JP7041265B2 - 抗-ros1抗体およびその用途 - Google Patents
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Description
LCDR1:SGGSYGYG(配列番号1)、
LCDR2:DNTNRPS(配列番号2)、
LCDR3:GSADSSSIAT(配列番号3)、
HCDR1:GFSFSDRGMH(配列番号4)、
HCDR2:ISGDGYITHYGAAVKG(配列番号5)、および
HCDR3:XGGGNIDA(XはKまたはG)。
前記HCDR3は、配列番号6(KGGGNIDA)または配列番号13(GGGGNIDA)であり得、特に配列番号6(KGGGNIDA)でありうる。
軽鎖可変領域:LTQPSSVSANLGGTVKITC SGGSYGYG WYQQKAPGSAPATVIY DNTNRPS DIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQVEDEAVYYC GSADSSSIAT FGAGTTLTVL(配列番号7)、またはLTQPSSVSANLGGTVKITC SGGSYGYG WYQQKAPGSAPVTVIY DNTNRPS DIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQVEDEAVYYC GSADSSSIAT FGAGTTLTVL(配列番号23);および
重鎖可変領域:AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKAS GFSFSDRGMH WMRQAPGKGLEYVGA ISGDGYITHYGAAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCTR KGGGNIDA WGHGTEVIVSSTS(配列番号8)、またはAVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKAS GFSFSDRGMH WMRQAPGKGLEYVGA ISGDGYITHYGAAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCTR GGGGNIDA WGHGTEVIVSSTS(配列番号14)
(前記可変領域のアミノ酸配列中、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は順に下線で表す)。
(1)対象から分離した生物学的試料に前記抗-ROS1抗体またはその抗原結合断片を接触(反応)させる段階;および
(2)前記段階(1)の反応物で前記抗体または抗原結合断片と抗原(ROS1タンパク質)との間の抗原-抗体反応または抗原-抗体複合体の形成を確認する段階
を含む、癌の診断方法または癌の診断に情報を提供する方法を提供する。
(3)前記段階(1)の反応物で抗原-抗体反応が確認されたり抗原-抗体複合体の形成が確認(前記複合体が検出)された場合、前記対象が癌にかかったり癌にかかる恐れがと判断(または確認)する段階をさらに含みうる。
前記ROS1のエピトープと候補抗体または抗原結合断片を接触させる段階;および
前記ROS1のエピトープに結合する抗体または抗原結合断片を選別する段階
を含むROS1に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を製造する方法を提供する。
LCDR1:SGGSYGYG(配列番号1)、
LCDR2:DNTNRPS(配列番号2)、
LCDR3:GSADSSSIAT(配列番号3)、
HCDR1:GFSFSDRGMH(配列番号4)、
HCDR2:ISGDGYITHYGAAVKG(配列番号5)、および
HCDR3:GGGGNIDA(配列番号13)。
他の例は、上記した抗ROS1抗体のCDR(LCDR1(配列番号1)、LCDR2(配列番号2)、LCDR3(配列番号3)、HCDR1(配列番号4)、HCDR2(配列番号5)、およびHCDR3(配列番号6))、軽鎖可変領域(配列番号7または配列番号23)、重鎖可変領域(配列番号8または配列番号13)、およびscFv(配列番号24または配列番号26)からなる群より選ばれたポリペプチドを暗号化する核酸分子を提供する。
LCDR1:SGGSYGYG(配列番号1)、
LCDR2:DNTNRPS(配列番号2)、
LCDR3:GSADSSSIAT(配列番号3)、
HCDR1:GFSFSDRGMH(配列番号4)、
HCDR2:ISGDGYITHYGAAVKG(配列番号5)、および
HCDR3:XGGGNIDA(XはKまたはG)。
軽鎖可変領域:LTQPSSVSANLGGTVKITC SGGSYGYG WYQQKAPGSAPATVIY DNTNRPS DIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQVEDEAVYYC GSADSSSIAT FGAGTTLTVL(配列番号7)、または LTQPSSVSANLGGTVKITC SGGSYGYG WYQQKAPGSAPVTVIY DNTNRPS DIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQVEDEAVYYC GSADSSSIAT FGAGTTLTVL 配列番号23);および
