CN111253469B - 一种自组装短肽及其在治疗痤疮方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自组装短肽及其在治疗痤疮方面的应用。本发明中的自组装短肽含有10个氨基酸残基组成的自组装短肽,其氨基酸序列为:FFLQLQAEER,该自组装短肽能抑制皮脂腺的过度增殖,减少皮肤的油脂分泌,且毒性和副作用更小,适用人群更广,具有良好的透皮性,可用于抗痘方面,特别是用于治疗青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮,且由于该自组装短肽仅有10个氨基酸,经过修饰使短肽短肽自组装成纳米球,稳定性能更好,能持续作用于治疗部位,使用效果显著。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种自组装短肽及其在治疗痤疮方面的应用。
背景技术
痤疮是青春期最常见的毛囊皮脂腺单位的慢性炎症疾病。由于其发病原因比较复杂,所以发病机制尚未完全清楚。目前,患者皮肤皮脂分泌过多、毛囊内角质化异常、在毛囊皮脂腺管中定植的痤疮丙酸杆菌和炎症因子介质被认为在痤疮病变的发展中的关键因素。由于空气污染、现代生活节奏加快造成的压力以及性激素水平不均衡等原因,被痤疮困扰的人群数量有不断上升的趋势。另外某些药物也可通过刺激皮脂腺引起痤疮,特别是皮质类固醇和合成代谢的类固醇,如面部“玫瑰痤疮”的形成就是因为使用含有不良添加剂的护肤品造成的。尽管痤疮不影响正常的行动,但因其多发于面部,对患者的心理和社交影响很大。
处于青春期的男性和女性荷尔蒙分泌都比较旺盛,体内过多的雄激素会刺激皮肤毛囊附近的皮脂腺,使皮脂腺细胞过度增值,增大的皮脂腺分泌出大量的油脂把毛囊堵住。与此同时,皮肤分泌的油酸和棕榈油酸等不饱和脂肪酸能诱导角质化异常和表皮增生,增加角质形成细胞中的钙流入,使毛囊漏斗的近端部内聚力增加,促进角质细胞产生。而在毛囊远端部分的漏斗部,角质细胞和皮脂逐渐蓄积形成粉刺。粉刺是痤疮的早期症状,由于膨胀的粉刺使毛囊壁受损,皮脂和微生物就容易穿透毛囊壁引起中性粒细胞、T细胞的炎症反应。
为了抑制皮脂腺油脂的过度分泌及引起痤疮和毛囊皮脂腺炎症的病原菌,迄今为止有许多已经被广泛利用的方法。在使用抗生素方面常用的是利用克林霉素和红霉素局部治疗痤疮丙酸杆菌的定植,减轻其粉刺形成的促炎作用。除了对痤疮丙酸杆菌的抑制作用外,红霉素可通过其对P-450酶活性的抑制在痤疮的治疗中发挥作用,从而延迟类视黄醇分解代谢并减弱类视黄醇介导的FGFR2b信号转导(AHMAD N,MUKHTAR H.Cytochrome P450:Atarget for drug development for skin diseases[J].Journal Of InvestigativeDermatology,2004,123(3):417-25.)。然而一些临床试验表明长期局部使用红霉素会导致痤疮治疗的疗效逐渐下降(DRENO B,FOULC P,REYNAUD A,et al.Effect of zincgluconate on propionibacterium acnes resistance to erythromycin in patientswith inflammatory acne:in vitro and in vivo study[J].European journal ofdermatology:EJD,2005,15(3):152-5.),这可能与抗生素耐药的丙酸杆菌的发展有关,因此不推荐使用局部抗生素单药治疗。
另外,由于雄激素通过激活皮脂腺细胞的雄激素受体来增加皮脂产生,从而加重痤疮的症状(TRIFU V,TIPLICA G S,NAUMESCU E,et al.Cortexolone17alpha-propionate1%cream,a new potent antiandrogen for topical treatment of acne vulgaris.Apilot randomized,double-blind comparative study vs.placebo and tretinoin0.05%cream[J].The British journal of dermatology,2011,165(1):177-83.)。同时,资料显示雄激素不敏感或经阉割的雄性由于皮脂分泌减少而不会产生痤疮,更加突出了雄激素和雄激素受体的相互作用在痤疮发生上的重要地位(IMPERATO-MCGINLEY J,GAUTIERT,CAI L Q,et al.The androgen control of sebum production.Studies of subjectswith dihydrotestosterone deficiency and complete androgen insensitivity[J].The Journal of clinical endocrinology and metabolism,1993,76(2):524-8.)