KR100999510B1 - 인산화 타이로신 잔기에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 타이로신 인산화 잔기에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 항체를 제조하는 방법 및 타이로신 인산화 잔기 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 검출하려는 인산화된 단백질에 따라 종래의 시판 항체인 4G10, pY20, pTyr100 및 pY99 등과는 다른 특이성 및 보다 높은 친화력을 보인다.

타이로신, 인산화, 잔기, 항체, Fab, pComb3XSS, ER2537, CDR

Description

인산화 타이로신 잔기에 대한 항체{Antibodies to Phosphorylated Tyrosine Residue}

본 발명은 타이로신 인산화 잔기에 대한 항체, 이를 코딩하는 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 , 이로부터 단일클론 항체를 제조하는 방법 및 타이로신 인산화 잔기 검출용 키트에 관한 것이다.

타이로신 잔기의 인산화는 세포 내 신호전달의 중요한 메커니즘 중의 하나이다. 따라서 이를 이해하기 위한 연구들이 많이 수행되고 있으며, 최근에는 프로테오믹스와 같은 총체적인 이해를 목적으로 한 연구들이 보고되고 있다. 하지만 타이로신 잔기의 인산화는 신호 전달을 주로 담당하기 때문에 그 절대적 존재량이 적다. 이것이 연구를 수행함에 있어서 일차적인 한계점이다. 이를 극복하기 위해서 연구자들은 타이로신 잔기의 인산화 자체를 인지하는 항체를 이용하여 인산화된 단백질을 일부 정제 및 농축하여 연구를 수행하고 있다.

현재까지 인산화된 타이로신에 결합하는 항체로서 상업적으로 판매되고 있는 항체로는 4G10, pY20, pTyr100 및 pY99 등이 있다. 문제는 이들 항체 모두가 서 로 다른 특징을 갖고 있다는 것이다. 즉 하나의 인산화 된 단백질에 대하여 어떤 항체는 결합을 하지만 다른 항체는 결합을 하지 않은 양상을 나타낸다. 또한 이들 항체를 모두 사용한다고 하더라도 생체 내의 모든 인산화 된 단백질을 확인할 수 있다는 보장도 없는 것이 현실이다. 따라서 기존 항체와는 다른 특징을 갖는 타이로신 잔기의 인산화에 특이적인 항체를 개발하는 것은 의미 있는 일이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 타이로신 인산화 잔기에 대한 특이적인 항체를 개발하고자 노력한 결과, 종전의 항체와는 다른 특이성 및 보다 높은 친화력을 가진 신규한 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 타이로신 인산화 잔기에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 타이로신 인산화 잔기에 대한 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 타이로신 인산화 잔기에 대한 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 타이로신 인산화 잔기 대한 항체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 타이로신 인산화 잔기 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 인산화 타이로신-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공 한다: 서열목록 제5서열로 이루어진 CDRH1, 서열목록 제6서열로 이루어진 CDRH2 및 서열목록 제7서열로 이루어진 CDRH3.

본 발명자들은 인산화 된 타이로신 잔기에 대한 특이적인 항체를 개발하고자 노력한 결과, 종전의 시판 중인 항체와는 다른 특이성 및 보다 높은 친화력을 가진 신규한 항체를 개발하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변영역은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진다.

본 명세서에서, 타이로신 인산화 잔기를 언급하면서 사용되는 용어 “항체(antibody)”는 타이로신 인산화 잔기에 대해 특이적으로 결합하는 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Wonsiewicz, M. J., Cellular and Molecular Immunology, Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이이고, 가장 바람직하게는 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서 본 발명의 바람직한 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태임을 알 수 있다.

