WO2015125216A1 - 質量分析を用いたタンパク質の検出方法 - Google Patents

質量分析を用いたタンパク質の検出方法 Download PDF

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WO2015125216A1
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sample
peptide
serum
protease
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敦彦 遠山
佐藤　孝明
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株式会社島津製作所
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21014—Microbial serine proteases (3.4.21.14)
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a protein in a sample by mass spectrometry (MS). More specifically, the present invention relates to a method for detecting and identifying a protein by high performance liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS) or matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method. .
  • MS mass spectrometry
  • LC / MS high performance liquid chromatography / mass spectrometry
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • ionization methods such as matrix-assisted laser desorption ionization and electrospray ionization (ESI) are used except for impurities that inhibit ionization from serum samples.
  • ESI electrospray ionization
  • a system SELDI protein chip (R) system: Patent Document 1
  • a plate used for pretreatment can be directly introduced into a mass spectrometer.
  • Patent Document 2 a system for directly measuring the target protein after isolating and purifying the target protein from a sample such as serum using an antibody that specifically binds to the target protein.
  • a method of analyzing a protein after fragmenting it into short peptide chains by a protein digestion enzyme is one technique established for obtaining protein identification and structural information with high accuracy.
  • a protein digestion enzyme protease digestion enzyme
  • the mass is determined by mass spectrometry (MS), more preferably the amino acid sequence is determined by tandem MS measurement, and these information are collated with a database.
  • MS mass spectrometry
  • the method of analogizing the protein present in the original sample is called shotgun proteomics and is widely used in biological research.
  • Non-patent Document 1 In shotgun proteomics, a quantitative analysis method for estimating the content of the original protein by quantifying digested peptides has recently been established (Non-patent Document 1). This method has high sensitivity because the target is a peptide that is easily ionized, and accurate quantification is possible by using an internal standard (internal standard) labeled with a stable isotope. Furthermore, by connecting a mass spectrometer to separation of peptides by nanoscale liquid chromatography and measuring continuously as the peptide is eluted, the sensitivity of the measurement system is dramatically improved to a level below femtomole. Yes.
  • the concentration range of blood proteins also extends to the 10 9 order.
  • the dynamic range that can be captured by the mass spectrometer is about 10 3 to 10 4, it is extremely difficult to detect a trace amount of protein in the blood by the mass spectrometer.
  • albumin protein-derived peptides contained in high concentrations such as albumin, saturating the analytical system. Resulting in.
  • albumin is known to occupy 50% or more of blood proteins, and when peptides are detected by pretreatment by conventional methods, most of them become albumin-derived peaks and are contained in trace amounts. The protein-derived peak is extremely difficult to detect.
  • Non-patent Document 2 the digested peptide is subdivided by multi-step purification, and a small fraction concentrated from the whole is subjected to intensive analysis (Non-patent Document 2), and is subject to quantification.
  • concentration at the peptide level such as immunoprecipitation using an antibody that specifically binds to a peptide or ion exchange chromatography (Non-patent Document 3).
  • these methods involve very complicated preprocessing, they are out of the throughput and cost constraints required for clinical tests.
  • An object of the present invention is a method for pretreatment of a serum or plasma sample for detecting a single or a plurality of target proteins from a serum or plasma sample by mass spectrometry, and a method for detecting the protein in a sample such as albumin. It is intended to provide a method for removing a large amount of protein present in a simple manner and recovering a digested peptide derived from the target protein.
  • the present inventors have surprisingly found that serum or plasma can be used in a state where dilution or denaturation of serum or plasma using a buffer is minimized. It was found that by directly adding protease to the digestion, the peptide necessary for quantification of the target protein can be secured while suppressing the production of peptides derived from albumin and the like. Furthermore, by removing undigested protein after protease treatment, the proportion of peptides derived from the target protein can be relatively increased.
