KR20130054745A

KR20130054745A - 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도

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Publication number: KR20130054745A
Application number: KR1020110120317A
Authority: KR
Inventors: 김보규; 김경아; 이승현; 정광호; 정윤주
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-05-27
Also published as: US8501917B2; KR101844479B1; US20130129731A1

Abstract

항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물 및 세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하면, 세포 이동을 증진시켜 상처 치료 또는 조직 재생에 효율적으로 사용될 수 있으며, 세포 증식을 효율적으로 촉진시킬 수 있다.

Description

항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도{Anti c-Met antibody and uses thereof}

항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물 및 세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다.

c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 RTK(Receptor Tyrosine Kinase)로써 그 리간드인 HGF(Hepatocyte Growth Factor)와 결합하여 세포내 신호전달을 유도하여 세포의 성장을 촉진시킨다. 현재까지 연구된 바에 의하면, c-Met은 간 뿐만 아니라 기관이 손상될 경우 폐, 신장, 심장, 장 점막, 피부 등의 다양한 인간 조직에서 발견된다. 따라서, c-Met은 이들 조직의 손상 후 재생에 관련되어 있다고 알려져 있다. 간 조직의 경우, 암, 간 경화 등의 질환에 따른 간 절제술이나 간 손상 후 간 조직 재생을 촉진시킬 수 있다. 신장에서도 암, 감염, 결석, 신동맥 협착 등의 이유로 단순, 부분 신장 절제술 시행 후 신장 조직 재생을 촉진시킬 수 있으며, 화상, 욕창, 피부 궤양에 따른 피부 손상에서도 피부 조직 재생에 기여할 수 있다. 또한, 심근경색 등에 의한 심장 조직 손상의 재생에도 기여할 수 있다.

한편, c-Met은 암 발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 형성뿐 아니라 다양한 종류의 세포 성장에도 광범위하게 관여하고 있다. c-Met은 성장인자인 HGF와의 결합에 의해 간, 신장, 심장 세포 등의 정상 조직 세포의 재생, 성장 촉진뿐만 아니라 줄기세포의 성장, 세포 증식을 촉진시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.

일 양상은 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

다른 양상은 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 제공한다.

다른 양상은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 제공한다.

용어, "c-Met" 또는 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정, 세포 이동, 세포 증식 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 단일클론항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 c-Met은 인간, 원숭이, 마우스 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 c-Met으로부터 유래된 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 항 c-Met 항원 또는 그의 항원 결합 단편은 인간의 c-Met 뿐만 아니라, 마우스 c-Met에 대한 결합력이 우수하므로, 상기 항원 또는 항원 결합 단편은 이를 포함하는 약학적 조성물의 개발을 위한 동물 실험에 적용하는데 매우 유리할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또 다른 양상은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 항 c-Met 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.

또한, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 치환을 포함한다. 상기 항 c-Met 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또 다른 양상은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "벡터(vectror)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, p_L _λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 상기 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 발현할 수 있는 벡터는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환 (co-transfomation) 및 표적 형질전환 (targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

또 다른 양상은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물에 의해 재생될 수 있는 조직은 간 조직, 폐 조직, 신장 조직, 심장 조직, 장 점막 조직 또는 피부 조직일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 조성물이 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 상처를 치료하거나 또는 조직을 재생하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 c-Met 단백질의 작용제(agonist)일 수 있다.

용어 "작용제(agonist)"는 표적물질(예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 활성화, 유도시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "작용제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성을 유도시키거나 증가시키는 항체를 의미한다. 작용제는 리간드에 대한 수용체의 결합에 의해, 수용체 인산화(phosphorylation)를 증가시키거나, 리간드에 의해 불활성화되었던 세포를 활성화시키거나, 또는 성장시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 작용제는 수용체-리간드 사이의 상호 작용을 완전히 활성화시키거나, 수용체의 3차 구조의 변화, 또는 증가 조절(up regulation)에 의해 상기 상호 작용을 실질적으로 증가시킬 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질의 작용제 역할을 함으로써, 세포 증식을 촉진시키고, 세포 이동을 증진시켜 상처 치료 또는 조직 재생에 관여할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있으며, 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 c-Met 단백질의 작용제(agonist)일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질의 작용제 역할을 함으로써, 세포 증식을 촉진시킬 수 있으므로, 세포 증식 촉진용 조성물로 이용될 수 있다. c-Met은 줄기 세포의 형성 및 유지에 관여한다는 것이 최근 밝혀진 바 있다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 14;108(24):9951-6). 따라서, 상기 조성물은 줄기 세포 유지와 세포 수 증가를 위해 사용하는 배양액에 첨가될 수 있다. 또는, c-Met을 표면에 발현하는 단백질 생산 세포주(예를 들어. CHO, HEK293 등)의 세포 증식을 촉진시킴으로써, 상기 세포주에서 발현되는 단백질의 수율을 높이는 데에도 사용될 수 있다.

