JP5749493B2 - eIF4EおよびeIF4Eレギュロン活性のための質量分析アッセイ - Google Patents
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Description
本願は、2007年11月6日に出願された米国仮特許出願第60/985,787号への優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に明確に参考として援用される。
質量分析は、小分子のためのロバストなアッセイプラットフォームとして十分に確立されているが、タンパク質およびペプチドの探索研究ツールとしかみなされないことが多い。これは一部には、質量分析に基づくアッセイの処理量が限られているためであり、また大部分の標的ペプチドおよびタンパク質に関して、特に標的分子の濃度が低い場合には、多くの試料処理を必要とするためである。もしこの制限を克服することができれば、質量分析に基づくアッセイは抗体に基づくアッセイと比較して利点を有する。例えば、ペプチドに対する抗体を作製するために何カ月もかかることに比べて、標的タンパク質のアミノ酸配列が公知である場合、参照ペプチドの合成を数日以内で行うことができる。参照ペプチドが入手できれば、標的ペプチドを測定するための質量分析条件の設定は1週間とかからない。複数回の試薬作製および評価を伴う場合、質量分析に基づくアッセイおよび抗体に基づくアッセイを設定する時間の差はさらに大きくなる可能性がある。これらの利点にもかかわらず、分析前に標的を濃縮する必要があるため、多くの標的タンパク質は質量分析の適用範囲外である。最もよく使用される標的濃縮方法は抗体の使用であるが、所望の抗体が既に入手可能でない限り、これは質量分析に基づくアッセイの利点を無効にする。
少なくとも1つの標的タンパク質の単一試料の多重分析、ならびに特定の実施形態においては少なくとも1つの標的タンパク質のリン酸化状態の同時分析を提供する、高感度ハイスループット質量分析に基づく定量アッセイが提供される。質量分析に基づくアッセイは、標的タンパク質(複数可)の濃縮方法を利用し、これにより抗体を使用せずに高感度なハイスループットアッセイの構築が可能となる。このアッセイは、4Eおよび4Eレギュロン成分レベルおよびリン酸化状態を検出するように適合させることができ、適合された場合、4E/4Eレギュロン生物学的経路の初の単一試料分析方法となる。
(1) 単一試料中の少なくとも1つの標的タンパク質またはペプチドのレベルおよび/またはリン酸化状態を同時に決定するための方法であって、
(a)各標的タンパク質に対応する少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドを該試料に添加するステップと、
(b)尿素を使用せずに、該試料中の該少なくとも1つの標的タンパク質またはペプチドを還元およびアルキル化するステップと、
(c)該試料を少なくとも1つのプロテアーゼと接触させることによって、該少なくとも1つの標的タンパク質および該少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドを消化するステップと、
(d)質量分析に基づく方法によって該消化断片を分析するステップと、
(e)該断片の分析結果を使用して、該少なくとも1つの標的タンパク質またはペプチドのレベルおよび/またはリン酸化状態を決定するステップと
を含む方法。
(2) 前記少なくとも1つの標的タンパク質が4Eまたは4Eレギュロン成分である、項目1に記載の方法。
(3) レベルおよび/またはリン酸化状態が決定される標的タンパク質またはペプチドが少なくとも2つ存在する、項目1に記載の方法。
(4) 前記少なくとも1つの標的タンパク質が4Eであり、4Eのレベルおよび/またはリン酸化状態が、498Daの親質量を有する断片WALWFFKの分析に少なくとも部分的に基づいて決定される、項目1に記載の方法。
(5) 前記決定において使用される親質量からの遷移が498→740、498→627および498→371である、項目4に記載の方法。
(6) 前記少なくとも1つの標的タンパク質が4Eレギュロン成分であり、eIF4E(gi:54873625);サイクリンD1(gi:77628152);NBS/ニブリン(gi:67189763);Pim−1(gi: 31543400);サイクリンB1(gi:34304372);サイクリンA2(gi:16950653);ODC(gi:4505488);VEGF(gi:71051577);Skp2(gi:16306594、16306593);サイクリンE1(gi:17318558);c−myc(gi:71774082);FGF2(gi:153285460);MMP−9(gi:74272286);mdm2(gi:46488903);カスパーゼ−9(gi:14790123、14790127);bcl2(gi:72198188、72198345);Bcl/xL(gi:20336334);Fbox1(gi:16306583);CGGbp1(gi:56550052);P54nrb/NONO.1(gi:34932413);セレノプロテイン S(gi:45439347);eIF4E−BP1(gi:117938308);Akt1(gi:62241012、62241010、62241014);PI3K(gi:54792081、212377724);GSK3B(gi:21361339);HuR(gi:38201713);およびmTOR/FRAP1(gi:19924298)からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(7) 前記少なくとも1つの標的タンパク質が4Eレギュロン成分であり、4E、4E−BP1、NBS/ニブリン、Pim−1、VEGF、サイクリンD1、サイクリンA2、ODC AktおよびHuRからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(8) 前記質量分析に基づく方法がLC−MS/MSである、項目1に記載の方法。