  • the method described in the present invention is a method of simultaneously performing specific digestion and concentration of a target protein based on the sensitivity to digestion by protease, and in an analysis system for detecting and quantifying the target protein using mass spectrometry, This makes it possible to calibrate a protein having a low blood concentration very easily as compared with the conventional method.
  • a sample pretreatment method for detecting a protein in a serum or plasma sample by mass spectrometry comprising a step of digesting a sample by adding protease to the sample under native protein conditions,
  • the said pretreatment method including the process of isolate
  • a method for detecting a protein in a serum or plasma sample by mass spectrometry comprising a step of digesting a sample by adding a protease to the sample under a native condition of the protein, and converting the obtained peptide into an undigested protein.
  • the method as described above comprising a step of separating and a step of subjecting the peptide to mass spectrometry.
  • the present invention is surprising for the detection of proteins using mass spectrometry, in contrast to the conventional methods that have sought efficient fragmentation of proteins, making use of conditions that are unlikely to cause digestion by proteases. It is based on the discovery that results can be obtained.
  • the method of the present invention eliminates the need for conventional pretreatments such as protein denaturation, reduction, and alkylation, and allows quantitative determination of trace proteins in a sample without the need for a protein or peptide concentration step. It has become possible. Thereby, the time and cost required for pre-processing can be reduced, and a high-throughput quantitative method can be provided.
  • the mass spectrum of the serum digestion peptide obtained by the pre-processing method by this invention and the pre-processing by the conventional method is shown. Among the observed peaks, * indicates a peak derived from albumin.
  • P14R SEQ ID NO: 12, m / z 1533.9
  • the upper result shows the result obtained by the conventional method, and the lower result shows the result obtained by the method of the present invention.
  • Peptides derived from ANXA4 are indicated by arrows (A: conventional method, B: method according to the present invention).
  • the mass spectrum of the peptide obtained by subjecting Annexin A4 (ANXA4) to trypsin digestion is shown.
  • the upper panel shows the results of subjecting ANXA4 alone to trypsin digestion, and the lower panel shows the results of digesting ANXA4 with ⁇ 2 macroglobulin in advance and heating.
  • Peptides derived from ANXA4 are indicated by arrows.
  • a “serum or plasma sample” is a blood-derived sample intended to be detected for the presence of a protein of interest, and is derived from the serum or plasma itself or from these. It will be understood by those skilled in the art that the sample is included, for example, to which a drug is added for storage of the sample. Subjects include, but are not limited to, mammals, particularly humans.
  • the serum or plasma sample is subjected to protein denaturation / reduction treatment and alkylation treatment prior to detection of the target protein, followed by protease treatment.
  • the protein / peptide is appropriately concentrated by, for example, immunoprecipitation or ion exchange chromatography.
  • an enzyme digestion reaction buffer is added for the purpose of adjusting the reaction solution to an environment having an appropriate pH and ionic strength.
  • an ammonium bicarbonate solution, a Tris buffer, or the like is often used for the purpose of pH adjustment.
  • the conventional method further requires further processing so that reagents added for pretreatment, particularly high concentrations of urea and surfactant added for denaturation do not affect protease treatment and mass spectrometry.
  • denaturation of a protein means that the three-dimensional structure of the protein loses and changes the higher-order structure originally taken in the living body. For example, it is known that, in addition to rapid changes in ionic strength, pH, and temperature, denaturation occurs due to the addition of a high concentration of chaotropic agent or surfactant.
  • the present invention relates to a pretreatment method comprising a step of adding a protease to a serum or plasma sample under native protein conditions and digesting, and a step of separating the obtained peptide from undigested protein.
  • a method for detecting a protein by mass spectrometry which includes a step of subjecting to mass spectrometry.
  • the method of the present invention preferably does not include a protein or peptide enrichment step as conventionally done before and / or after protease treatment.
  • Non-denaturing conditions refers to a biological sample such as serum or plasma in addition to the treatment for denaturation usually used in the art to denature proteins, for example, treatment with a denaturing agent such as urea. Means that the state of the composition, temperature, etc. of the constituent components inherently has no change.