일 구체예에 따른 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하면, 세포 이동을 증진시켜 상처 치료 또는 조직 재생에 효율적으로 사용될 수 있으며, 세포 증식을 효율적으로 촉진시킬 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체의 이종간 인지력을 나타낸 ELISA 결과 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체의 Akt의 인산화 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체의 Akt의 인산화 정도 및 ERK의 인산화 정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 4는 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체를 처리하여 일차 간세포의 세포수를 확인한 결과이다.
도 5는 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체를 처리하여 HUVEC의 이동을 확인한 결과이다.
도 6은 일 구체예에 따른 항 c-Met 항체를 처리하여 세포 이동의 정도를 확인한 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: c- Met 에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 스크리닝 및 항 c- Met 항체의 생산

바이오 패닝은 비드 패닝 방법을 사용하였다. 구체적으로, 스트렙트아비딘이 표면에 고정된 마그네틱 비드(Invitrogen)와 비오틴을 결합시킨 c-Met 항원(R&D systems)을 혼합한 다음, 4℃에서 18 시간 동안 교반시켜 상기 항원을 비드 표면에 고정하였다. 상기 항원이 고정화된 마그네틱 비드를 탈지유(skim milk)로 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 상기 항원이 컨쥬게이트된 비드를 10¹⁸ 정도의 다양성을 갖는 파지 디스플레이 폴리펩티드 라이브러리를 포함하는 용액을 넣어 주었다. 상기 결과물을 2시간 동안 교반시키면서 반응시킨 후, 상기 항원과 결합한 파지만을 분리하였다. 이 방법은 항원만 컨쥬게이트된 비드와 항원-파지 결합된 비드의 분리가 아닌 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용한 세척 과정을 통하여 비결합된 파지를 제거하는 것이다. 세척 과정 후 elution buffer(0.2M Glycine-HCl, pH 2.2)를 처리하여 항원과 파지를 떨어뜨리고 다시 마그네틱 바를 이용하여 비드에서 분리된 파지를 획득하는 방식이다. 상기 분리된 파지는 E. coli에 트랜스펙션시켜 증폭시킨 후, 패닝 과정을 반복하였다. 상기 패닝 과정의 첫번째 과정에서는 인간 c-Met을 컨쥬게이션시킨 비드를 사용하여 인간 c-Met과 결합하는 폴리펩티드를 선별하였고, 다음으로, 마우스 c-Met을 컨쥬게이션시킨 비드를 사용하여 상기 1차 선별된 폴리펩티드 중 마우스 c-Met와 결합하는 항체를 선별하였으며, 이후, 다시 인간 c-Met을 컨쥬게이션시킨 비드를 사용하여 인간 c-Met과 결합하는 폴리펩티드를 선별하였다. 상기와 같은 바이오 패닝 방법을 통해 인간 또는 마우스 c-Met 모두 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 이후 항체 제작시 항체의 최적화 및 친화도 성숙 과정(affinity maturation) 또한 동시에 수행 할 수 있었다. 항체의 최적화 및 친화도 성숙 과정은 선별된 항체의 중쇄와 인간 경쇄 라이브러리와의 셔플링(shuffling)을 통해 친화도를 높이는 과정이다. 이는 선별된 항체의 중쇄를 고정시키고 인간 경쇄 라이브러리를 이용하여, Fab 라이브러리를 제작하고, 상기 제작된 Fab 라이브러리로부터 증폭된 파지로 패닝을 진행하고, 선별된 항체에서 친화도가 높은 항체를 선별하는 과정을 거쳐 이루어진다.

상기 바이오 패닝 과정을 통해 얻은 c-Met에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 확보하였으며, 이들 폴리펩티드 서열은 하기 표 1과 같다. 이후, (주)아이지세라피에 위탁하여 하기 표 1에 개시된 폴리펩티드(CDR 서열)로부터 c-Met 항체를 제작하였으며, 상기 제작된 항체를 IGTML4-4로 명명하였다.