본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 서열목록 제5서열을 포함하는 CDRH1, 서열목록 제6서열을 포함하는 CDRH2 및 서열목록 제7서열을 포함하는 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 발명의 타이로신 인산화 잔기에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 타이로신 인산화 잔기에 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등 물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (- 0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York (1979)). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인산화 타이로신-특이적 항체는 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함 한다: 서열목록 제8서열로 이루어진 CDRL1, 서열목록 제9서열로 이루어진 CDRL2 및 서열목록 제10서열로 이루어진 CDRL3.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결 합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항체는 다양한 형태의 항체로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 Fab 항체로 제조될 수 있고, 또한 Fab 항체에 얻은 경쇄 및 중쇄 가변영역을 이용하여 사람 유래의 불변영역과 재조합함으로써 완전한(whole) 형태의 항체를 제공할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. 용어 “단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 유전적 재조합 방법으로 제공될 수 있는 본 발명의 항체는 핵산 서열과 아미노산 서열이 동일하므로 단일클론 항체라 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 인산화 타이로신-특이적 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 인산화 타이로신-특이적 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자“는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이 드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

타이로신 인산화 잔기에 대한 항체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자; 및 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡 터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 파아지미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함되며, 바람직하게는 플라스미드 벡터, 파아지미드 벡터, 가장 바람직하게는 파아지미드 벡터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl . Environ. Microbiol . 64:3932-3938(1998); Mol . Gen . Genet . 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스,의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터) )가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편을 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주 세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나 스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. coli이고 보다 바람직하게는 E. coli ER2537, E. coli ER2738, E. coli XL-1 Blue, E. coli BL21(DE3), E. coli JM109, E. coli DH 시리즈, E. coli TOP10, E. coli TG1 및 E. coli HB101이다. 가장 바람직하게는 숙주세포는 E. coli ER2537 이다.

상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 그리고 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포를 포함한다. 또한, 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포도 숙주 세포로 이용할 수 있다. 바람직하게는, 숙주세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서, 숙주 세포로의 “형질전환” 및/또는 “형질감염”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄)) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press)(1989)) 포유동물 숙주 세포로의 형질전환의 일반적인 방법 및 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 반 솔링겐(Van Solingen) 등의 문헌(J. Bact.,130:946(1977)) 및 히시아오(Hsiao) 등의 문헌(Proc . Natl . Acad . Sci .( USA ), 76:3829(1979))의 방법에 따라 수행된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인산화 타이로신-특이적 항체의 제조방법을 제공 한다: (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자; 및 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주세포에서 타이로신 인산화 잔기에 대한 항체를 발현시키는 단계.

상기 항체 제조에서 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택 되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.

동물세포 배양은 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합 물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지40 ℃이다.

형질전환 된 숙주세포를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고 순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 인산화 타이로신-특이적 항체를 포함하는 타이로신 인산화 잔기 검출용 키트를 제공한다.

본 명세서상의 “검출”은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용하여 실시할 수 있다. 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함한다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 및 ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 본 발명의 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 본 발명의 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 항체는 타이로신 인산화 잔기에 높은 특이성을 가지고 결합한다.

(b) 본 발명의 항체는 종래의 시판 항체인 4G10, pY20, pTyr100 및 pY99 등과는 다른 타이로신 인산화 잔기에 특이성을 보이며, 특히 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 4G10과 비교시 단백질 크기에 따라 보다 특이적 또는 보다 높은 친화력을 보여준다.

(c) 본 발명의 항체는 타이로신 잔기의 인산화 여부를 검출하는데 이용될 수 있어 연구실 등에서 유용한 실험재료로써 세포 내 신호전달의 이해, 원하는 단백질의 분리 및 암과 같은 질병의 치료 등 다양한 분야에서 응용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

세포 및 항체

본 발명자는 HeLa 세포(ATCC; American Type Culture Collection)를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, 10% FBS, Hyclone)에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양 하였고, 293-F 세포(Invitrogen)는 제조사의 제공정보에 따라 프리 스타일 293F 배지(Invitrogen)에서 37℃, 8% CO₂ 및 110 rpm 조건으로 배양하였다. 본 실험에서 사용한 항체 4G10 (Upstate), HRP 콘쥬게이트 항-마우스 항체(Pierce) 및 HRP 콘쥬게이트 항-HA 항체(Roche)는 구매하였다.