  • inactivation treatment prior to protease treatment it is preferable to perform inactivation treatment prior to protease treatment as a step of suppressing endogenous protease activity that may slightly affect the detection result and enhancing the detection effect on the target protein.
  • the deactivation can be performed, for example, by a heat treatment at 56 ° C. for 30 to 40 minutes. Conditions for deactivation can be easily determined by those skilled in the art.
  • protease is directly added to the obtained serum or plasma sample.
  • “direct addition” refers to addition to a sample containing protein in a necessary minimum solution composition without subjecting the collected serum or plasma sample to protein denaturation treatment.
  • the protease to be added is prepared to a high concentration of 10 mg / mL or higher using ultrapure water or hydrochloric acid having a concentration of 1 mmol / L or less, and this is directly added to about 1/50 volume of the serum or plasma sample volume. By adding, the digestion reaction can be started with almost no change in the original composition of the sample.
  • the reaction environment is suitable for many proteases including trypsin without adjusting the pH with a separate buffer. If there is a special need, the pH may be adjusted in the range of pH 7 to 9, more preferably in the range of pH 7.4 to 7.8. Conditions for pH adjustment can be appropriately determined by those skilled in the art, but particularly preferred is buffering with sodium phosphate.
  • the “protease” preferably used in the present invention preferably includes trypsin, lysyl endopeptidase, endopeptidase Asp-N, V8 protease, metalloendopeptidase Lys-N, and particularly preferably trypsin.
  • Trypsin has high substrate specificity, and since there is Lys or Arg at the C-terminus of the peptide after cleavage, the charge amount and charge localization of the peptide can be homogenized, so that a sample for mass spectrometry can be prepared. Is particularly suitable.
  • the amount of protease added to the sample may vary depending on the protease used and the conditions of the sample type, temperature, processing time, etc., but preferably the amount of protease added is 1-50 ⁇ g per 100 ⁇ L of serum or plasma sample. The amount is preferably 20 to 40 ⁇ g. In one embodiment, in the method of the invention, approximately 20 ⁇ g trypsin is added per 100 ⁇ L of serum.
  • the reaction temperature in protease treatment is 0 to 40 ° C., preferably 4 ° C. to 37 ° C., and the treatment time is preferably 1 to 24 hours, preferably 3 to 16 hours, more preferably 8 to 12 hours.
  • the protease is not particularly limited, but is used as a solution or suspension prepared at a high concentration as described above. After degradation, the protease can be easily removed in the process of separating the protein. Alternatively, a sample can be applied to the immobilized enzyme using a protease bound to a solid support. Methods for producing immobilized enzymes are well known in the art.
  • the carrier is not particularly limited.
  • agarose, sepharose, polyacrylamide, polyethylene glycol, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, (meth) acrylic acid ester polymer, fluororesin, metal complex resin, Glass, metal, and a magnetic material are mentioned.
  • immobilized enzymes can also be removed in the step of separating the protein.
  • albumin, globulin and transferrin present in high concentrations in serum or plasma were not digested, and the resulting peptides were subjected to mass spectrometry.
  • peaks derived from these proteins were not included in the mass spectrum.
  • albumin occupying 50% or more of the protein is not digested, it is possible to detect peptides that were difficult to detect due to the small amount of the conventional method, and detection of the target protein / peptide in the sample is extremely possible. Can be carried out easily and quickly.
  • the terms “undigested” and “undigested” used for a protein refer to 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more of the protein present in the sample. It means that the protein remains as it is without being decomposed by the added protease. In other words, when serum or plasma is used as a sample, degradation of contaminating proteins present in a large amount in the sample, particularly albumin contained in a large amount by protease, is less than 10%, preferably less than 5%, more preferably less than 2%. More preferably, it is less than 1%. Most preferably, in the method of the present invention, albumin does not undergo any protease degradation. Undigested protein is removed by the subsequent separation step of protein and peptide in the method of the present invention.