重鎖可変領域: AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKAS GFSFSDRGMH WMRQAPGKGLEYVGA ISGDGYITHYGAAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCTR KGGGNIDA WGHGTEVIVSSTS(配列番号8)、またはAVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKAS GFSFSDRGMH WMRQAPGKGLEYVGA ISGDGYITHYGAAVKG RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCTR GGGGNIDA WGHGTEVIVSSTS(配列番号14)
(前記可変領域のアミノ酸配列中、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は順に下線で表す)。
(1)次の相補性決定部位(complementarity determining region;CDRs)を含む抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号1(SGGSYGYG)のアミノ酸配列を含むLCDR1、
配列番号2(DNTNRPS)のアミノ酸配列を含むLCDR2、
配列番号3(GSADSSSIAT)のアミノ酸配列を含むLCDR3、
配列番号4(GFSFSDRGMH)のアミノ酸配列を含むHCDR1、
配列番号5(ISGDGYITHYGAAVKG)のアミノ酸配列を含むHCDR2、および
配列番号6(KGGGNIDA)のアミノ酸配列を含むHCDR3;または
(2)次の可変領域を含む、抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
この場合、前記抗-ROS1抗体またはその抗原結合断片は、配列番号11(LDLGT)には結合し、配列番号12(IDLGT)には結合しないものであり得、このような特徴によってROS1タンパク質に特異的に結合するものでありうる。
(1)次の相補性決定部位(complementarity determining region;CDRs)を含む抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号1(SGGSYGYG)のアミノ酸配列を含むLCDR1、
配列番号2(DNTNRPS)のアミノ酸配列を含むLCDR2、
配列番号3(GSADSSSIAT)のアミノ酸配列を含むLCDR3、
配列番号4(GFSFSDRGMH)のアミノ酸配列を含むHCDR1、
配列番号5(ISGDGYITHYGAAVKG)のアミノ酸配列を含むHCDR2、および
配列番号13(GGGGNIDA)のアミノ酸配列を含むHCDR3;または
(2)次の可変領域を含む、抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
この場合、前記抗-ROS1抗体またはその抗原結合断片は、配列番号11(LDLGT)および配列番号12(IDLGT)に結合可能なものであり得、このような特徴によってROS1、Hsp70、Hsp71、GRP75、およびGRP78からなる群より選ばれた1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、または5種すべてに結合可能なものでありうる。
(1)対象(患者)から分離した生物学的試料に前記抗-ROS1抗体またはその抗原結合断片を接触(反応)させる段階;および
(2)前記段階(1)の反応物で前記抗体または抗原結合断片と抗原(ROS1タンパク質)との間の抗原-抗体反応の有無を確認する段階
を含む、癌の診断方法または癌の診断に情報を提供する方法を提供する。前記抗原-抗体反応の有無を確認する段階は、通常の方法により抗原-抗体複合体の形成の有無を確認(複合体を検出)する段階によって行われることができる。前記生物学的試料は対象(例えば、ヒトなどの哺乳類)から得た(分離した)細胞、組織、体液、これらの培養物などからなる群より選ばれたものでありうる。
(3)前記段階(1)の反応物で抗原-抗体反応が確認(例えば、抗原-抗体複合体の形成が確認(複合体が検出)された場合、前記対象が癌にかかったり癌にかかる恐れがあると判断(または確認)する段階をさらに含みうる。
前記ROS1のN-末端部位(例えば、上述したエピトープ)と候補抗体または抗原結合断片を接触させる段階;および
前記ROS1のエピトープに結合する抗体または抗原結合断片を選別する段階
を含むROS1に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を製造する方法を提供する。一具体例において、前記エピトープが配列番号10(DLGT)の場合、前記選別された抗体または抗原結合断片は、配列番号11(IDLGT)および配列番号12(IDLGT)に結合可能なものであり得、ROS1、Hsp70、Hsp71、GRP75、およびGRP78からなる群より選ばれた1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、または5種のすべてに結合可能なものでありうる。他の具体例において、前記エピトープが配列番号11(IDLGT)の場合、前記選別された抗体または抗原結合断片は配列番号11(IDLGT)には結合するが配列番号12(IDLGT)には結合しないものであり得、ROS1に特異的に結合するものでありうる。
LCDR1:SGGSYGYG(配列番号1)、
LCDR2:DNTNRPS(配列番号2)、
LCDR3:GSADSSSIAT(配列番号3)、
HCDR1:GFSFSDRGMH(配列番号4)、
HCDR2:ISGDGYITHYGAAVKG(配列番号5)、および
HCDR3:GGGGNIDA(配列番号13)。