HA와 His 태그가 COOH 말단에 결합된 형태의 Fab LCSPY는 ER2537 균주(New England Biolabs)에서 발현시킨 뒤 Ni-NTA 수지(Amersham)를 이용하여 정제 후 사용하였다. LCSPY 미니항체(minibody)는 293F 세포에 형질감염 후 단백질-G 비드(Amersham)를 이용하여 정제한 뒤 사용하였다.

항체 파아지 라이브러리 구축

본 발명자는 XXXpYXXX 형태의 인산화된 타이로신 아미노산을 포함하는 랜덤 펩타이드를 합성하였다. 이를 KLH(keyhole limpet haemocyanin, Pierce) 및 OVA(ovalbumin, Sigma)에 콘쥬게이션 시킨 후 토끼에 주사하여 면역반응을 실시하였다. 면역반응을 실시하는 경우, 담체(KLH 및 OVA)에 대한 항체가 만들어질 가능성을 낮추기 위하여 두 담체를 번갈아서 면역반응을 실시하였다. 이후 면역된 토끼의 혈액을 채취하여 인산화 된 타이로신 잔기에 대한 항체가 형성되었는지 확인하였다.

항체 파아지 라이브러리 제작은 “Barbas et al., Phage Display : A laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Section 2, Chapter 9,Protocol 9.6(2001)”에 따라 실시하였다. 이 과정을 서술하면 다음과 같다. 항체의 형성이 확인된 토끼의 골수와 비장으로부터 총 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR 방법을 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA로부터 하기 표 1 및 표 2의 항체 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 항체의 가변영역에 해당하는 유전자를 확보하였다.

V_L 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머	5'-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGM TGA CCC AGA CTC CA-3'
	5'-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG ATM TGA CCC AGA CTC CA-3'
	5'-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTG AA-3'
	5'-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGT CGC CCT C-3'
안티센스 프라이머	5'-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT GAT TTC CAC ATT GGT GCC-3'
	5'-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TAG GAT CTC CAG CTC GGT CCC-3'
	5'-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT GAC SAC CAC CTC GGT CCC-3'
	5'-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG GCC TGT GAC GGT CAG CTG GGT CCC-3'

V_H 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머	5'-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CAG TCG GTG GAG GAG TCC RGG-3'
	5'-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CAG TCG GTG AAG GAG TCC GAG-3'
	5'-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CAG TCG YTG GAG GAG TCC GGG-3'
	5'-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CAG SAG CAG CTG RTG GAG TCC GG-3'
안티센스 프라이머	5'-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA RGA GAY GGT GAC CAG GGT GCC-3'

cDNA로부터 인간의 Cκ와 C_H1 부분에 해당하는 유전자는 하기 표 3 및 표 4의 프라이머를 사용하여 확보하였다.

인간 Cκ 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머	5'-CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC-3'
안티센스 프라이머	5'-GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC-3'

인간 C_H1 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머	5'-GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC-3'
안티센스 프라이머	5'-AGA AGC GTA GTC CGG AAC GTC-3'

상기 확보된 V_L, V_H, Cκ 및 C_H1로부터 오버랩 PCR 방법을 이용하여 Fab 형태에 해당하는 중쇄 및 경쇄사슬 유전자를 확보하였다. 이때 본 실험에서 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다:

V_L+Cκ 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머	5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC-3'
안티센스 프라이머 (인간 Cκ를 위한 안티센스 프라이머)	5'-GGC CAT GGC TGG TTG GGC AGC-3'

V_H + C_H1 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머	5'-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC-3'
안티센스 프라이머 (인간 CH1을 위한 안티센스 프라이머)	5'-AGA AGC GTA GTC CGG AAC GTC-3'

V_L + Cκ + V_H + C_H1 부위를 위한 프라이머

프라이머	서 열
센스 프라이머 (VL+Cκ를 위한 센스 프라이머)	5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC-3'
안티센스 프라이머 (VL+Cκ를 위한 안티센스 프라이머)	5'-GAG GAG GAG GAG GAG GAG AGA AGC GTA GTC CGG AAC GTC-3'

이를 다시 오버랩 PCR 방법을 통하여 pComb3XSS 벡터(Barbas laboratory)에 삽입하였다.