  • An “undigested protein” is an interaction with a protease due to the reason that its tertiary structure and quaternary structure are highly folded in a sample and in a state of being bound to other proteins. Means a protein that is inhibited and does not undergo digestion under the conditions of the present invention.
  • the method of the present invention is designed to reverse the original concentration ratio at the level of digested peptide by preferentially proceeding digestion of proteins other than those having such properties.
  • A2M ⁇ 2 macroglobulin
  • A2M is a protease inhibitor having a function of fixing a wide variety of proteases inside the cage-like A2M molecule, and is contained in serum at a concentration of about 1 to 2 mg / mL. It is known that proteases in the state of being fixed inside A2M remain active, and are continuously digested if they have a small molecular weight accessible to the inside of A2M (Sottrup-Jensen, L , J Biol Chem 1989, 264 (20), 11539-42).
  • proteins that are preferentially digested under the conditions of the method of the present invention include those that are digested via A2M molecules in blood. . That is, it is considered that the protease added to a sample such as serum reacts with A2M in the sample and acts on the protein in the sample in a state of being covalently bound inside A2M. Therefore, as the protein to be analyzed, one having a molecular weight of about 10 kDa or less may be more suitable in the present invention.
  • the proteins that are digested by the method of the present invention only a part of all peptides that may be generated when the protein is digested may be detected with high sensitivity. This is considered to reflect a situation where a part of the target protein is selectively digested when the protease inside A2M acts.
  • the concentration of the protein to be detected in the sample depends on the sensitivity of the measurement system, but a concentration of 1 ⁇ g / mL or more, particularly in the range of 5 to 100 ⁇ g / mL, is advantageously detected by the method of the present invention. . More specifically, the amount of peptide actually detected may be in the range of 10 to 10,000 fmol. When 0.1 ⁇ L of a sample containing 5 ⁇ g / mL protein is used for measurement by MS, the amount of peptide detected is about 15 fmol.
  • the undigested protein is separated from the peptide using the difference in properties between the protein and the digested peptide.
  • an organic solvent or acid is added to precipitate the protein, and the centrifugal supernatant is collected.
  • the protein is fractionated into a high molecular weight protein and a low molecular weight peptide by ultrafiltration or gel filtration. And a method of selectively binding to a carrier using strong hydrophobic interaction.
  • pretreatment of a serum or plasma sample according to the method of the present invention and the obtained peptide is measured by a mass spectrometer, so that it is present in a large amount in the sample, for example, interference by proteins such as albumin
  • the detection of a trace amount of protein in a sample can be carried out easily and with high throughput without being subjected to.
  • Mass spectrometry is performed on peptides ionized using a MALDI method, an ESI method, or the like using an analyzer such as a double focusing type, a quadrupole type, a time-of-flight type (TOF), or a Fourier transform ion sacrotron resonance type. be able to. Moreover, you may analyze by the liquid chromatograph mass spectrometry (LC / MS) combined with the high performance liquid chromatography. Mass spectrometry can be performed by multiple reaction monitoring (MRM) with a triple quadrupole mass spectrometer of an LC / MS system widely used in the art for quantitative detection of peptides. The measurement of MRM can be performed by, for example, LCMS-8080 (Shimadzu Corporation). Measurement of MALDI-TOF MS can be performed by, for example, AXIMA-Resonance (Shimadzu Corporation).
  • MRM multiple reaction monitoring
  • Measurement of MALDI-TOF MS can be
  • Tandem MS (MS / MS) analysis which is used for detailed and precise analysis, selects a precursor ion derived from the target peptide for further mass analysis, and identifies the peptide by the generated product ion. ⁇ Can be quantified. Based on the analysis results obtained, it is possible to confirm that the peptide is the target peptide by referring to the peak information obtained in the same manner using a control sample or information in a known database. A decision can be made.
