염된 세포의 비루스는 같은 세포 배양액내에서 다른 세포들을 연속적으로 감염시킬 수 없으므로 생성된 수율이 너무 낮아 비루스 왁진을 제조하는데 유용하지 못하다. 따라서 세포배양액은 인플루엔자 시판용 비루스 왁진의 제조에 사용할 수 없다.

미성숙 계란은 왁진을 제조하는데 유효한 충분량의 적정량으로 비루스를 얻는데 사용한다. 유감스럽게도, 미성숙 계란에서 성장한 비루스는 보통 농도를 필요로 하며 인간에게 투여하는 왁진의 경우, 불필요한 계란 단백질로 인한 독성 반응물을 감소시키기 위해 정제하여야 한다. 왁진을 제조하는데 있어서, 계란의 사용은 시간과 노력이 소모되고 비교적 많은 비용이 들며 한개의 계란을부터 얻어지는 수율은 1 내지 1.5회 투여하기에 적합한 왁진을 제조할 수 있을 뿐이다. 따라서 수만회 투여에 필요한 왁진을 얻기 위해서는 수만개의 무해한 미성숙 계란이 필요하다. 최근, 사람, 말, 돼지 및 닭의 균주로 이루어진 여러 종류의 인플루엔자 A는 트립신을 함유한 중층배지(overlay medium)하에 개의 콩팥의 주화 세포계(established cell line)내에서 성장하며 선행기술과 관계없이 명확한 플라그(plaque)를 형성한다[참조 : K. Tobita등이 저술한 문헌 "Plaque Assay and Primary Isdation of Influenza A viruses in an Eastablished Line of Canine kidney cella(MDCK) in the presenec of Trypsin", Med. Microbiol Immunol 162, 9-14(1975), 및 Hans-Dieter Klenk 등이 저술한 문헌 " Activation of Influenza A Viruses by Trypsin Treatment", Virology 68, 426-439(1975)].

상기 문헌에서 인플루엔자 비루스 번식에 있어 트립신의 효과는 반고체 배양물내에서 플라그 형성분석 및 유리방법으로 관찰할 수 있으나 이 방법중 어느 것도 세포배양액 또는 왁진제에 필요한 인플루엔자 비루스의 번식과 관계가 없다. 여기서 세포배양액이란 세포의 생체의 성장 및 화학적으로 정의된 액체매체내에서의 비루스의 번식을 말한다.

놀랍게도, 우리는 같은 세포배양에서 세포의 감염을 용이하게 하기 위해서 단백질 분해효소를 세포배양액에 사용할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 선행의 세포배양액 방법인 "일단계 성장 사이클"의 한계를 극복함으로써 인플루엔자 비루스 수율을 프로테아제로 처리되지 않은 배양액보다 1,000 내지 10,000배로 성취할 수 있게 되었다. 이것은 통상적인 인플루엔자 왁진을 제조하는데 세포배양액 방법을 사용가능하게 함으로써 미성숙 계란을 사용할 때 생기는 단점을 막아준다.

인플루엔자 비루스 번식배지는 인플루엔자 비루스로 감염될 수 있는 세포배양물, 인플루엔자 비루스, 단백질 가수분해 효소로 이루어지며 효소의 양은 비루스 일단계 성장 사이클을 극복하기에 충분한 양으로 한다. 비루스의 번식방법은 인플루엔자 비루스로 접종시키거나 감염시킨 후 접종물을 최고의 비루스 성장(또는 최고의 세포변성효과)에 충분한 조건하 단백질 가수분해 효소 존재하에서 배양시킨 후 비루스를 수득하는 단계적인 방법을 채택한다. 세포가 비루스로 감염되는 것은 단층세포 형성전후에 일어나거나 다른 방법으로 세포의 현탁액을 간단히 감염시킨다. 본 발명의 왁진 제조방법은 연이은 방법으로서 얻어진 비루스를 죽이거나 또는 왁진에 사용하기 위해 세포배양 통로를 좋게 한다. 특히 바람직한 실예에서는 여러 종류의 인플루엔자 비루스를 번식시키기 위해 개 신장의 세포계와 함께 프로테아제 트립신을 사용한다.