ER2537 박테리아에 항체 유전자를 포함한 pComb3XSS 벡터로 일렉트로포레이션(Micro Pulser; Bio-rad) 방법을 이용하여 형질전환하고 헬퍼 파아지(VCSM13; Stratagene)를 감염시켜 항체 파아지 라이브러리를 제작하였다.

항체 스크리닝

면역원으로 사용한 랜덤 펩타이드를 BSA(Sigma)와 결합시키고 이것을 다시 마그네틱 비드(Dynabead M-270 Epoxy; Invitrogen)와 결합시켰다. 펩타이드-BSA-비드와 파아지 라이브러리를 TBS-T-BSA 완충용액(0.05% 트리톤 X-100, 5% BSA)에서 결합시켰다. TBS-T 완충액을 이용하여 1회, 5회 및 10회 세척하면서 비특이적으로 결합하는 파이지를 제거하고 pH 변화를 통해서 결합한 파아지를 확보하였다. 확보된 파아지를 ER2537 박테리아에 감염시켜 pComb3XSS 플라스미드와 Fab 형태의 항체를 확보하였다. pComb3XSS의 염기서열을 분석하여 독립적인 항체 클론들을 확인하였다.

면역블롯 및 면역침강( Immunoblot and Immunoprecipitation )

타이로신 잔기가 인산화 된 단백질을 얻기 위하여, HeLa 세포를 일반 배양 배지를 이용하여 배양하다 24시간 동안 혈청이 없는 상태로 배양한 뒤, 1 mM 퍼바나데이트(pervanadate, Sigma)를 포함하는 혈청이 없는 DMEM에서 30분 동안 배양하였다. 면역블롯을 위해서 퍼바나데이트가 처리된 세포를 PBS를 이용하여 2번 세척한 뒤 수집하였다. 원심분리 하여 남은 PBS를 완전히 제거하고 2-D용 완충용액(7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.5% IPG 완충용액, DTT 및 단백질 가수분해 효소 억제제)에서 세포를 소니케이션하여 세포 용해물(lysate)를 준비하였다. 상기 세포 용해물을 10% SDS-PAGE와 7-cm (pI 4-7) 스트립트를 이용하는 2-D 전기영동에 적용하여 분리하였다. 전기연동 후에 단백질을 NC (nitrocellulose; Whatman) 막으로 옮긴 후 TBS-T (5% BSA)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 이 블로킹 용액에 4G10이나 HRP-콘쥬게이트 항-HA 항체를 추가하여 실온에서 1시간 동안 결합시킨 후에 웨스트 세이브(West Save, AbFrontier) 키트를 이용하여 검출 하였다. 4G10의 경우, 처음 항체를 결합시키고 HRP-콘쥬게이트 항-마우스 항체 (앞의 블로킹 용액과 동일)를 추가로 결합시켜 주었다.

면역 침강을 위하여, 퍼바나데이트를 처리한 세포를 IP 용 완충용액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA 및 단백질분해효소 억제제)에서 파쇄시켜 세포 용해물(lysate)을 얻었다. 동량의 용해물과 항체를 이용하여 면역침강을 실시한 후 실버염색(Amersham)을 하여 침강여부를 확인하였다.

실험 결과

선별된 항체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 염기서열

파아지 라이브러리에서 BSA에 결합된 pY(포스포타이로신 아미노산) 또는 랜덤 포스포타이로신 펩타이드(XXXpYXXX)와 결합하는 항체를 스크리닝 하여 3 종류의 항체를 얻었다. 이들 항체들은 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 상이한 것으로 서로 다른 종류의 항체로 확인되었다. 본 발명자는 이들 중 1개의 항체, LCSPY에 대하여 연구를 수행하고 결과를 얻었다. 선택된 LCSPY의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1-4서열과 같다. CDRs의 아미노산 서열은 서열목록 제5-10서열과 같으며, CDRs를 제외한 나머지 부위의 서열은 FR (프레임 부위)이다.