	CDR1	CDR2	CDR3
IGTML4-4 항체의 중쇄 CDR 서열	MYVMT(서열번호 1)	EISASGASTYYADSVKG(서열번호 2)	AYRYGMDV(서열번호 3)
IGTML4-4 항체의 경쇄 CDR 서열	RASQNIGSWLA(서열번호 4)	RASNLRS(서열번호 5)	QQATIFP(서열번호 6)

실시예 2: IGTML4 -4 항체의 이종간 인지력 확인

실시예 1에서 제조된 c-Met 단백질에 대한 항체 IGTML4-4는 인간 c-Met 뿐만 아니라, 마우스의 c-Met도 인지하므로, 이를 확인하기 위해 ELISA 방법을 이용하였다.

인간과 마우스의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 대조군으로는 EGFR/Fc 융합 단백질(R&D Systems), ErB2/Fc 융합 단백질(R&D Systems)을 사용하였다. IGTML4-4 항체를 각각 웰에 50 ng씩을 가하여 1시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBS-T 20) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-인간 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-human IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간과 마우스의 c-Met 단백질에 IGTML4-4 항체가 결합되는지를 판독하였다.

도 1에서 보는 바와 같이, IGTML4-4 항체는 인간 및 마우스의 c-Met을 모두 인지하고, 다른 RTK(receptor tyrosin kinase)인 EGFR이나 ErbB2는 인지하지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: IGTML4 -4 항체의 항원 친화력( affinity ) 분석

상기 실시예 1에서 제작된 IGTML4-4 항체의 c-Met 항원에 대한 친화력을 Biacore(GE healthcare)를 사용하여 측정하였다. CM5 칩 상에 각각의 항체를 약 100~200 RU만큼 고정시킨 후, 항원인 인간 c-Met 및 마우스 c-Met을 50 nM부터 0 nM까지의 농도 범위 내에서 서로 다른 8개의 농도로 30 ul/min의 속도로 주입하여, 하기 표 2와 같이 k_on 값과 k_off 값을 구하고, 이로부터 K_D 값을 계산하였다. IGTML4-4 항체는 인간 c-Met 및 마우스 c-Met 항원에 대하여 K_D 값이 1 nM 이하로 나올 정도로 높은 결합력을 나타내었다(표 2).

항원	k_on (1/Ms)	k_off (1/s)	K_D (nM)
인간 c-Met	4.71x10⁵	1.88x10^-4	0.398
마우스 c-Met	5.53x10⁵	1.68x10^-4	0.304

실시예 4: Caki -1 세포에서의 IGTML4 -4에 의한 c- Met 경로 활성화 실험

상기 실시예 1에서 제작된 IGTML4-4 항체에 대한 작용성(agonism) 정도를 비교하기 위하여, Caki-1 세포(한국 세포주 은행)를 사용하여, c-Met의 하류 신호 전달 및 세포 증식에 관계되는 지표인 Akt 단백질의 인산화 정도를 확인하였다. 음성 대조군으로는 마우스의 IgG를 사용하였으며, 작용제(agonist)로 잘 알려진 5D5 항체를 양성 대조군으로 사용하였다.

2 x 10⁵ 세포/ml 의 Caki-1 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 무혈청 상태에서 각각 5 ug/ml의 항체를 30분 동안 처리하였다. 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 PathScan phospho-AKT1 (Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit (Cell Signaling, cat.no　#7134S)를 이용하여 Akt 인산화 정도를 측정한 후 분석하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, IGTML4-4 항체는 5D5 대비 84%의 Akt 인산화를 일으키는 것으로 보아, IGTML4-4 항체는 c-Met의 작용제로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: HUVEC 에서의 IGTML4 -4에 의한 c- Met 경로 활성화 실험

상기 실시예 1에서 제작된 IGTML4-4 항체에 대한 작용성(agonism) 정도를 비교하기 위하여, 인간제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)(ATCC)를 사용하여, c-Met의 하류 신호 전달 및 세포 증식에 관계되는 지표인 Akt 단백질 또는 ERK 단백질의 인산화 정도를 확인하였다.

100 mm 컬처 디쉬에 EGM-2 Bulletkit (Lonza, cat.no #CC-3162)의 배양액으로 HUVEC을 배양시키고, HUVEC이 디쉬의 80%만큼 자란 것이 보이면, 무혈청 상태의 EBM 배양액 (Lonza, cat.no #CC-3121)에 5 ug/ml의 IGTML4-4 항체를 첨가한 용액으로 30분 동안 반응시킨 다음, 세포 추출물(cell extract)을 얻어 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