  • the measurement of MS / MS can be performed by, for example, AXIMA-Resonance (Shimadzu Corporation).
  • a peptide to be actually analyzed by mass spectrometry in the protein to be detected is selected.
  • Information on the amino acid sequence of the protein can be obtained from, for example, http://www.uniprot.org/.
  • the type of peptide that can be generated when a protein is decomposed with a protease can be predicted from, for example, http://web.expasy.org/peptide_mass/.
  • Data of measurement results by mass spectrometry of peptides generated by protease digestion can be referred to, for example, at http://peptide.nist.gov/.
  • amino acid sequence For example, in the selection of peptides that can be subjected to mass spectrometry after digestion with trypsin, several exclusion criteria are known for the amino acid sequence (Nat. Biotechnol. 2009, 27 (2), 190-8). Specifically, for example, it is essential that the same sequence does not exist in a plurality of proteins for the reliability of the detection result, for example, it is not a hydrophilic peptide of less than 8 amino acids or a hydrophobic peptide of more than 20 amino acids.
  • the basic amino acid which becomes the carboxy terminus by trypsin digestion is not adjacent (KK, RR, KR, RK); it does not contain a cysteine residue, a methionine residue, an N-terminal glutamine or asparagine.
  • a peptide suitable as a marker for detection by mass spectrometry can be predicted on a computer based on such information, and a person skilled in the art can arbitrarily select a peptide to be used for quantification from these.
  • annexin A4 (SEQ ID NO: 1), which is known to be highly expressed in some ovarian cancers, is a peptide for detecting in blood, and the following conditions: (Condition 1) The same amino acid sequence does not exist in other proteins; (Condition 2) The sequence does not contain cysteine; (Condition 3) The number of amino acids in the sequence is 8 to 20; (Condition 4) When the N-terminal of the sequence is other than glutamine or asparagine; and those satisfying the above are suitable candidate peptides, the following peptides can be selected.
  • AASGFNAMEMQTLR (SEQ ID NO: 2, corresponding to amino acid numbers 10-24 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1); GLGTDEDAIISVLAYR (SEQ ID NO: 3, corresponding to amino acid numbers 29-44 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1); ISQTYQQQYGR (SEQ ID NO: 4, corresponding to amino acid numbers 124-134 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1); SDTSMFMFQR (SEQ ID NO: 5, corresponding to amino acid numbers 142-150 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1); VLVSLSAGGR (SEQ ID NO: 6, corresponding to amino acid numbers 151-160 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1); DEGNYLDDALVR (SEQ ID NO: 7, corresponding to amino acid numbers 161-172 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1); SETSGSFEDALLAIVK (SEQ ID NO: 8, corresponding to amino acid numbers 226 to 241 of the amino acid sequence of
  • the peptide predicted on the computer may actually be difficult to be digested with protease depending on conditions such as the position in the three-dimensional structure of the protein.
  • a peptide for the detection of annexin A4 particularly preferred in the method of the present invention are peptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3 and 7.
  • Powdered trypsin (product code 203-09893, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in a 1 mmol / L hydrochloric acid solution to a concentration of 10 mg / mL to obtain a trypsin solution.
  • Pretreatment according to the present invention The pretreatment process according to the present invention will be described below.
  • 100 ⁇ L of each serum sample prepared as described above was placed in a 1.5 mL Eppendorf tube, 2 ⁇ L of trypsin solution was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 16 hours (about 20 ⁇ g trypsin for 100 ⁇ L of serum sample).
  • the sample after the reaction is transferred to the upper part of an ultrafiltration filter (Amicon 10,000 MWCO filter, Millipore), centrifuged at 10,000 g for 60 minutes, and the filtrate transferred to the lower part of the filter is directly used as a sample for mass spectrometry. It was.