他の例は、上記した抗ROS1抗体のCDR(LCDR1(配列番号1)、LCDR2(配列番号2)、LCDR3(配列番号3)、HCDR1(配列番号4)、HCDR2(配列番号5)、およびHCDR3(配列番号6))、軽鎖可変領域(配列番号7または配列番号23)、重鎖可変領域(配列番号8または配列番号13)、およびscFv(配列番号24または配列番号26)からなる群より選ばれたポリペプチドを暗号化する核酸分子を提供する。
keyhole limpet hemocyanin(Peptron;Daejun,S. Korea)に接合された合成ペプチド(TNLGQQLDLGTPHNLSEPGGGC(配列番号16);ROS1(GenBank Accession No.NP_002935.2)の39番目から56番目までのアミノ酸部位が「GGGC」と結合された融合ペプチド)で3匹の白色レグホン(White Leghorn)ニワトリを免疫化させて3回追加接種(boost)した。ニワトリ単鎖可変断片(single-chain variable fragment;scFv)抗体ライブラリーをディスプレイするファージを構築した[C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001参照]。ウシ血清アルブミン(BSA)または卵白アルブミン(ovalbumin;OVA)に接合された前記ROS1合成ペプチド(TNLGQQLDLGTPHNLSEPGGGC)に対してバイオパニング(biopanning)を5回行った後、前記scFv-ディスプレイファージに対してELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)を行った[C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; S. Park, D.H. Lee, J.G. Park, Y.T. Lee, J. Chung, A sensitive enzyme immunoassay for measuring cotinine in passive smokers, Clin. Chim. Acta 411 (2010) 1238-1242参照]。
次の文献を参照してELISA分析を行った:[H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43]。
マイクロタイタープレート(Costar,Cambridge,MA,USA)を100ngの組換えROS1(37-290アミノ酸)-Cκ融合タンパク質、irrelevant protein(組換えPSA(prostate cancer specific antigen;NP_001025218.1))-Cκ融合タンパク質、合成ペプチド(TNLGQQLDLGTPHNLSEPGGGC)-BSA接合体、またはGRP75(Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY,USA)をコーティング緩衝液(0.1 M sodium bicarbonate,pH8.6)に溶解させたコーティング溶液でコートした。ブロックした後、3B20-rFcまたは3B20-G1K(3B20のHCDR3の最初のアミノ酸GがKに置換)-rFc融合タンパク質を添加した。結合された抗体の量は、horseradish peroxidase(HRP)-接合された塩素抗-ウサギIgG抗体(Abcam,Cambridge Science Park,Cambridge,UK)および2,20-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt(ABTS)基質溶液(Amresco LLC,Solon,OH,USA)を使用して前記プレートに結合された抗体の量を測定した。すべての実験は3回ずつ行った。
pLenti6-human ROS1-DEST構造体を製作するために、Gateway組換えクローニング技術およびGateway LR Clonase TM(Thermo Fisher scientific)を用いて製造者の説明に従い、pENTR223.1-human ROS1(Open Biosystems,Huntsville,AL,USA)をpLenti6/V5-DEST(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)レンチウイルスベクターに導入させた。陰性対照群ウイルスを製造するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)を同じレンチウイルスベクターにクローニングした。
次の文献を参照して免疫ブロット分析を行った:[H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43]。
4-12%(w/v) Bis-Tris sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE;Thermo Fisher scientific)を使用して細胞溶解物を分離し、ニトロセルローズメンブレン(Whatman,Maidstone,Kent,UK)に移した。ブロックした後、前記メンブレンにプローブとして次の物質を固定化させた:3B20 scFv-rFc融合タンパク質(200 ng/mL)、3B20-G1K scFv-rFc融合タンパク質(1μg/mL)、抗-ROS1抗体(ab5512;Abcam、69D6;Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)または抗-チューブリン抗体(Santa Cruz,Dallas,TX,USA)。洗浄後、HRP-接合された抗-ウサギIgG抗体(Abcam)またはHRP-結合された抗-マウスIgG抗体(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,USA)とともに培養した。免疫ブロット結果はenhanced chemiluminescence system(Thermo Fisher Scientific)を使用して視覚化した。