。临床上常用的药物有抗雄性激素类、抗生素类、糖皮质激素类以及维A酸类等药物。其中外用的全反式维A酸、阿达帕林与他扎罗汀是治疗轻度痤疮的首选药物;口服维甲A类药物则主要用于重度痤疮,其能促进表皮细胞更新,改变异常滤泡角质化和促进粉刺溶解,通过调节表皮细胞的增殖和分化,刺激新胶原蛋白形成和成纤维细胞增值并减少炎症(BALDWIN H E,NIGHLAND M,KENDALL C,et al.40Years of Topical Tretinoin Use in Review[J].Journal Of Drugs In Dermatology,2013,12(6):638-42.),逆转上皮异常角化,导致角化细胞黏聚力降低来治疗痤疮,但有致畸作用(MARQUELING A L,ZANE L T.Depressionand suicidal behavior in acne patients treated with isotretinoin:a systematicreview[J].Seminars in cutaneous medicine and surgery,2007,26(4):210-20.);口服抗雄激素类药物能选择性促进雄激素受体的降解(YANG Z,CHANG Y J,YU I C,et al.ASC-J9 ameliorates spinal and bulbar muscular atrophy phenotype via degradationof androgen receptor[J].Nature medicine,2007,13(3):348-53.),主要用于女性患者;糖皮质激素类药物则常用于暴发性痤疮或聚合性痤疮的治疗,但这些药物均有较大的副作用。光疗法比如5-氨基乙酰丙酸光动力疗法治疗痤疮也在部分医院开展,其原理是共生菌能产生大量的光敏物质在一定波长的光照射下,放出单态氧和其他自由基使皮脂腺细胞损伤凋亡(MA L,XIANG L H,YU B,et al.Low-dose topical5-aminolevulinic acidphotodynamic therapy in the treatment of different severity of acne vulgaris[J].Photodiagnosis and photodynamic therapy,2013,10(4):583-90.),故可以用于痤疮的治疗。另外还可通过中医汤药和针灸等方法来治疗痤疮的,但疗程均较长。因此目前迫切需要可以针对痤疮多种病理过程且副作用较少的新药。
自组装肽是具有独特结构的生物医学材料,研究人员可根据理化特性和施用环境来修饰这些肽,从而诱导具有不同形状的自组装结构,达到比常规非自组装肽更高效的目的。肽的自组装是肽自发形成有序聚集体的过程(GRANTCHAROVA V,ALM E J,BAKER D,etal.Mechanisms of protein folding[J].Current opinion in structural biology,2001,11(1):70-82.)。氢键和疏水键相互作用、静电相互作用和范德华力相结合,将肽的自组装结构维持在稳定的低能状态(KUMAR A,ABBOTT N L,BIEBUYCK H A,et al.Patternedself-assembled monolayers and meso-scale phenomena[J].Accounts of ChemicalResearch,1995,28(5):219-26.)。自助装肽有控释的能力,更高的稳定性和靶向性使它具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种自组装短肽。
本发明的另一目的在于提供所述自组装短肽在治疗痤疮方面的应用,特别是治疗青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种自组装短肽,其氨基酸序列如下所示:FFLQLQAEER。
所述的自组装短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用。
所述的痤疮优选为由青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮。
所述的自组装短肽通过抑制人皮脂腺细胞的生长,抑制皮脂腺过度增值,和/或减少皮肤油脂分泌实现治疗痤疮的目的。