  • an ultrafiltration filter Amicon 10,000 MWCO filter, Millipore
  • MS / MS measurement For MS / MS measurement, an ion trap was set for the target monoisotopic mass, and a total of 200 profiles were acquired from 200 locations by raster driving under the conditions of Positive Midmass mode and laser intensity of 110, and integrated. . The intensity setting value of CID (Collision Induced Dissociation) was appropriately adjusted according to the target.
  • CID collision Induced Dissociation
  • FIG. 2 is an enlarged view around the peak of m / z 1379.6. As indicated by the arrows, this peak that was not detected by the pretreatment by the conventional method (A) was detected at 38 ⁇ g / ml or more by the pretreatment (B) according to the present invention. As is clear from this result, no peak derived from ANXA4 was detected by the conventional method, whereas a peak depending on the concentration was observed by the method of the present invention.
  • the above peak (m / z 1379.6) was selected as a precursor ion, and a product ion spectrum was obtained by MS / MS measurement.
  • the results are shown in FIG. From the result of FIG. 3, it was shown that the peak at m / z 1379.6 was attributed to a peptide derived from ANXA4 (SEQ ID NO: 7). This was confirmed from the fact that the spectrum was the same as that obtained by directly analyzing ANXA4 without adding it to the sample.
  • the ANXA4 concentration in serum was detectable at 75 ⁇ g / mL or more, whereas in the method of the present invention (FIG. 3B), detection was possible even at a low concentration of only 5 ⁇ g / mL. Yes, detection sensitivity improved more than 10 times. Furthermore, while many signals that are not derived from ANXA4 are mixed in the conventional method, only the signal derived from ANXA4 is detected in the method according to the present invention, and the S / N ratio is also good.
  • Table 1 summarizes the detection of ANXA4-derived peptides by the method according to the present invention and the conventional method.
  • the signal intensity derived from ANXA4 after correction was compared with the conventional method involving denaturation and the direct digestion method according to the present invention, it was found that the detection efficiency was remarkably improved in both MS and MS / MS data. That is, the ANXA4-derived m / z 1379 peak could not be quantitatively detected by the conventional method, whereas the peak of the method of the present invention was detected depending on the concentration.
  • Example 2 [Selection of peptide for analysis] Although there are peptides of SEQ ID NO: 2-11 listed above as suitable peptide candidates for the method of the present invention, a preliminary experiment using ⁇ 2 macroglobulin (A2M) was conducted in order to select a particularly suitable peptide from these peptides. Carried out.
  • A2M ⁇ 2 macroglobulin
  • A2M protein (product code M6159, Sigma-Aldrich) and purified recombinant protein ANXA4 obtained by an E. coli expression system were prepared in phosphate buffered saline (PBS) at concentrations of 2 mg / mL and 3 mg / mL, respectively.
  • Powdered trypsin (product code 203-09893, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in a 1 mmol / L hydrochloric acid solution to a concentration of 10 mg / mL to obtain a trypsin solution.
  • FIG. 4 shows the mass spectrum of the ANXA4 digested peptide in the presence and absence of A2M (final concentration 0.75 mg / mL).
  • AASGFNAMEMQTLR SEQ ID NO: 2
  • Example 3 [Preparation of sample and protease] The same operation as in Example 1 was performed.
  • [MALDI MS measurement] 0.5 ⁇ L of the sample obtained above was desalted with ZipTip, 10 pmol of standard peptide P14R was added to the eluate, and 1/10 of the amount was spotted on a ⁇ Focusing plate (Shimadzu GLC). After air drying, 1 ⁇ L of 3 mg / mL 2,5-dihydroxybenzoic acid was spotted as a matrix, and after crystallization, measurement was performed with MALDI MS (AXIMA-Resonance, Shimadzu Corporation). A mass spectrum was acquired from each spot by acquiring a total of 200 profiles from 200 locations by raster driving under the conditions of Positive MidMass mode and laser intensity of 100.
  • Peak detection is performed from the mass spectrum with a signal intensity of 0.5 mV as a threshold, and the signal is derived from P14R-derived signal (m / z 1533.9) intensity and ANXA4 (peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).