次の文献を参照して免疫沈殿を行った:[H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43]。
ROS1またはGFPを過発現するHEK293T細胞株を1mM phenylmethane sulfonyl fluoride(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)、protease inhibitor cocktail(Roche)、およびphosphatase inhibitor cocktail(Roche)を含むcold lysis buffer [1% Triton X-100,150mM NaCl、50mM Tris(pH 8.0)]で溶解させた。前記得られた細胞溶解物をrFc融合タンパク質(5μg/mL)と融合した3B20 scFvまたは3B20 scFv-G1K、およびprotein A-conjugated agarose bead(RepliGen,Waltham,MA,USA)とともに培養した。洗浄後、NuPAGE LDS Sample Buffer(Thermo Fisher scientific)で沸かしてビードに結合されたタンパク質を溶出させ、SDS-PAGEと免疫ブロット(参照例4参照)を行った。SDS-PAGEにより分離した溶出タンパク質をCoomassie Brilliant Blue R250(Merck)で染色して視覚化した。SDS-PAGEゲルで約70kDaおよび260kDaに該当するタンパク質バンドを取って、MS(Mass spectrometry)分析を行った(参照例9参照)。
3B20 scFvのエピトープマッピングのために、アラニンスキャニング突然変異誘発分析(alanine scanning mutagenesis assay)を行った。ROS1(ROS1の37番目から290番目までのアミノ酸)をコーディングする遺伝子を鋳型として使用し、PCR増幅によってROS1の42番目(Gly)から54番目(Ser)までのアミノ酸残基の一つがアラニンに置換されたアミノ酸配列をコーディングする遺伝子を準備した。前記PCRは[Y. Lee, H. Kim, J. Chung, An antibody reactive to the Gly63-Lys68 epitope of NT-proBNP exhibits O-glycosylation-independent binding, Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114]を参照して行い、アラニン置換に使用されたプライマーとPCR条件は次のとおりである。先に、95℃で5分DNAの予備変性後、95℃で30秒のDNA変性、56℃で30秒のprimerの結合、72℃で30秒の伸張過程を30サイクル実行後、72℃で5分間インキュベーションした後終了した。
Forward primer(5’→3’):GGCCCAGGCGGCCTGTGTAACTAATCTG[GGC/CAG/CAG/CTT/GAC/CTT/GGC/ACA/CCA/CAT/AAT/CTG/AGT]GAACCGTGT(配列番号17);
reverse primer(5’→3’):GGCCGGCCTGGCCTTCCTCTTGTTGAACTGCTGA(配列番号18)
(前記Forward primerにおいて、括弧内のそれぞれのコドンのうちアラニンに置換されるアミノ酸残基のコドンはアラニンをコーディングするコドンであるGCCに置換される)。
HCDR3でのsite-directed mutagenesis libraryを生成するために、3B20 scFvをコーディングする遺伝子をPCR増幅によってdegenerate codon NNK(Nはそれぞれ独立してA,C,GまたはT;KはGまたはT)を使用してライブラリーを構築するための鋳型として使用した。最初の断片をforward primer(5’-CTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCC-3’;配列番号19)およびreverse primer(5’-TCTGGTGCAGTAGTAGGTGGC-3’;配列番号20)を使用してPCR増幅させ;二番目断片をforward primer(5’-GCCACCACTACTGCACCAGA[GGT/GGT/GGT/GGT/AAC/ATC/GAC/GCA]TGGGGCCAC-3’;配列番号21)およびreverse primer(5’-CGGGTATGCGCCATGGTGATGGTG-3’;配列番号22)を使用してPCR増幅させた(参照例6参照)。上記実験に使用されたPCR条件は次のとおりである。95℃で5分DNAの予備変性後、95℃で30秒のDNA変性、56℃で30秒primerの結合、72℃で30秒の伸張過程を30サイクル実行後、72℃で5分間インキュベーションした後終了された。