상술한 인플루엔자 비루스 및 왁진 제조방법은 인플루엔자 왁진 비루스의 사용을 기대한 것이다. 여기서 인플루엔자 비루스는 동물(사람 포함)에게 있어서 열병, 호흡계 질병, 점막의 염증 및 전신 연루등을 일으키는 비루스를 포함한다. 본 발명의 배지 및 방법은 사람, 말, 돼지 및 개의 균주를 포함하는 여러 종류의 인플루엔자 비루스를 제조하는데 특히 유용하다. 전형적인 인플루엔자 비루스 A 및 B형의 제조실시예를 하기에 기술하였다.

본 발명의 왁진 제조방법은 투여하여 생산될 수 있거나 인공적으로 인플루엔자 질병에 대한 면역성을 증가시킬 수 있는 죽은, 살기가 희박한 또는 완전히 살아있는 악성 인플루엔자 비루스의 제조방법을 포함한다. 바람직한 실례에서 왁진은 사용시 비루스 입자의 수성 현탁액으로 이루어진다.

본 발명의 원리를 수행하기 유효한 세포배양은 하나 또는 그 이상의 주어진 인플루엔자 비루스 균주에 감염될 수 있는 세포계 또는 세포균주를 함유한다. 많은 세포가 기지의 것이고 또 이것이 상술한 기술에 특히 유용하다고 생각되지만 우리는 " Cutter Laboratories Dog kidney(CLDK) cell line"이라고 불리우는 세포계로써 좋은 결과를 얻었다. 이 CLDK 세포계는 미합중국 농무성에 의해 수의의 왁진을 제조하는데 사용된다는 것이 입증되었다. 또 이 세포계는 "Madin Darby Dog kidney cell line(ATCC No. CLL 34) 및 미합중국특허 제3,616,203호에 기술된 dog kidney Cell line과 유사하다.

Cutter Laboratories Dog kidney(CLDK) cell line의 역사

CDLK의 모계(parent line)은 데이비스 소재의 캘리포니아 대학에서 얻은 평범한 사냉개의 신장을 사용하여 Cutter Laboratories, Inc.에서 시작하여 완성하였다. 이 계(line)는 0.5% 락트알부민 가수분해물, 얼스 평형염용액(Earle's balanced salt Solution) 내의 0.2% 효모추출물, 5% 송아지, 양 또는 말의 혈청 및 항생물질로 유지되며[J.S. Younger(Proc. of. Exp. Biol 및 Med., V 85, 202)].에 기술된 방법으로 배항한다.

이 세포계의 142개 통로의 동결된 앰플을 75㎠(250ml)의 팔콘 플라스크, 얼스 평형 염용액 최소 필수배지[(Minimun Essential Medium(MEM)] 및 10% 미성숙 소의 혈청으로 이루어진 조직배양배지에 놓는다. 세포를 같은 방법, 같은 배지를 사용하여 배양하여 통로 148에서 동결된 마스터 주세포계(Master cell stock)를 얻는다.

마스터 세포계의 앰플을 녹이고, 장치한 후 20회 배양하여 168번 통로의 보틀 배양물(bottle culture)을 얻는다. 이 세포들을 다시 동결시킨다.

마스터 세포계(MCS)에 대한 설명

원조직으로부터 재대배양의 수 : 148

동결배지 : 감소된 비카보네이트(1.65gm/L) 80%와 함께 얼스 BSS 내의 최소 필수배지(Eagle) 미성숙소의 혈청 10% ; 디메틸 설폭사이드 10%

생존율 : 약 75%(염색제외)

배양배지 : 감소된 비키보네이트(1.65gm/L) 90%와 함께 얼스 BSS 내의 최소 필수배지(Eagle) 미성숙소의 혈청 2 내지 10% ; 항생물질 페니실린 및 스트립토마이신 100U 또는 r/ml.