  • the intensity of each signal (m / z 1581.7) was extracted and tabulated.
  • strength of product ion m / z 588.3 (equivalent to y5 ion of sequence number 2) was extracted from the product ion spectrum of m / z 1581.7 acquired by MS / MS mode, and it totaled.
  • ND non-detection
  • FIG. 5 is an enlarged view around the peak at m / z 1581.7. As indicated by the arrows, this peak that was not detected by the pretreatment by the conventional method (A) was detected at 38 ⁇ g / ml or more by the pretreatment (B) according to the present invention. As is clear from this result, no peak derived from ANXA4 was detected by the conventional method, whereas a peak depending on the concentration was observed by the method of the present invention. In this experimental condition, among the candidate peptides (SEQ ID NO: 2-11) of the ANXA4-derived peptide, only SEQ ID NOs: 2 and 3 were actually detected from the mass spectrum, which is preferable in Example 2. It was confirmed to be consistent with the peptide.
  • the above peak (m / z 1581.7) was selected as a precursor ion, and a product ion spectrum was obtained by MS / MS measurement.
  • the results are shown in FIG. From the results of FIG. 6, it was shown that the peak at m / z 1581.7 was attributed to the peptide derived from ANXA4 (SEQ ID NO: 2). This was confirmed from the fact that the spectrum was the same as that obtained by directly analyzing ANXA4 without adding it to the sample.
  • the ANXA4 concentration in serum was detectable at 75 ⁇ g / mL or more, whereas in the method of the present invention (FIG. 4B), detection was possible even at a low concentration of only 5 ⁇ g / mL. Yes, detection sensitivity improved more than 10 times. Furthermore, while many signals that are not derived from ANXA4 are mixed in the conventional method, only the signal derived from ANXA4 is detected in the method according to the present invention, and the S / N ratio is also good.
  • Table 2 summarizes the detection of peptides derived from ANXA4 by the method according to the present invention and the conventional method.
  • the pretreatment method of the present invention is effective for obtaining the peptide signal derived from the target protein by eliminating the influence of the protein present in a large amount in the blood such as albumin. It is possible to provide more convenience as a pretreatment for biomarker measurement by analysis.
  • the present invention was devised as a method for detecting and identifying proteins in blood by LC / MS or MALDI-TOF MS.