(9) 項目1から7のいずれか一項に記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
(10) 使用説明書をさらに含む、項目9に記載のキット。
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されている特定の用語をここにまとめる。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
eIF4E(gi:54873625)(NP_001959、NP_001959.1);CyclinD1(gi:77628152)(NP_444284、NP_444284.1);NBS/ニブリン(Nibrin)(gi:67189763)(NP_002476、NP_002476.2);Pim−1(gi:31543400)(NP_002639、NP_002639.1);サイクリン(Cyclin)B1(gi:34304372)(NP_114172、NP_114172.1);サイクリン(Cyclin)A2(gi:16950653)(NP_001228、NP_001228.1);ODC(gi:4505488)(NP_002530,NP_002530.1);VEGF(gi:71051577)(NP_003367、NP_003367.4);Skp2(gi:16306594,16306593)(NP_005974、NP_005974.2、NP_116026、NP_116026.1);サイクリン(Cyclin)E1(gi:17318558)(NP_001229、NP_001229.1);c−myc(gi:71774082)(NP_002458、NP_002458.2);FGF2(gi:153285460、gi:153285461)(NP_002006、NP_002006.4、NP_001997,NP_001997.5);MMP−9(gi:74272286)(NP_004985、NP_004985.2);mdm2(gi:46488903)(NP_002383、NP_002383.2);カスパーゼ(caspase)−9(gi:14790123、14790127)(NP_001220,NP_001220.2、NP_127463、NP_127463.1);bcl2(gi:72198188、72198345)(NP_000624,NP_000624.2、NP_000648、NP_000648.2);Bcl/xL(gi:20336334)(NP_612815,NP_612815.1);Fbox1(gi:16306583);CGGbp1(gi:56550052);P54nrb/NONO.1(gi:34932413);セレノプロテイン S(gi:33285002、gi:45439347)(NP_060915、NP_060915.2,NP_018445、NP_018445.4);eIF4E−BP1(gi:117938308)(NP_004086、NP_004086.1);Akt1(gi:62241012、62241010、62241014)(NP_001014431、NP_001014431.1、NP_005154,NP_005154.2、NP_001014432、NP_001014432.1);PI3K(gi:54792081、21237724)(NP_006209、NP_006209.2、NP_002640、NP_002640.2);GSK3B(gi:21361339)(NP_002084、NP_002084.2);HuRgi:38201714)(NP_001410,NP_001410.2);およびmTOR/FRAP1(gi:19924298)(NP_004949、NP_004949.1)からなる群から選択される。以下に記載されている方法の特定のものにおいて使用される好ましい4Eレギュロン成分(成分)は、4E、4E−BP1、NBS/ニブリン、Pim−1、VEGF、サイクリンD1、サイクリンA2、ODCおよびHuRである。好ましいレギュロン成分は、4Eレギュロン成分を含み、4E、4E−BP1、NBS/ニブリン、Pim−1、VEGF、サイクリンD1、サイクリンA2、ODC AktおよびHuRからなる群から選択される。
Claims (7)
- 試料中の標的タンパク質またはペプチドのセットのレベルおよび/またはリン酸化状態を同時に決定するための方法であって、