해빙된 세포의 성장 특징 : 밀폐개 내, 37℃에서 상기 배양배지내에서 배양된 3×10⁶생존가능한 세포/ml의 접종원은 5일 내에 6 내지 8배로 늘어난다.

형태학 : 상피류

핵학 : 염색체 분포 100 세포

2N=72

염색체의 현저한 차이는 없음.

멸균도 시험 : 미코플라스마, 박테리아 및 진균이 없음.

종 : 면역 형광시험으로 개로 확인

비루스 감수성 : 인플루엔자 비루스, 광견병 비루스, 감염된 소외 리노트라케이티스, 감염된 개의 힙타티티스, 개의 디스템퍼 비루스 및 다른 비루스에 감염되기 쉬움.

단백질 분해효소(또는 프로테아제)에는 트립신, 키모트립신, 펩신, 판그레아틴, 팝페인, 프로나제 카복시 펩티다제 등과 같은 프로테아제가 있으며 이중 트립신이 가장 바람직한 효소이다. 트립신 같은 프로테아제가 인플루엔자 비루스 전염성을 증강시키는 정확한 기전은 완전히 알려져 있지 않다. 가능한 기전중 하나는 상기의 클렌크 등에 의한 문헌에 기술되어 있다. 바람직한 전염성을 증강수키는데 필요한 활성프로테아제의 양은 일단계 성장 사이클의 한계점을 극복하기에 충분한 양이어야 하나 융합성의 단층 배양일 경우 융합성 세포가 조직배양용기의 표면(즉 로울러 보틀의 내부표면)으로부터 슬러깅될 만큼 많지는 않아야 된다. 후기 실시예에서 사용된 특수 효소의 경우 효소의 양은 액체조직배양배지 ml(㎍/ml)당 4 내지 25㎍, 바람직한게는 10㎍/ml이다.

[비루스 번식 방법]

본 발명의 인플루엔자 비루스 번식방법은 세포배양액중의 세포를 인플루엔자 비루스로 감염시키고 최대변성(maximun cytopathic(cp)) 효과를 얻기에 충분한 조건하에 단백질 분해 효소 존재하에서 세포를 배양시킨 후 배양물로부터 비루스를 얻는 세단계 방법이다. 왁진은 희석제와 혼합하기 쉬운 건조형태나 또는 사용시의 형태인 액체형태가 유용하다. 적합한 보조제는 면역유전성을 증가시키기에 알맞은 것들이다.

프로테아제는 융합성 단층 배양형성 전이나 후에 세포 배양 수성현탁액에 가할 수 있다. 비루스 번식방법은 다음에 기술되어 있다.

[방법 A]

예비형성된 단층의 감염

1. 세포를 통상적으로 알려져 있는 세포배양성장배지를 사용하는 로울러병, 포비트스키 플라스크, 또는 루병과 같은 배양용기내에서 성장시켜 합류시킨다.

2. 감염시키기 전에 성장배지를 세포단층으로부터 제거한다.

3. 인플루엔자 바이러스가 감염되어 있는 종자를, 부가적 비타민, 불필수아미노산, L-글루타민, 덱스트로즈 및 항생제를 함유하는 성장배지(pH 6.6 내지 6.8로 조절)에서 희석시킨다.

4. 바이러스를 함유하는 희석제의 양을, 최종 수득 부피의 10 내지 100%의 양으로 하여 세포단층에 가한다.

5. 감염된 단층을 34 내지 37℃에서 1 내지 72시간 동안 배양한다.

6. 프로테아제를 단독으로, 또는 바이러스 전달배지와 혼합한 상태로 하여 세포소(沼)를 형성시키지 않으면서 다단계 성장을 촉진시킬 수 있는 농도로 가한다. 트립신의 경우 이러한 최적농도는 약 8 내지 15㎍/ml이다.

7. 바이러스 성장용기를, 최대의 세포변성효과가 관찰될 때까지 다시 34 내지 37℃에서 배양시킨다. 이때 바이러스 유동체가 수득된다.