웨스턴 블롯팅 과정은 다음과 같다. 20 ug의 세포 추출물을 Novex NuPAGE Bis-Tris Electrophoresis System (Invitrogen)을 이용하여 분리한 후, Nitrocellulose membrane (Invitrogen, cat.no#LC2006)에 옮겼다. 3%의 탈지유(skim milk)로 1시간 블록킹 후 phospho-Akt(S473) (Cell Signaling, cat.no#9271L), Akt (Cell Signaling, cat.no#9272S), phospho-Erk(p44/42 T202/Y204) (Cell Signaling, cat.no#9106L), Erk(p44/42) (Cell Signaling, cat.no#9107S) 항체를 1:1000으로 희석하여 4℃에서 18시간 이상 반응시켰다. 이후, TBS-T 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 항체를 제거하고, 여기에 항체에 따라 염소 항-토끼 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-rabbit IgG-HRP) 또는 염소 항-마우스 IgG-호스래디휘 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, TBS-T 용액으로 충분히 세척 후 퍼옥시다제의 기질용액(Thermo Scientific Pierce ECL Western Blotting Substrate, cat.no#32106)을 가하여 발생하는 형광을 측정하여 발현 정도를 비교하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, IGTML4-4 항체 처리시 Akt 뿐만 아니라, ERK의 인산화도 증가함을 확인할 수 있었다. 항체를 처리하지 않은 경우와 IGTML4-4 항체를 처리한 경우, 모두 Akt와 ERK의 양에는 차이가 없었으나, 이들의 인산화 정도는 IGTML4-4 항체를 처리한 경우에만 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 6: IGTML4 -4 항체에 의한 일차 간세포( primary hepatocyte )의 증식 실험

c-Met과 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)의 결합은 일부 세포에서 그 성장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 성장 촉진은 세포 이동(migration)과 함께 상처 치료(wound healing)를 촉진시키는 요인이 된다고 볼 수 있다. IGTML4-4 항체가 c-Met의 작용제(agonist)로서 작용한다면, IGTML4-4 항체 처리시 일부 세포의 성장이 촉진될 것으로 기대할 수 있다. 따라서, IGTML4-4 항체 처리시 인간의 일차 간세포가 증식하는지 여부를 인 비트로(in vitro) 세포증식 분석법을 수행하였다.

96-웰 플레이트(well white plate, Corning, cat.no #3610)에 웰당 3 x 10⁴ 개의 일차 간세포 (Celsis, cat.no #F00995)를 100 ul의 InVitroGRO CP medium (plating) (Celsis, cat.no#Z99029)과 분주하고, 24시간 동안 배양한 후에 IGTML4-4 항체를 처리하지 않는 그룹은 InVitroGRO HI medium (Incubation) (Celsis, cat.no#Z99009)을 50 ul 넣어주고, IGTML4-4항체를 처리하는 그룹은 항체를 2, 0.4, 0.08, 0.016 ug/ml의 농도로 InVitroGRO HI medium (Incubation) (Celsis, cat.no#Z99009)에 희석하여 50 ul씩 넣어 주었다. 72시간 동안 배양한 후에 CellTiter-Glo luminescent cell viability assay kit(Promega, cat.no#G7570)를 사용하여 luminometer (PerkinElmer, 2104 multilabel reader)로 세포의 수를 정량하였다. 음성 대조군은 마우스의 IgG를 처리한 일차 간 세포를, 양성 대조군으로는 HGF를 처리한 일차 간세포를 사용하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, IGTML4-4 항체를 처리한 경우, 일차 간세포의 세포 수가 음성 대조군 대비 60%까지 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 c-Met의 리간드인 HGF와 유사한 정도로서, IGTML4-4 항체가 HGF와 같이 강력하게 c-Met을 촉진시켜 일차 간세포를 증식시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 7: IGTML4 -4 항체에 의한 HUVEC 의 상처 치료 효과 확인 실험

IGTML4-4 항체에 의한 c-Met의 활성화가 상처 치료에 영향을 주는지 알아보기 위해, HUVEC을 이용하여 상처 치료 어세이(wound healing assay)를 수행하였다.

상처 치료 어세이는 합류 상태의 세포(confluent cell)를 파이펫 팁으로 상처(scratch)를 내고 시간이 지남에 따라 상기 상처가 없어짐을 관찰함으로써, 세포 이동(cell migration)을 측정하는 방법이다.