該標的タンパク質またはペプチドは、eIF4E(NP_001959.1)、HuR(NP_001410、NP_001410.2)、ならびに、以下:サイクリンD1(NP_444284,NP_444284.1);NBS/Nibrin(NP_002476.2);Pim−1(NP_002639,NP_002639.1);サイクリンB1(NP_114172.1);サイクリンA2(NP_001228,NP_001228.1);ODC(NP_002530,NP_002530.1);VEGF(NP_003367.4);Skp2(NP_005974.2,NP_116026.1);サイクリンE1(NP_001229.1);c−myc(NP_002458.2);FGF2(NP_001997.5);MMP−9(NP_004985.2);mdm2(NP_002383.2);カスパーゼ−9(NP_001220.2,NP_127463.1);bcl2(NP_000624.2,NP_000648.2);Bcl/xL(NP_612815.1);セレノプロテインS(NP_060915.2);eIF4E−BP1(NP_004086,NP_004086.1);Akt1(NP_001014432,NP_001014431.1,NP_005154.2,NP_001014432.1);PI3K(NP_006209.2,NP_002640.2);GSK3B(NP_002084.2);およびmTOR/FRAP1(NP_004949.1)からなる群より選択される少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分であり、該方法は:
(a)eIF4E、HuR、ならびにサイクリンD1、NBS/Nibrin、Pim−1、サイクリンB1、サイクリンA2、ODC、VEGF、Skp2、サイクリンE1、c−myc、FGF2、MMP−9、mdm2、カスパーゼ−9、bcl2、Bcl/xL、セレノプロテインS、eIF4E−BP1、Akt1、PI3K、GSK3B、およびmTOR/FRAP1からなる群より選択される該少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分の各標的タンパク質に対応する少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチド、を該試料に添加するステップと、
(b)eIF4E、HuRおよび該少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分の該標的タンパク質またはペプチド、ならびに該少なくとも3つの対応する内部標準タンパク質またはペプチドを断片化することによって、該eIF4E、該HuR、および該少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分、ならびに該少なくとも3つの対応する内部標準タンパク質またはペプチドの断片を生成するステップと、
(c)該対応する質量を分析し、そして該ステップ(b)から得られた断片の量を、質量分析に基づく方法によって決定するステップと、
(d)ステップ(c)からの結果を用いて、該eIF4E、該HuRおよび該少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分の標的タンパク質またはペプチドのレベルおよび/またはリン酸化状態を決定および定量するステップと
を含む方法。 - (a)前記少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分が、以下:サイクリンD1(NP_44284,NP_44284.1);NBS/Nibrin(NP_002476.2);Pim−1(NP_002639,NP_002639.1);サイクリンA2(NP_001228,NP_001228.1);ODC(NP_002530,NP_002530.1);VEGF(NP_003367.4);Skp2(NP_005974.2,NP_116026.1);サイクリンE1(NP_001229.1);MMP−9(NP_004985.2);カスパーゼ−9(NP_127463,NP_001220.2,NP_127463.1);Bcl/xL(NP_612815.1);eIF4E−BP1(NP_004086,NP_004086.1);Akt1(NP_001014432,NP_001014432.1,NP_005154.2,NP_001014431.1)からなる群より選択され;そして
(b)該少なくとも1つのeIF4Eレギュロン成分に対応する前記少なくとも1つの内部標準タンパク質またはペプチドは、サイクリンD1、NBS/Nibrin、Pim−1、サイクリンA2、ODC、VEGF、Skp2、サイクリンE1、MMP−9、カスパーゼ−9、Bcl/xL、eIF4E−BP1およびAkt1からなる群より選択される、
請求項1に記載の方法。 - 前記質量分析に基づく方法が液体クロマトグラフィー−質量選択/質量分析(LC−MS/MS)である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)において、断片化は、酸、塩基、臭化シアン、およびo−ヨード安息香酸からなる群より選択される化学薬剤;トロンビン、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群から選択される酵素またはプロテアーゼ;あるいは質量分析に基づく断片化方法の付加および/またはこれらへの曝露によって媒介される、請求項1に記載の方法。
- 前記断片化は、酵素またはプロテアーゼの付加および/または曝露によって媒介され、該酵素またはプロテアーゼは、トロンビン、トリプシンおよびキモトリプシンからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記酵素またはプロテアーゼはトリプシンである、請求項5に記載の方法。