8. 수득물은 다음 반응에 사용하기 위해 용기를 격렬히 진탕시켜 세포를 제거하고 유동체 및 세포를 살균시킨 용기에 옮긴다.

[방법 B]

단층형성전의 액체 세포 현탁액의 감염

1. 세포를 통상의 방법에 따라 성장요기로부터 제거한다.

2. 세포를 원심분리하여 농축시킨 후, 부가적인 비타민, 불필수아미노산, L-글루타민, 덱스트로즈 및 항생제를 함유하는 새로 제조한 성장배지 정량에 재현탁시킨다.

3. 이 농축된 세포현탁액에 인플루엔자 바이러스를 가한다.

4. 세포바이러스 현탁액을 자석식 교반기 또는 회전식 진탕기 상에서 20분 내지 4시간 동안 혼합시키면서 무균상태의 밀폐용기(예 : 스크류-캡 삼각 플라스크) 중에서 배양시킨다(25 내지 37℃).

5. 일부분의 세포 바이러스 현탁액을, B-2와 5%의 송아지 태아 혈청에 나타나 있는 성분을 함유하는 총용적의 배지와 함께 성장용기(로울러병, 루병, 포비트스키플라스크)에 넣는다.

6. 성장용기를, 합류한 단층이 형성될 때까지(약 2 내지 4일) 34 내지 37℃에서 배양시킨다.

7. 단층이 형성된 후 프로테아제를, 세포 소를 형성시키지 않으면서 다단계 성장을 촉진시킬 수 있는 농도로 가한다. 트립신의 경우 이러한 최적농도는 약 10 내지 25㎍/ml이다.

8. 성장용기를, 최대의 세포변성효과가 관찰될 때까지 34 내지 37℃에서 배양시킨 다음 바이러스를 수득한다.

9. 수득물은, 다음 반응에 더욱 사용하기 위해, 용기를 격렬히 진탕시켜 세포를 제거한다. 세포 및 유동체를 살균시킨 용기에 옮긴다.

[방법 C]

액체 현탁액 배양기의 감염

1. 현탁액 배양기에 가한 세포를 현탁액 성장용기내의 성장배지중의 최적인 수로 성장시킨다.

2. 세포를 원심분리하여 농축시킨 후, 부가적인 비타민, 불필수아미노산, L-글루타민, 덱스트로즈 및 항생제를 함유하는 새로 제조한 성장배지 량에 재현탁시킨다.

3. 여기에 인플루엔자 바이러스를 가한 후 배양기를 34 내지 37℃에서 10분 내지 수시간동안 배양시킨다.

4. 송아지 태아의 혈청을 가하고 배양 현탁액을 34 내지 37℃에서 1 내지 72시간동안 더욱 배양시킨다.

5. 프로테아제를 세포상에 해로운 효과를 나타내지 않으면서 다단계 성장을 일으킬 수 있는 농도로 가한다. 트립신의 경우 이러한 최적농도는 약 4 내지 25㎍/ml이다.

6. 유동체가 수득될 때 최대 세포변성효과가 관찰될 때가지 34 내지 37℃에서 계속 배양한다.

7. 수득물은 다음 반응에 더욱 사용하기 위해 유동체를 무균용기에 옮긴다.

인플루엔자 바이러스의 선택된 균주를 전달시키기 위한 기술 및 배지를 사용하는 특징 실시예를 다음에 기술한다. 다른 언급이 없는 한 공지되어 있는 통상의 조직 배양기술을 사용하는 것이며, 세포 및 배지의 제조기술이 잘 알려져 있기 때문에 여기서 상세하게 기술하지는 않는다.

[실시예 1]

마이아미 균주로 명명되는 A₂에퀸 인플루엔자 바이러스는 마이아미대학에서 최초로 말에서 분리해낸 것이다. 이 바이러스는 펜실바니아 의과대학에서 병아리 난에 6번 통과시켜 얻은 것이다. 7번째의 통과는 리데를 라보라토리스에서 수행되어 얻어졌다. 균주는 병아리 난을 더 많이 통과하며 11 내지 16회 통과할 때 사용된다.