타이로신 잔기 특이적 인산화 항체

퍼바나데이트는 인산화된 타이로신 잔기의 인산화 그룹을 제거하는 단백질 포스파테이즈의 억제제로 널리 사용되고 있다. LCSPY의 인산화 타이로신에 대한 특이적 결합을 확인하기 위하여 HeLa 세포에 퍼바나데이트를 넣어준 뒤 그 결합을 면역블롯을 통하여 확인하였다. 확인하는데 사용된 LCSPY는 토끼에서 유래한 가변부위 및 인간의 Cκ와 그리고 C_H1을 갖고 있으며, His 태그를 포함하고 있다. 퍼바나데이트를 처리한 HeLa 용해물에서만 블롯이 확인되었고, 이는 LCSPY가 인산화 된 타이로신 잔기에 특이적으로 결합하는 항체임을 보여주는 것이다(도 1).

4 G10 항체와의 비교

타이로신 잔기의 인산화를 연구하는 분야에서 가장 널리 사용되고 있는 항체는 4G10이다. 따라서 본 발명자는 본 발명의 항체인 LCSPY와 4G10 항체를 비교하였다. 먼저 면역블롯방법을 통해 비교하였다. 1-D를 통해서는 단백질 밴드의 구분이 어려웠기 때문에, 2-D를 통해서 비교하였다(도 2). 실험에 사용된 4G10은 IgG 형태인데 반하여, LCSPY의 경우는 Fab 형태이기 때문에 상대적으로 약한 신호을 보였다. 이것은 결합활성효과(avidity effect) 때문일 것으로 판단되며 LCSPY를 IgG 형태로 바꾸면 향상될 것으로 판단된다. 70 kDa에서 30 kDa 사이의 단백질만을 비교하면, 몇 개의 스팟에서 서로 다른 양상을 보임을 알 수 있다. 일부는 4G10에서만 확인되고, 반대로 일부는 LCSPY에서만 확인되는 단백질 스팟을 확인할 수 있다. 그러나 정도의 차이는 있으나 대부분의 단백질들은 공통적으로 LCSPY 및 4G10과 결합하는 양상을 보였다.

실제 프로테오믹스 연구를 하는 분야에서 인산화된 타이로신 잔기에 특이적인 항체를 이용하는 경우는 단백질을 분리하는 목적이 대부분을 차지한다. 따라서 면역침강법을 통하여 4G10과 비교하였다(도 3). 면역블롯과 마찬가지로 퍼바나데이트를 처리한 HeLa 세포 용해물을 사용하였으며, LCSPY의 경우는 scFv에 인간 Fc가 융합된 형태의 항체를 사용하였다. 90 kDa 및 175 kDa 크기의 단백질의 경우는 LCSPY에 특이적으로 또는 보다 높은 친화력을 나타내고 있으며(파란색 화살표), 이들 보다 조금 큰 크기의 단백질들은 반대의 양상을 나타낸다(검은색 화살표).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 LCSPY의 타이로신 인산화 잔기에 대한 결합을 확인하기 위해 퍼바나데이트를 처리한 HeLa 세포 용해물을 이용하여 실시한 면역블롯의 결과를 나타내는 사진이다. 이때 사용한 LCSPY는 HA 태그를 포함하고 있는 Fab 형태이며, 검출을 위하여 HRP가 결합된 항-HA 항체를 이용하였다.

도 2는 퍼바나데이트를 처리한 HeLa 세포 용해물을 2-D 분리한 뒤 4G10 및 LCSPY 항체를 이용하여 실시한 면역블롯의 결과를 나타내는 사진이다. 이때 사용한 LCSPY는 HA 태그를 포함하고 있는 Fab 형태이며, 검출을 위해서 HRP가 결합된 항-HA 항체를 이용하였다.

도 3은 퍼바나데이트를 처리한 HeLa 세포 용해에서 타이로신 잔기가 인산화된 단백질을 4G10 및 LCSPY 항체를 이용하여 면역침강법으로 실시한 결과를 나타내는 사진이다. 이때 SDS-PAGE(8%)로 분리한 후 실버 스테이닝을 하여 그 차이를 확인하였다. 사용한 LCSPY는 단쇄Fv 형태에 인간 Fc 부위가 결합된 상태이다.