代表的なパラフィンワックスブロックを4mm厚さに切断し、自動化した免疫染色機(Ventana BenchMark XT,Tuscan,AZ,USA)を用いてIHCを行った。Ventana CC1 mild reagentで熱-誘導エピトープ回復を適用し、3% H2O2を使用して10分間内在的ペルオキシダーゼ(endogenous peroxidase)をブロッキングした。スライドを3B20-G1K-rFc融合タンパク質(300μg/ml stock;1:100希釈)と共に1時間インキュベーションした。diaminobenzidine tetrachlorideを使用して視覚化した。
SDS-PAGEゲル(参照例5)で約70kDaおよび260kDaのタンパク質バンドを切り出してin-gel tryptic digestionを行った[A. Shevchenko, H. Tomas, J. Havlis, J.V. Olsen, M. Mann, In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes, Nat. Protoc. 1 (2006) 2856‐2860参照]。切り出したタンパク質バンドを脱染させて(destained)、20mM dithiothreitolで還元させた後、55mM iodoacetamideでアルキル化させた。acetonitrile(ACN)で脱水させた後、タンパク質を12.5ng/μl変形トリプシン(Promega,Madison,WI,USA)(in 50mM ammonium bicarbonate)で37℃で一晩反応させて分解させた。50%(v/v) ACN(in 0.1%(v/v)ギ酸(FA))を使用してゲルスライスからペプチドを抽出した。得られた溶出物をCentrivap concentrator(Labconco,Kansas City,MO,USA)で乾燥させた。抽出されたペプチド試料を水に0.1%ギ酸(in water)に懸濁させ、EASY-Spray C18カラム(75μm x 50cm x 2μm)上にロードし、65分間300nL/minの流速で0.1%ギ酸(in acetonitrile)の2-35%勾配で分離した。MSスペクトルはnano-ultra-HPLC system(Easy-nLC1000;Thermo Scientific)でインターフェースされたQ-Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer(Thermo Fisher Scientific)に記録した。得られたMS/MS rawファイルはTrans-Proteomic Pipeline(version 4.4)を用いてmzXMLファイルに変換させ、SORCERER(Sage-N Research,Milpitas,CA,USA) platformでSeq
uest(version 27) algorithmを用いて分析した。International Protein Index human database(version 3.83,186578 entries)を用いて検索を行った。Full trypsin-sensitive specificityおよび2個までの誤切断部位(missed cleavage sites)が許容可能であった。precursor ionsおよびfragment ionsに対する質量許容誤差(Mass tolerances)はそれぞれ10ppmおよび1Daに設定した。通常のcarbamidomethyl-cysteineのためのfixed modificationおよびメチオニン酸化のためのvariable modificationsが使用された。Scaffold(version 4.3.2;Proteome Software,Portland,OR,USA)を使用し、99%以上のProteinProphet probability(with a minimum of three peptides)を有し、95%以上のPeptideProphet probabilityを有するすべてのタンパク質を確認した。
1.6x1010のcomplexityとしてROS1合成ペプチド(TNLGQQLDLGTPHNLSEPGGGC,amino acids 39-56 of ROS1)に対して免疫化したニワトリを使用してscFvライブラリーのファージディスプレイを生成した。バイオパニングにより、前記ライブラリーのうち、組換えN-末端ROS1(amino acids 37-290)-Cκ融合タンパク質およびROS1合成ペプチドのすべてに反応性を示すクローンである3B20を選択した。組換え3B20 scFv-rFc融合タンパク質を製造し、組換えROS1タンパク質に対する反応性をELISAにより評価した。
3B20 scFvのエピトープをさらに確認するために、ROS1タンパク質のアミノ酸残基37-290に相応する組換えROS1タンパク質を使用してアラニンスキャニング突然変異誘発分析を行った。まず、参照例6で説明されたように組換えROS1タンパク質のGly42~Ser54のいずれか一つのアミノ酸残基がアラニンに置換されたROS1突然変異を製造した。マイクロタイタープレートウェルを3B20 scFv-Cκ融合タンパク質、BSAまたはirrelevant scFv-Cκ融合タンパク質でコートした後、プレートをアラニン置換されたROS1-hFc融合タンパク質または野生型ROS1-hFc融合タンパク質と共にインキュベーションした。プレートに結合されたROS1-hFc融合タンパク質の量をHRP-接合抗-hFc抗体およびATBS溶液を使用して測定した。得られた結果を図2A(3B20 scFv-Cκ融合タンパク質コーティング)、2b(BSAコーティング)および2c(irrelevant scFv-Cκ融合タンパク質コーティング)に示した。