A₂균주의 조직배양 전달의 바람직한 본 방법은 CDLK 세포의 어리고 합류된 단층의 감염을 포함한다. 세포를, 다음과 같은 성분을 함유하는 행크스 최소 필수배지[Hank's minimun Essential Medium)(MEMH)를 사용하여 로울러병에 심는다.

세포를 보통 72시간 합류시키고 이때 배지를 부어버린 후 세포를 감염시킨다. 접종배지는 다음과 같은 성분으로 보강된 MEMH 중에서의 난 감염중량 50(EID₅₀)의 역가가 약 10^3.0m/l로 되도록 희석시킨 A₂바이러스를 함유한다.

최종용적의 14%에 해당하는 접종배지를 각 로울러병에 가한 후 용기를 34 내지 35℃에서 72시간동안 배양한다. 이때 12㎍/ml의 무균트립신(시그마, 1 : 250) 요액 (0.1g/100ml)을 함유하는 남아있는 배지(86%)를 각 로울러병에 가한다. 용기를 다시, 최대 세포변성효과가 관찰될 때까지(48 내지 72시간) 34 내지 35℃에서 배양시키면 유동체가 수득된다. 수득물은 다음 반응에 더욱 시용하기 위해 각 로울러병을 격렬히 진탕시켜 접촉된 세포를 제거하고 세포 및 바이러스 유동체를 무균 뱃칭용기에 옮긴다.

이러한 기술을 사용한 A₂인플루엔자 바이러스 성장의 수득물 EID₅₀의 역가를 표 1에 나타낸다(도면 제1도 참조). 이와 동일한 방법에 따라, 단 트립신을 가하지 않고 성장시킨 A₂바이러스로 대조실험을 행한다.

[표 1]

CLDK 세포내에서 트립신과 함께 또는 트립신없이 성장시킨 마이아미 균주 에퀸 인플루엔자 바이러스의 EID₅₀

성장배지에 트립신을 가하면 마이아미 균주가 생성되는 동안 ml당 3.2log 또는 1711배의 바이러스 입자가 기하학적으로 증가된다.

[실시예 2]

악성 A₁에퀸 인플루엔자 바이러스의 샘플을 펜실바니아 의과대학에서 얻는다. 펜실바이나(A₁)로 명명되는 균주를 말에서 분리시켜 병아리 난에 6차례 통과시킨다. 균주를 병아리 난에 더욱 통과시킨 후 12 내지 17회 통과시켰을 때 조직배양기를 생성하기 위해 사용한다.

균주의 바림직한 조직배양 전달방법은 단층을 형성시키기 전에 CLSK 세포의 현탁액을 먼저 감염시키는 것이다. 약 10^5.5/ml 농도의 CLDK 세포, EID₅₀의 역가가 10^3.0/ml인 바이러스의 펜실바니아 균주 및 행크스 최소 필수배지(MEMH)(하기성분으로 보강시킨 배지)를 밀폐된 무균삼각플라스크내의 자석식 교반기상에서 혼합시키면서 25℃에서 배양한다. 2 내지 3시간 배양시키는 동안 PH를 1N HCl을 사용하여 6.7 내지 6.8로 유지시킨다.

이 현탁액을 배양시킨 후 10ml 부분의 세포바이러스 현탁액을 상기와 같이 보강된 11의 MEMH 및 5%의 송아지 태아의 혈청을 함유하는 로울러 병에 가한다. 로울러 병을, 단층이 합류될 때까지(약 48 내지 72시간) 34 내지 35℃에서 배양시킨 후 각 로울러 병에 20ml의 무균 트립신용액(lg/ml)(시그마 1 : 250)을 가한다. 로울러 병을, 최대 세포병리효과가 관찰될 때까지(3 내지 5일), 34 내지 35℃에서 다시 배양한다. 다음 반응에 더욱 사용하기 위해 각 로울러 병을 격렬히 진탕시켜 접착상태로 남아있는 세포를 제거하고 세포 및 유동체를 무군용기에 옮김으로써 바이러스 유동체를 수득한다.