6-웰 플레이트에 HUVEC 세포를 EGM 배양액(Lonza, cat.no #CC-3162)과 혼합하여 분주한 후, 세포가 웰의 95% 이상의 면적을 차지할 만큼 자란 것을 확인하고 각 웰의 배양액을 제거하였다. 세포를 PBS로 1회 세척 후 파이펫 팁으로 상처(scratch)를 내었다. 그리고 0, 2.5, 5, 10 μg/ml로 농도를 맞추어서 FBS 0.1% EBM 배양액(Lonza, cat.no#CC-3121)과 IGTML4-4 항체를 섞은 혼합물을 각 웰에 넣어주었다. 상처를 낸 직후와 12시간 배양 후의 상처의 상태를 현미경으로 관찰하고 사진을 촬영하여 그 차이를 Image analyzer software (Wimscratch Quantitative Wound Healing Image Analysis)를 이용하여 분석하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, IGTML4-4 항체를 처리한 경우 HUVEC의 이동이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 세포 이동은 항체의 처리 농도가 높아질수록 증가하여, 10 ug/ml 이상 처리한 경우에 포화(saturation)되는 것으로 확인되었다.

실시예 8: IGTML4 -4 항체에 의한 HUVEC 의 세포 이동 증가 확인 실험

IGTML4-4 항체에 의해 세포 이동이 증가되는지 여부를 확인하기 위해 xCelligence system(Roche)을 이용한 세포 이동 어세이(migration assay)를 수행하였다. 세포 이동 어세이에 사용된 기기는 xCelligence-RTCA DP system으로서, gold microelectrode array 위에 세포가 부착될 때 발생하는 임피던스(impedence)를 측정함으로서 세포의 숫자를 측정하는 기기이다. 세포 이동 어세이는 CIM-plate 16(Roche)을 사용하며 Boyden chamber와 같이 upper chamber와 lower chamber가 나뉘어 있어, upper chamber에는 세포를, lower chamber에는 2% FBS를 EBM 배양액(Lonza, cat.no #CC-3121)에 화학유인물질(chemoattractant)로서 첨가하여 실험하였다. Upper chamber의 세포는 8 um 포어를 통과하여 이동된 세포만이 임피던스를 발생시키는 구조이다.

도 6에서 'Cell Index'는 상기 임피던스 값을 상대적으로 나타낸 수치이다. 도 6에서 보는 바와 같이, IGTML4-4 항체 처리시 그 농도가 높아짐에 따라 세포의 이동이 촉진됨을 확인할 수 있었다. IGTML4-4 항체를 20 ug/ml 처리한 경우, 처리하지 않은 대조군 대비 약 70%의 세포 이동이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 9: IGTML4 -4 항체의 CDR 서열

IGTML4-4 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열은 상기 표 1에 나타낸 바와 같다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Anti-c-Met antibody and uses thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 sequence of heavy chain of IGTML4-4 antibody <400> 1 Met Tyr Val Met Thr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 sequence of heavy chain of IGTML4-4 antibody <400> 2 Glu Ile Ser Ala Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 sequence of heavy chain of IGTML4-4 antibody <400> 3 Ala Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Val 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 sequence of light chain of IGTML4-4 antibody <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 sequence of light chain of IGTML4-4 antibody <400> 5 Arg Ala Ser Asn Leu Arg Ser 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 sequence of light chain of IGTML4-4 antibody <400> 6 Gln Gln Ala Thr Ile Phe Pro 1 5 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of heavy chain variable region of IGTML4-4 antibody <400> 7 Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Ala Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of IGTML4-4 antibody <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Thr Ile Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of heavy chain variable region of IGTML4-4 antibody <400> 9 caggtgcagc tgttgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctaagagtc 60 tcctgtgcag cctctggatt caggtttagt atgtatgtca tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagaa ataagtgcta gcggtgcgag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatg tccagagaca attccaagaa tacggtgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtct attactgtgc aagagcctat 300 aggtacggta tggacgtctg gggccaagga accatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 10 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain variable region of IGTML4-4 antibody <400> 10 gatattgtga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 ctcacttgtc gggcgagtca gaatattggc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggtaacgccc ctaagttgtt gatctataga gcatccaatt tgcgaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggctc tgggacagat ttcactctta ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatttcg caacttactt ttgtcaacag gctaccattt tccctctcac tttcggcgga 300 gggacccggg tggatatcaa acgt 324

Claims

서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 c-Met은 인간, 원숭이, 마우스 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 c-Met으로부터 유래된 것인 항 c-Met 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체인 것인 항 c-Met 항체.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체의 항원 결합 단편.
제5항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항원 결합 단편.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체는 c-Met 단백질의 작용제(agonist)인 것인 약학적 조성물.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물.
서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 c-Met 항체를 포함하는 세포 증식 촉진용 조성물.
제17항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포 증식 촉진용 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 항체는 c-Met 단백질의 작용제(agonist)인 것인 세포 증식 촉진용 조성물.