所述的产品为医用产品、护肤品或化妆品;优选为医用产品,包括药物等。
所述的产品的制剂类型包括但不限于溶液或干粉。
所述的自组装短肽的有效浓度为100±10μg/ml。
一种含有自组装短肽的制剂,包括所述的自组装短肽和海藻多糖水凝胶,以海藻多糖水凝胶为溶剂溶解自组装短肽。
所述的海藻多糖水凝胶优选为通过如下方法获得:将海藻多糖粉末加入到水中,混合均匀,得到海藻多糖水凝胶。
所述的海藻多糖水凝胶中海藻多糖的含量优选为10%(w/w)。
所述的制剂的使用浓度为100±10μg/ml。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1、本发明中的短肽为含有10个氨基酸残基组成的自组装短肽(含有修饰后的bFGF衍生降解短肽),与目前常用的产品维A酸相比,同样能抑制皮脂腺的过度增殖,减少皮肤的油脂分泌,且本发明的自组装短肽毒性和副作用更小,适用人群更广,其能够有效地抑制皮脂腺过度增值和减少皮肤油脂分泌,具有良好的透皮性,可用于抗痘方面,特别是用于治疗青春期以及妊娠期因激素水平变化而产生的痤疮。
2、目前为止尚无文献报道该序列多肽能用于痤疮的治疗,且由于该自组装短肽仅有10个氨基酸,经过修饰使短肽短肽自组装成纳米球,稳定性能更好,能持续作用于治疗部位,使用效果显著,因此具有技术上的先进性。
附图说明
图1是克隆形成实验测定自组装短肽对人皮脂腺细胞(SZ95)的增值抑制作用的结果图。
图2是CCK-8法检测自组装短肽对人皮脂腺细胞(SZ95)抑制作用的结果图。
图3是建立兔耳痤疮模型的示意图;其中,A、B为建模前后兔耳皮肤直观图;C、D为建模前后兔耳皮肤微观图;E、F为建模前后兔耳皮肤组织HE染色图。
图4是自组装短肽对兔耳痤疮恢复情况的影响图;其中,A为各组药物涂抹兔耳后皮肤恢复情况直观图;B为各组药物涂抹兔耳后皮肤恢复情况微观图C为各组药物涂抹兔耳后皮肤组织HE染色图。
图5是自组装短肽的透皮效果测试图;其中,A为白光下观察兔耳毛囊;B为荧光显微镜下观察FITC-自组装P5肽在毛囊的聚集情况。
图6是高效液相色谱图;其中,A为短肽在血浆中的降解情况;B为自组装在血浆中的降解情况。
图7是自组装短肽的稳定性测试图;其中,A为高效液相色谱图;B为短肽的降解情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,实施例中所使用的实验材料、试剂等如无特殊说明,均为商业途径获取。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
本发明中涉及的小分子短肽为含有10个氨基酸残基组成的自组装短肽,其其氨基酸序列为:FFLQLQAEER(即NH2-FFLQLQAEER-COOH);分子量约为1.28kDa,可以采用化学合成的方法获得或委托公司合成;本发明中涉及的自组装短肽委托北京国家纳米科学中心合成。
本发明中培养SZ95细胞所用培养基为美国HyClone公司的DMEM培养基。
实施例1
1、克隆形成实验测定自组装短肽对人皮脂腺细胞SZ95(购自苏州北纳创联生物科技有限公司)的生长抑制作用
将对数生长期的各组细胞分别用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,稀释到一定倍数后分别接种在6孔板中(1.2×106个/孔),并轻轻转动,使细胞分散均匀。分别在孔中加入0μM,20μM,100μM和200μM的自组装短肽培养2到3周,弃去培养基后固定细胞,用结晶紫进行染色,拍照观察并对细胞克隆团数量进行计数。
结果如图1所示,实验结果表明自组装短肽能抑制人皮脂腺细胞(SZ95)的生长。
2、CCK-8法检测自组装短肽对人皮脂腺细胞(SZ95)的生长抑制作用
取人皮脂腺细胞(SZ95),按每孔3000个细胞铺96孔板,贴壁后饥饿24小时后,取自组装短肽,按5×倍增浓度(0、0.00256、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40、200μM)处理48小时,之后采用CCK-8试剂处理,酶标仪检测各个孔OD值。
结果如图2所示,自组装短肽能抑制人皮脂腺细胞(SZ95)的生长,而且其毒性较弱,高浓度情况下其抑制增殖的能力也仅下调30%左右。说明自组装短肽的对皮肤来源的细胞毒性小。
3、兔耳痤疮模型的建立
该模型用于检测药物对兔耳皮肤上痤疮恢复的影响。
本实验选取新西兰兔(12周龄普通级雄性新西兰兔,体重2.0~2.5kg,购自广州市花都区花东信华实验动物养殖场),采用Kligman法(American Academy of Dermatologyinvitational symposium on comedogenicity[J].Journal of the American Academyof Dermatology,1989,20(2Pt 1):272-7.)构建痤疮兔耳模型,具体为:
遵照兔耳模型规范Kligman法,每日1次用棉签蘸取煤焦油后涂抹在兔耳内侧面无毛范围内,连续15天,并在此期间观察兔耳厚度、硬度、有无红肿,毛囊口是否扩大并有角栓等情况。造模完成后进行拍照和HE染色,根据中国痤疮治疗指南(2014修订版)制定的痤疮皮损性质分级和组织病理学检查判定造模成功。
结果如图3所示,结果显示造模后兔耳局部组织明显增厚、变硬且变粗糙。毛囊漏斗部扩张,毛囊口明显见到角栓,呈粉刺状,而且毛囊口隆起,有明显的脱屑,证明兔耳痤疮模型造模成功。
4、自组装短肽对兔耳痤疮恢复情况的影响
待兔耳痤疮模型造模成功后,用10%(w/w)海藻多糖水凝胶做溶剂制成浓度为100μg/ml的自组装短肽(用超纯水溶解海藻多糖粉末混匀成凝胶状),每天在兔耳涂抹,对照组只是涂抹10%(w/w)海藻多糖水凝胶,空白组不涂抹任何东西,20天后观察各组兔耳痤疮恢复情况,进行拍照和HE染色。
结果如图4所示,结果显示自组装短肽能明显改善兔耳痤疮的症状。兔耳的肿胀,表皮角化物、痤疮全部消失,皮脂腺增生程度减轻,毛孔逐渐恢复,可见自组装短肽对兔耳痤疮有显著的修复作用。
5、自组装短肽的透皮效果测试
用带荧光的自组装短肽(自组装短肽委托北京国家纳米科学中心合成;带荧光的自组装短肽(荧光物质是肽上连着的FITC标记)为自组装短肽用荧光染料标记,即将荧光染料通过化学键连接到短肽上;其中,短肽与荧光物质的重量比为50:1;本实验所用由北京国家纳米科学中心合成)(20μL 100μM/μL)涂抹耳皮肤6小时后,采样并进行冰冻切片,在荧光显微镜下观察皮肤的荧光情况。
结果如图5所示,结果显示自组装短肽能透过毛囊口及漏斗部中的角化物质,并向皮脂腺延伸,说明自组装短肽能直达皮肤的皮脂腺组织起作用,透皮效果良好。
6、自组装短肽的稳定性测试
使用赛默飞U-3000高效液相色谱仪,仪器方法:紫外波长220nm,上样量20ul,流速0.5ml/min,柱温25℃。
表1
注:表中“TFA”为三氟乙酸。
制样方法:
将健康献血者的血浆与1mg/ml的自组装短肽在37℃按体积比9:1比例混合,分别孵育0min,10min,20min,30min,60min,120min,再加入0.4倍的TFA涡流30s,置于室温下20分钟,13000rpm离心15分钟,取上清液于新EP管中,13000rpm离心5分钟,收集上清液约200ul于上样瓶中进行上机分析。在相同条件下,以小分子短肽(LQLQAEER;委托北京国家纳米科学中心合成)为对比,结果如图6和图7所示。
图6和图7的结果显示:自组装短肽在血浆中孵育20min后只降解了15%左右。而普通短肽(LQLQAEER)在血浆中孵育20min后只却只剩下20%左右。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种自组装短肽及其在治疗痤疮方面的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 自组装短肽
<400> 1
Phe Phe Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小分子短肽
<400> 2
Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg
1 5
Claims (7)
1.一种自组装短肽,其特征在于,其氨基酸序列如下所示:FFLQLQAEER。
2.权利要求1所述的自组装短肽在制备治疗痤疮的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述的自组装短肽通过抑制人皮脂腺细胞的生长,抑制皮脂腺过度增值,和/或减少皮肤油脂分泌实现治疗痤疮的目的。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述的产品为医用产品、护肤品或化妆品。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述的自组装短肽的有效浓度为100±10μg/ml。
6.一种含有自组装短肽的制剂,其特征在于:包括权利要求1所述的自组装短肽和海藻多糖水凝胶,以海藻多糖水凝胶为溶剂溶解自组装短肽。
7.根据权利要求6所述的含有自组装短肽的制剂,其特征在于:所述的制剂的使用浓度为100±10μg/ml。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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