이러한 기술을 사용한 Al 인플루엔자 바이러스 성장의 수득물 EID₅₀의 역가를 표 2에 나타낸다(도면 제2도 참조).

이와 동일한 방법에 따라, 단 트립신을 가하지 않고 성장시킨 Al 바이러스 대조실험을 행한다.

[표 2]

세포내에서 트립신과 함께 또는 트립신없이 배양한 말 인플루엔자 바이러스 펜실바니아 균주의 EID 역가

성장배지에 트립신을 가하면 펜실바이아 균주가 생성되는 동안 ml당 기하평균 2.3logs 또는 187배의 바이러스 입자가 증가된다.

[실시예 3]

B/홍콩/5/72(BX-1)로 명명된 인체 인플루엔자 바이러스를 죠오지아주 애틀란타에 있는 질병 구제센타(The Center for Disease Control)로부터 입수한다. 이것을 수정된 계란에 1회 통과시키고 -70℃로 냉동시켜 종자 바이러스로 한다.

B/홍콩/5/72 균주의 조직 배양 번식 방법으로서 바람직한 것은 실시예 1에서와 유사한, 어린 CLDK 세포의 연합단층을 감염시키는 방법이 있다. 실시예 1에서의 방법으로 세포를 생장시킨다. 성장배지를 세포로부터 제거하여 따라 낸 후 실시예 1에 열거한 접종배지내에서 EID₅₀역가 약 10^3.0-5.0/ml까지 희석한 바이러스로 세포를 감염시킨다. 접종용량은 최종 용량은 최종 수득용량의 33.0%와 같도록 한다. 용기는 34 내지 35℃에서 40 내지 48시간 배양하고 12㎍/ml의 트립신 용액(0.1g/100ml)를 함유하는 잔류 배지(66.7%)를 각 용기에 넣는다. 최대의 세포변성효과가 일어날 때까지(48 내지 72시간) 34 내지 35℃에서 배양을 계속하면 바이러스 액이 수득된다. 수득물은 각 용기를 격렬히 진탕하여 세포를 제거하고 세포 및 액체를 다음 실험과정을 위해 멸균용기에 넣는다.

이 방법에 의해 배양된 B/홍콩/5/72 인플루엔자 바이러스 수득 EID₅₀역가를 다음 표 3에 나타내었으며 제3도를 참조할 수 있다. 대조용은 트립신을 첨가하지 않은 채로 상기의 방법에 따라 배양하여 만든다.

[표 3]

CLDK 세포내에서 트립신과 함께 또는 트립신없이 배양한 B/홍콩/5/72 인체 인플루엔자 바이러스 균주의 EID₅₀역가

성장배지에 트립신을 첨가하면 B/홍콩/5/72 균주가 생성되는 동안 기하평균 3.1logs 또는 1412배의 바이러스 입자가 증가된다.

[실시예 4]

A/텍사스/1/77로 명명된 인체 인플루엔자 바이러스 균주를 죠지아주 애틀란타에 있는 질병구제 센터로 부터 입수한다. 이것을 수정된 계란에 1회 통과시키고 -70℃로 냉동하여 종자 바이러스로 사용한다.

A/텍사스/1/77 균주의 조직 배양 번식방법으로서 바람직한 것들은 실시예 3에 기록되어 있다.

이러한 방법으로 배양된 A/텍사스/1/77 인체 인플루엔자 바이러스 수득 EID₅₀역가는 표 4와 제4도에 기록되어 있다. 대조용은 트립신을 첨가하지 않은 채로 상기의 방법에 의해 만든다.

[표 4]

CLDK 세포내에서 트립신과 함께 또는 트립신없이 배양한 A/텍사스/1/77 인체 인플루엔자 바이러스 균주의 EID₅₀역가

성장배지에 트립신을 첨가하면 A/텍사스 균주가 생성되는 동안 ml당 기하평균 4.1logs 또는 12590배의 바이러스 입자가 증가된다.