- (a)eIF4Eのレベルおよび/またはリン酸化状態は、WALWFFK(配列番号2)、DGIEPMWEDEK(配列番号152)、IAIWTTECENR(配列番号153)、IVIGYQSHADTATK(配列番号154)、TESNQEVANPEHYIK(配列番号155)、MATVEPETTPTPNPPTTEEEK(配列番号156)、FWLETLLCLIGESFDDYSDDVCGAVVNVR(配列番号157)、およびFDTVEDFWALYNHIQLSSNLMPGCDYSLFK(配列番号158)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(b)HuRのレベルおよび/またはリン酸化状態は、DVEDMFSR(配列番号139)、FAANPNQNK(配列番号140)、VLVDQTTGLSR(配列番号141)、DANLYISGLPR(配列番号142)、FGGPVHHQAQR(配列番号143)、VSYARPSSEVIK(配列番号144)、SLFSSIGEVESAK(配列番号145)、NVALLSQLYHSPAR(配列番号146)、MSNGYEDHMAEDCR(配列番号147)、VAGHSLGYGFVNYVTAK(配列番号148)、TNLIVNYLPQNMTQDELR(配列番号149)、SEAEEAITSFNGHKPPGSSEPITVK(配列番号150)、およびGFGFVTMTNYEEAAMAIASLNGYR(配列番号151)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(c)サイクリン D1のレベルおよび/またはリン酸化状態は、ETIPLTAEK(配列番号102)、QAQQNMDPK(配列番号103)、SPNNFLSYYR(配列番号104)、AYPDANLLNDR(配列番号105)、AEETCAPSVSYFK(配列番号106)、LQLLGATCMFVASK(配列番号107)、HAQTFVALCATDVK(配列番号108)、IVATWMLEVCEEQK(配列番号109)、ACQEQIEALLESSLR(配列番号110)、MEHQLLCCEVETIR(配列番号111)、CEEEVFPLAMNYLDR(配列番号112)、WNLAAMTPHDFIEHFLSK(配列番号113)、FISNPPSMVAAGSVVAAVQGLNLR(配列番号114)、AAEEEEEEEEEVDLACTPTDVR(配列番号115)、およびLCIYTDNSIRPEELLQMELLLVNK(配列番号116)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(d)NBS/Nibrinのレベルおよび/またはリン酸化状態は、ISQENEIGK(配列番号49)、MLSQDAPTVK(配列番号50)、IPNYQLSPTK(配列番号51)、LQDDSEMLPK(配列番号52)、NTELEEWLR(配列番号53)、EESLADDLFR(配列番号54)、LSSAVVFGGGEAR(配列番号55)、ASQQQQTNSIR(配列番号56)、SGDGITFGVFGSK(配列番号57)、DTKPELEIDVK(配列番号58)、QEMEVQNQHAK(配列番号59)、DEENQEMSSCK(配列番号60)、NPSGINDDYGQLK(配列番号61)、WIQSIMDMLQR(配列番号62)、TSSNNNSMVSNTLAK(配列番号63)、NYCDPQGHPSTGLK(配列番号64)、TTTPGPSLSQGVSVDEK(配列番号65)、LPHIIGGSDLIAHHAR(配列番号66)、EMDDVAIEDEVLEQLFK(配列番号67)、IEYEPLVACSSCLDVSGK(配列番号68)、MDIETNDTFSDEAVPESSK(配列番号69)、QPPQIESFYPPLDEPSIGSK(配列番号70)、QGLRPIPEAEIGLAVIFMTTK(配列番号71)、IETSCSLLEQTQPATPSLWK(配列番号72)、TICALICGRPIVKPEYFTEFLK(配列番号73)、EQHLSENEPVDTNSDNNLFTDTDLK(配列番号74)、LMPSAPVNTTTYVADTESEQADTWDLSERPK(配列番号75)、およびTALNQAILQLGGFTVNNWTEECTHLVMVSVK(配列番号76)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(e)Pim−1のレベルおよび/またはリン酸化状態は、VSSGFSGVIR(配列番号34)、VPMEVVLLK(配列番号35)、VSDNLPVAIK(配列番号36)、LIDFGSGALLK(配列番号37)、VYSPPEWIR(配列番号38)、AAPCNDLHATK(配列番号39)、DENILIDLNR(配列番号40)、VSSECQHLIR(配列番号41)、DTVYTDFDGTR(配列番号42)、HCHNCGVLHR(配列番号43)、ISDWGELPNGTR(配列番号44)、SFFWQVLEAVR(配列番号45)、EPLESQYQVGPLLGSGGFGSVYSGIR(配列番号46)、SAAVWSLGILLYDMVCGDIPFEHDEEIIR(配列番号47)、およびLLDWFERPDSFVLILERPEPVQDLFDFITER(配列番号48)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(f)サイクリン A2のレベルおよび/またはリン酸化状態は、GLAQQQRPK(配列番号121)、FLSSMSVLR(配列番号122)、QPDITNSMR(配列番号123)、APQHAQQSIR(配列番号124)、MLGNSAPGPATR(配列番号125)、LQLVGTAAMLLASK(配列番号126)、QPAFTIHVDEAEK(配列番号127)、EDALAFNSAISLPGPR(配列番号128)、YHGVSLLNPPETLNL(配列番号129)、DLPVNDEHVTVPPWK(配列番号130)、AILVDWLVEVGEEYK(配列番号131)、LQNETLHLAVNYIDR(配列番号132)、VESLAMFLGELSLIDADPYLK(配列番号133)、TGYTLESLKPCLMDLHQTYLK(配列番号134)、FEEIYPPEVAEFVYITDDTYTK(配列番号135)、EAGSALLALQQTALQEDQENINPEK(配列番号136)、YLPSVIAGAAFHLALYTVTGQSWPESLIR(配列番号137)、およびVLTFDLAAPTVNQFLTQYFLHQQPANCK(配列番号138)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(f)サイクリン