前記実施例2の結果に基づいて、Hsp70に反応しないが、ROS1に反応する単クローン抗体クローンを生成するために、参照例7に記載された方法によりHCDR3 site-directed mutagenesis libraryを製作した。3B20 scFvのHCDR3領域(GGGGNIDA)は、8個のアミノ酸からなっており、、HCDR3のすべてのアミノ酸位置それぞれにNNK(Nはそれぞれ独立してA,C,G、またはT;KはGまたはT)コドンを含むように設計されたPCRプライマーを使用し、8個のNNKファージディスプレイライブラリーを構築した(参照例7参照)。各ライブラリーで無作為に48個のクローンを選択して組換えROS1およびGRP75に対してファージELISAを行った。最初のアミノ酸残基無作為ライブラリーでROS1にのみ反応し、GRP75には反応しないmAbクローンを発見した。配列分析結果、3B20 scFvのHCDR3領域の一番目のアミノ酸残基であるグリシン(G)がリジン(K)に置換されていることを確認した。前記発見されたmAbクローンは3B20-G1Kと命名した。3B20-G1KのCDRおよび可変領域のアミノ酸配列を次の表3に整理した
3B20-G1Kの特異性をテストするために、組換え3B20-G1K scFv-Cκ融合タンパク質を製造した。前記製造された融合タンパク質に対してELISA、免疫ブロットおよび免疫沈殿分析を3B20と並行して行った。より具体的には、マイクロタイタープレートウェルを100ngの組換えROS1(アミノ酸37-290)-Cκ融合タンパク質またはirrelevantタンパク質-Cκ融合分子でコートした。遮断後、3B20-rFc融合タンパク質または3B20-G1K-rFc融合タンパク質を0~2000ng/mlの濃度でウェルに添加し、ウェルに結合された融合タンパク質の量をHRP-接合抗-ウサギIgG抗体およびABTS溶液を使用してELISAにより測定した。得られた結果を図3A(3B20-rFc融合タンパク質)および3b(3B20-G1K-rFc融合タンパク質)にそれぞれ示した。図3Aおよび3bに示すように、ELISA分析結果、3B20-G1Kは2μg/mLの高濃度でもGRP75と反応せず、ROS1にのみ反応したが、3B20は50ng/mL以上の濃度でGRP75と反応することが観察された。
全長野生型ROS1の検出において3B20-G1K scFvの適用可能性を評価するために、参照例8に記載された方法により、ヒトROS1(full-length)をコーディングするレンチウイルスベクターで形質転換されたHEK293T細胞(陽性対照群)、ヒト肺腺癌(human lung adenocarcinoma)組織(n=100)(ソウル特別市ボラメ病院提供)、およびヒトNon-neoplastic lung tissue(Benign bronchial epitheliaおよびalveolar pneumocytes)(ソウル特別市ボラメ病院提供)に対して免疫組織化学法(IHC)を行い、その結果を図4に示した。
Claims (18)
- ROS1タンパク質の39番目から56番目までの領域(配列番号15)内の、配列番号11を含む連続する5個以上のアミノ酸または配列番号10を含む連続する4個以上のアミノ酸からなる部位に結合することを特徴とする、抗ROS1抗体またはその抗原結合断片であって、
次の相補性決定部位(complementarity determining region;CDRs)を含む、抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号1(SGGSYGYG)のアミノ酸配列を含むLCDR1、
配列番号2(DNTNRPS)のアミノ酸配列を含むLCDR2、
配列番号3(GSADSSSIAT)のアミノ酸配列を含むLCDR3、
配列番号4(GFSFSDRGMH)のアミノ酸配列を含むHCDR1、
配列番号5(ISGDGYITHYGAAVKG)のアミノ酸配列を含むHCDR2、および
配列番号6(KGGGNIDA)または配列番号13(GGGGNIDA)のアミノ酸配列を含むHCDR3。 - 配列番号7または配列番号23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
配列番号8または配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、請求項1に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。 - 次の通り定義される、請求項1に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
(1)次の相補性決定部位(complementarity determining region;CDRs)を含む抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号1(SGGSYGYG)のアミノ酸配列を含むLCDR1、
配列番号2(DNTNRPS)のアミノ酸配列を含むLCDR2、
配列番号3(GSADSSSIAT)のアミノ酸配列を含むLCDR3、
配列番号4(GFSFSDRGMH)のアミノ酸配列を含むHCDR1、
配列番号5(ISGDGYITHYGAAVKG)のアミノ酸配列を含むHCDR2、および
配列番号6(KGGGNIDA)のアミノ酸配列を含むHCDR3;または