[실시예 5]

A/USSR/90/77로 명명된 인체 인플루엔자 바이러스 균주를 죠오지아주 애틀란타에 있는 질병 구제센터로 부터 입수한다. 이것을 수정된 계란에 1회 통과시키고 -70℃로 냉동시켜 종자 바이러스로 사용한다.

A/USSR/90/77로 명명된 균주의 조직 배양 번식법으로서 바람직한 방법은 실시예 3에 기술되어 있다.

이 방법으로 배양된 A/USSR/90/77 인체 인플루엔자 바이러스 수득 EID 역가는 표 5 및 제5도에 기술하였다. 대조용은 트립신을 첨가하지 않은 채로 상기의 방법에 의해 만든다.

[표 5]

CLDK 세포내에서 트립신과 함께 또는 트립신없이 배양한 A/USSR/90/77 인체 인플루엔자 바이러스 균주의 EID₅₀역가

성장배지에 트립신을 첨가하면 A/USSR 균주가 생성되는 동안 ml당 기하평균 2.4logs 또는 251배의 바이러스 입자가 증가된다.

[왁진제조]

[실시예 6]

바이러스 독성약화

실시예 1의 수득액으로부터 얻은 바이러스의 독성약화는 화학적으로 수행하거나 종말에 희석 통과기법을 포함하는 표준적 일련의 통과 방법에 의해 수행하는데 이때 바이러스가 면역성을 잃지 않은 채로 비-병원성을 가질 때까지 민감한 세포배양에서 충분히 통과시킨다. 이러한 방법으로 제조된 왁진은 질병에 민감한 동물의 정항성을 임상적 증상이 없이 자극하게 되는데 이는 어느정도까지의 맹독성에 의한 것이다. 상기 통과과정에서 사용된 것과 동일하거나 다른 조직내에서 번식될 수도 잇다.

[실시예 7]

바이러스 불활성화

이 방법은 실시예 1 및 2와 유사한 방법이나 수득된 바이러스를 담은 액을 0.1% 농도(0.05 내지 0.2%)의 포름알데히드로 불확성화시키고 처리된 물질을 4℃에서 10 내지 14일 동안 배양한다. 최종의 불활성화된 물질을 시험한 결과 살아있는 바이러스가 없음이 나타났다. 문헌에 알려진 보조제, 예를들어 수산화 알루미늄, 알륨, 인산알루미늄, 프로인드(Freund's) 또는 미합중국특허 제3,790,665호 및 제3,919,411호에 기술된 것을 첨가할 수 있다. 이러한 선행기술이나 본 발명의 왁진에 사용된 보조제 중 바람직한 것은 폴리알릴 사카라이드(Carbopol 934P)로 가교된 아크릴산 폴리머이다.

[실시예 8]

불활성화된 바이러스 왁진 제조 및 사용

1.0ml의 말 용량은 0.45ml의 펜실바이나(A₁) 균주, 0.45ml의 마이아미(A₂) 균주 및 0.10ml의 카보폴보조제로 구성된다. 동일한 부(part)의 실시예 7에서 수득한 불활성화 왁진 균주와 혼합하고 1ml를 19마리의 말에게 근육주사로 투요한다. 왁진 투여 후 임상적 질벼잉나 인플루엔자에 의한 증상이 어느 한마리에게서도 나타나지 않았다. 접종한 2, 4 및 8주 후 말 인플루엔자 A₁과 말 인플루엔자 A₂에 대한 항체 역가가 혈청에 수득된다. 표준 헤마글루티네이션 시험 [DIAGOSTIC PROCEDURES for viral and Rickettisal Infection, 4th Ed. Lennette and Schmide, pp.665-66(1969). American pubilic Health Association, N. Y., N. Y 10019]에 의해 예비 접종치(표 6)를 비교한다.