A2のレベルおよび/またはリン酸化状態は、GLAQQQRPK(配列番号121)、FLSSMSVLR(配列番号122)、QPDITNSMR(配列番号123)、APQHAQQSIR(配列番号124)、MLGNSAPGPATR(配列番号125)、LQLVGTAAMLLASK(配列番号126)、QPAFTIHVDEAEK(SEQID127)、EDALAFNSAISLPGPR(配列番号128)、YHGVSLLNPPETLNL(配列番号129)、DLPVNDEHVTVPPWK(配列番号130)、AILVDWLVEVGEEYK(配列番号131)、LQNETLHLAVNYIDR(配列番号132)、VESLAMFLGELSLIDADPYLK(配列番号133)、TGYTLESLKPCLMDLHQTYLK(配列番号134)、FEEIYPPEVAEFVYITDDTYTK(配列番号135)、EAGSALLALQQTALQEDQENINPEK(配列番号136)、YLPSVIAGAAFHLALYTVTGQSWPESLIR(配列番号137)、およびVLTFDLAAPTVNQFLTQYFLHQQPANCK(配列番号138)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(g)ODCのレベルおよび/またはリン酸化状態は、YFPSDSGVR(配列番号77)、INEVSSSDDK(配列番号78)、TLAATGTGFDCASK(配列番号79)、DAFYVADLGDILK(配列番号80)、FEEITGVINPALDK(配列番号81)、TEIQLVQSLGVPPER(配列番号82)、YYVASAFTLAVNIIAK(配列番号83)、YYSSSIWGPTCDGLDR(配列番号84)、YAANNGVQMMTFDSEVELMK(配列番号85)、MNNFGNEEFDCHFLDEGFTAK(配列番号86)、CVFDMGAEVGFSMYLLDIGGGFPGSEDVK(配列番号87)、およびELNIDVVGVSFHVGSGCTDPETFVQAISDAR(配列番号88)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(h)VEGFのレベルおよび/またはリン酸化状態は、AGEAEPSGAAR(配列番号89)、LFVQLLGCSR(配列番号90)、GAEESGPPHSPSR(配列番号91)、QENPCGPCSER(配列番号92)、HLFVQDPQTCK(配列番号93)、GQGPEPAPGGGVEGVGAR(配列番号94)、EEPQPEEGEEEEEK(配列番号95)、QTDTAPSPSYHLLPGR(配列番号96)、KPGSWTGEAAVCADSAPAAR(配列番号97)、WSQAAPMAEGGGQNHHEVVK(配列番号98)、IKPHQGQHIGEMSFLQHNK(配列番号99)、CGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMR(配列番号100)、およびASETMNFLLSWVHWSLALLLYLHHAK(配列番号101)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(i)eIF4E−BP1のレベルおよび/またはリン酸化状態は、AGGEESQFEMDI(配列番号117)、MSGGSSCSQTPSR(配列番号118)、DLPTIPGVTSPSSDEPPMEASQSHLR(配列番号119)、およびVVLGDGVQLPPGDYSTTPGGTLFSTTPGGTR(配列番号120)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定され;
(j)Akt1のレベルおよび/またはリン酸化状態は、NDGTFIGYK(配列番号12)、YSFQTHDR(配列番号13)、ERPQDVDQR(配列番号14)、QEEEEMDFR(配列番号15)、TFHVETPEER(配列番号16)、VTMNEFEYLK(配列番号17)、DEVAHTLTENR(配列番号18)、LPFYNQDHEK(配列番号19)、CLQWTTVIER(配列番号20)、LFELILMEEIR(配列番号21)、TERPRPNTFIIR(配列番号22)、FFAGIVWQHVYEK(配列番号23)、RPHFPQFSYSASGTA(配列番号24)、EEWTTAIQTVADGLK(配列番号25)、LSPPFKPQVTSETDTR(配列番号26)、EAPLNNFSVAQCQLMK(配列番号27)、FYGAEIVSALDYLHSEK(配列番号28)、SGSPSDNSGAEEMEVSLAKPK(配列番号29)、AVDWWGLGVVMYEMMCGR(配列番号30)、LCFVMEYANGGELFFHLSR(配列番号31)、TFCGTPEYLAPEVLEDNDYGR(配列番号32)、およびYFDEEFTAQMITITPPDQDDSMECVDSER(配列番号33)からなる群より選択される少なくとも1つの断片の分析に少なくとも部分的に基づいて決定される、
請求項1に記載の方法。
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