(2)次の可変領域を含む、抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。 - 前記抗ROS1抗体またはその抗原結合断片は、配列番号11(LDLGT)には結合し、配列番号12(IDLGT)には結合しないことを特徴とする、請求項3に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗ROS1抗体またはその抗原結合断片は、ROS1タンパク質に特異的に結合するものである、請求項3に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。
- 次の通り定義される、請求項1に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
(1)次の相補性決定部位(complementarity determining region;CDRs)を含む抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号1(SGGSYGYG)のアミノ酸配列を含むLCDR1、
配列番号2(DNTNRPS)のアミノ酸配列を含むLCDR2、
配列番号3(GSADSSSIAT)のアミノ酸配列を含むLCDR3、
配列番号4(GFSFSDRGMH)のアミノ酸配列を含むHCDR1、
配列番号5(ISGDGYITHYGAAVKG)のアミノ酸配列を含むHCDR2、および
配列番号13(GGGGNIDA)のアミノ酸配列を含むHCDR3;または
(2)次の可変領域を含む抗ROS1抗体またはその抗原結合断片:
配列番号23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;および
配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。 - 前記抗ROS1抗体またはその抗原結合断片は、配列番号11(LDLGT)および配列番号12(IDLGT)に結合可能であることを特徴とする、請求項6に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗ROS1抗体またはその抗原結合断片は、ROS1タンパク質、Hsp70、Hsp71、GRP75、およびGRP78からなる群より選ばれた1種以上に結合可能なものである、請求項7に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗ROS1抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項1ないし8のいずれか一項に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗原結合断片は、前記抗ROS1抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFvが免疫グロブリンのFcと融合した融合ポリペプチド、またはscFvが軽鎖の不変領域と融合した融合ポリペプチドである、請求項1ないし8のいずれか一項に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1ないし8のいずれか一項に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片を含む、癌診断用薬学組成物。
- 前記癌は肺癌である、請求項11に記載の組成物。
- 次のアミノ酸配列を暗号化する核酸:
配列番号1を含むLCDR1のアミノ酸配列、配列番号2を含むLCDR2のアミノ酸配列、配列番号3を含むLCDR3のアミノ酸配列、配列番号4を含むHCDR1のアミノ酸配列、配列番号5を含むHCDR2のアミノ酸配列、および配列番号13を含むHCDR3のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
配列番号1を含むLCDR1のアミノ酸配列、配列番号2を含むLCDR2のアミノ酸配列、配列番号3を含むLCDR3のアミノ酸配列、配列番号4を含むHCDR1のアミノ酸配列、配列番号5を含むHCDR2のアミノ酸配列、および配列番号6を含むHCDR3のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
配列番号23を含む軽鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号14を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
配列番号7を含む軽鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号8を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、または
配列番号24または配列番号26のアミノ酸配列。 - 請求項13に記載の核酸を含む、組換えベクター。
- 請求項14に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
- 請求項15に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、抗ROS1抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
- (1)患者から分離した生物学的試料に請求項1ないし8のいずれか一項に記載の抗ROS1抗体またはその抗原結合断片を接触させる段階;および
(2)前記段階(1)の反応物で抗原-抗体反応の有無を確認する段階
を含む、癌の診断に情報を提供する方法。 - 前記癌は肺癌である、請求項17に記載の方法。
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