[표 6]

* 두번째 접종일

표 6에서 보는 바와 같이 접종된 말에서 항체는 두가지의 바이스러스서 항원에 대하여 발달된다. 이 예방접종물은 말의 인플루엔자에 면역성을 갖는데 그 이유는 A2에 대해 1 ; 20이고 A1에 대해 1 : 60의 항체역가가 미합중국 농무성의 국제수의 취급실험실[National Veterinarry Servies Laboratories)에 의해 적정선으로 받아들여지기 때문이다.

여러가지 종류와 나이의 말 420마리에게 임상시험한 결과 왁진을 근육내 투여한 후 안전하며 해로운 반응을 일으키지 않았음을 알 수 있다.

[실시예 9]

희석한 비루스 왁진의 사용

3마리의 말에게 살아있는 희석한 말 인플루엔자 A2 왁진 균주 5ml를 비강내 투여한다. 말에게 예방접종한 후 임상적 질병이나 인플루엔자 증상이 나타나지 않음을 알 수 있다. 왁진 균주에 대한 항체 역가로 접종후 1, 2, 및 4주에 모든 동물의 혈청에서 수득되며 표준 헤마글루티네이션 억제시험(HAI)를 사용하여 접종전과 비교할 수 있다.

[표 7]

항체반응(HAI)-말의 인플루엔자

수득된 항체 적정량은 보호시 필요한 것보다 더 많다.

본 발명은 새로운 인플루엔자 배양 시스템과 새로운 인플루엔자 왁진을 제조하기 위한 배지의 사용 등 두가지 면에 다 관심이 있다. 본 발명에서 사용된 액체 세포 배양 시스템은 감염되기 쉬운 세포, 인플루엔자 비루스, 영양배지 및 단백질 분해효소를 필요로 하나 과거의 시스템(예를들어 Tobta 등의 참고문헌)은 시스템을 반고체상태로 환원시키는 박테리아 배양기의 사용을 필요로 하지 않는다. 박테리아 배양기를 사용하지 않으면 이 분야에 알려진 통상적인 방법으로 비루스를 다량 생산할 수 있으며 왁진을 제조하는데 필요한 높은 적정량의 비루스성 액체를 제조할 수 있다.

인플루엔자 왁진 제조물 자체는 주어진 인플루엔자 비루스 입자의 하나 또는 그 이상의 균주 유효량과 약학적으로 무독한 담체로 이루어지며 총 제조물은 바람직하게는 수성형태로 계란 단백질 같은 실질적으로 반응성 단백질이 없는 것이 바람직하다. 실직적으로 계란 단백질이 없다는 뜻은 왁진제조물에서 계란 단백질의 가능한 원(source)만이 1 : 100,000 이상으로 희석시킬 수 있는 시드(seed) 비루스라는 것을 의미한다.

왁진은 동물에게 여러가지 방법으로 즉 근육내, 정맥내, 피하, 기관내, 비강내 투여하거나 에어로졸 분무하며 왁진은 사람, 말, 돼지, 닭 등의 동물에게 투여할 수 있다.

본 발명에 의해 제조된 비루스성 제조물은 그의 효능을 조절하기 위해 물로 희석할 수도 있으며 슈크로즈, 텍스트로즈, 락토즈 또는 비독성 물질과 같은 안정화제를 가할 수 있다. 비루스성 제조물은 저장할 목적으로나 제형할 목적으로 동결건조시켜 희석된 왁진을 만들거나 죽은 비루식왁진 제조를 위해 화학적으로 불활성화시킬 수 있다.

Claims (1)

1. 배양액중의 세포를 인플루엔자 비루스를 감염시키고 감염된 배양물을 원래 감염된 세포 이외의 세포를 감염 및 복제시키기에 충분한 조건하에 단백질 분해효소 존재하에서 배양시킨 후 배양물로부터 비루스를 얻고 얻은 비루스로부터 왁진을 제조함을 특징으로 하여 인플루엔자 비루스 왁진을 제조하는 방법.

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