<110> EWHA UNIVERSITY-INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Antibodies to Phosphorylated Tyrosine Residue <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Rabbit <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> variable region of heavy chain <400> 1 cag tcg gtg gag gag tcc ggg ggt cgc ctg gtc acg cct ggg aca ccc 48 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 ctg aca ctc acc tgc aca gcc tct gga ttc tct ctt agt aac tat tgg 96 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg atc gga 144 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 gtc att agt cgt act ggt ttc acg tac tat gcg ccc tgg gcg aaa ggc 192 Val Ile Ser Arg Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Lys Gly 50 55 60 cga ttc acc atc tcc aaa acc tcg acc acg gtg gat ctg aaa atg acc 240 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 agt ccg aca acc gag gac acg gcc acc tat ttc tgt gcc aga gtg ggc 288 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly 85 90 95 gat agt ggt aat cac ggt tat gct gtt cac cac ttt aac gtc tgg ggc 336 Asp Ser Gly Asn His Gly Tyr Ala Val His His Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tct tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Rabbit <400> 2 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Ser Arg Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly 85 90 95 Asp Ser Gly Asn His Gly Tyr Ala Val His His Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 330 <212> DNA <213> Rabbit <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> variable region of light chain <400> 3 gag ctc gtg atg acc cag act cca ccc tcc ctg tct gta tct gtg gga 48 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 ggc aca gtc acc ata aaa tgt ctg gcg agt gag aac gtt tac aga tct 96 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Leu Ala Ser Glu Asn Val Tyr Arg Ser 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aag cca ggg aaa cct cct aca ctc ctg atc 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 tat ggt gca tcc aat tta gaa tct ggg gtc cca cca cgg ttc agt ggc 192 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat tac acc ctc acc atc ggc ggc gtg cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat gct gcc act tac ttc tgt caa ggg tat agc agt tac cct ccc 288 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 aat ttg act ttt gga gct ggc acc aat gtg gaa atc aaa cga 330 Asn Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> Rabbit <400> 4 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Leu Ala Ser Glu Asn Val Tyr Arg Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Asn Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Rabbit <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> CDRH1 of heavy chain varable region <400> 5 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Rabbit <220> <221> CHAIN <222> (1)..(18) <223> CDRH2 of heavy chain varable region <400> 6 Trp Ile Gly Val Ile Ser Arg Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Pro Trp 1 5 10 15 Ala Lys <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Rabbit <220> <221> CHAIN <222> (1)..(16) <223> CDRH3 of heavy chain varable region <400> 7 Val Gly Asp Ser Gly Asn His Gly Tyr Ala Val His His Phe Asn Val 1 5 10 15 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Rabbit <220> <221> CHAIN <222> (1)..(10) <223> CDRL1 of light chain variable region <400> 8 Leu Ala Ser Glu Asn Val Tyr Arg Ser Val 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Rabbit <220> <221> CHAIN <222> (1)..(9) <223> CDRL2 oflight chain variable region <400> 9 Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Rabbit <220> <221> CHAIN <222> (1)..(15) <223> CDRL3 oflight chain variable region <400> 10 Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Pro Asn Leu Thr Phe Gly Ala Gly 1 5 10 15

Claims (12)

1. 다음을 포함하는 인산화 타이로신-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편:

   서열목록 제5서열로 이루어진 CDR(complementarity determining region)H1, 서열목록 제6서열로 이루어진 CDRH2 및 서열목록 제7서열로 이루어진 CDRH3 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역; 및

   서열목록 제8서열로 이루어진 CDRL1, 서열목록 제9서열로 이루어진 CDRL2 및 서열목록 제10서열로 이루어진 CDRL3 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 인산화 타이로신-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 인산화 타이로신-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 인산화 타이로신-특이적 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
7. 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 인산화 타이로신-특이적 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
9. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자; 및 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어져 있고, 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
11. 상기 제 9 항 또는 제 10 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
12. 상기 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항의 인산화 타이로신-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 인산화 타이로신 잔기 검출용 키트.

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