  • the present invention provides a blood sample pretreatment method useful for searching for disease biomarkers using these mass spectrometers and for performing clinical tests based on biomarker measurements.

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Abstract

　血清又は血漿試料から単一又は複数の目的タンパク質を質量分析により検出するための、血清又は血漿試料の前処理方法、及び該タンパク質の検出方法であって、アルブミン等の試料中に多量に存在するタンパク質を簡便な方法で除去し、目的のタンパク質由来の消化ペプチドを回収する方法を提供する。　具体的には、本発明は、血清又は血漿試料中のタンパク質を質量分析によって検出するための試料の前処理方法であって、タンパク質の未変性条件下で該試料にプロテアーゼを添加して消化する工程と、得られたペプチドを未消化のタンパク質と分離する工程とを含む、上記前処理方法、及び得られたペプチドを質量分析に供する、タンパク質の検出方法を提供する。

Description

質量分析を用いたタンパク質の検出方法
　本発明は、質量分析（Mass Spectrometry：ＭＳ）による試料中のタンパク質の検出方法に関する。より具体的には、本発明は、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization：ＭＡＬＤＩ）法によりタンパク質を検出・同定するための方法に関する。
　近年、質量分析機器のめざましい進化に伴い、癌に代表される疾患のバイオマーカーとなるタンパク質の測定を、従来のイムノアッセイ（抗体抗原反応を利用した測定系）から質量分析を用いた系に代替する研究が進められている。質量分析は複数のバイオマーカータンパク質の定量を同時に行うことが可能であることから、従来法で必要とされていたバイオマーカー候補の同定からイムノアッセイ系の構築に至るまでのタイムラグの解消、タンパク質の質的変化に関する情報の取得、及び複数のバイオマーカーを測定することによる判定精度の向上などの効果が期待されている。
　質量分析計を用いた血中タンパク質の検出方法としては、血清試料からイオン化を阻害する夾雑物を除き、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、エレクトロスプレーイオン化（Electrospray ionization：ＥＳＩ）法などのイオン化法によりタンパク質をイオン化させ、タンパク質イオンの質量／電荷比により分解されたピークごとのシグナルの強弱をもって定量分析を行う方法がある。これらの方法は前処理に用いるプレートをそのまま質量分析計に導入できるシステム（ＳＥＬＤＩプロテインチップ(R)システム：特許文献１）などにより、多検体を自動的に測定することが可能である。しかしながら、検出できるタンパク質の種類が少なく、微量成分の検出は困難であるという欠点がある。
　その他の方法として、目的タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、血清等の試料から目的タンパク質を単離精製した後に、直接測定に供するシステムなどが提案されている（特許文献２）。抗体を用いることにより、微量成分の検出が可能となる反面、微量成分の濃縮にたえる品質の抗体を作製することが律速となるため、従来のイムノアッセイが抱える欠点への解決にはなっていない。
　これに対して、タンパク質をタンパク質消化酵素（プロテアーゼ）により短いペプチド鎖に断片化してから分析する方法は、タンパク質の同定及び構造情報を精度よく得るために確立された１つの技術である。中でも、生体試料のプロテアーゼ消化により得られたペプチド群に対して、質量分析（ＭＳ）により質量を決定し、さらに好ましくはタンデムＭＳ測定によりアミノ酸配列を決定し、これらの情報をデータベースに照合することにより元の試料中に存在したタンパク質を類推する方法は、ショットガンプロテオミクスと呼ばれ、生物学的研究において幅広く用いられている。
　ショットガンプロテオミクスにおいては、消化ペプチドを定量することによって、元のタンパク質の含有量を推定する定量的分析法が近年確立されてきている（非特許文献１）。この方法は、対象がイオン化しやすいペプチドであるため感度が高く、安定同位体により標識された内部標準（内標）を用いることで精度の高い定量が可能である。さらに、質量分析計をナノスケールの液体クロマトグラフィーによるペプチドの分離と接続し、ペプチドの溶出にあわせて連続的に測定することで、測定系の感度はフェムトモル以下のレベルまで飛躍的に向上している。
　タンパク質のプロテアーゼ処理による断片化を効率的に実施するために、プロテアーゼ処理に先立って、熱・pH・変性剤を用いての変性処理、ジスルフィド結合を切断するためのジチオトレイトール（dithiothreitol：ＤＴＴ）、2-メルカプトエタノール（2-mercaptoethanol：２－ＭＥ）やトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride：ＴＣＥＰ）での還元処理、チオール基の保護、不可逆的な解離状態維持のためのヨードアセトアミド（2-iodoacetamide：ＩＡＡ）によるアルキル化処理等が一般的に行われている。
　生体試料においては、多種多様のタンパク質が異なる濃度で共存しており、とりわけ血中タンパク質の濃度範囲は１０９オーダーにも及ぶ。これに対して質量分析計にて捕捉可能なダイナミックレンジは１０３～１０４程度であるため、血中の微量タンパク質の質量分析計による検出は極めて困難である。
　たとえば、上記方法を血清試料に対して適用し、試料中のタンパク質をほぼ完全に断片化した場合、その生成物はアルブミンなどの高濃度で含まれるタンパク質由来のペプチドで占められ、分析系を飽和してしまう。特にアルブミンは血中タンパク質の５０％以上を占めることが知られており、従来の方法で前処理を行ってペプチドを検出すると、そのほとんどがアルブミン由来のピークとなってしまい、微量に含まれる目的のタンパク質由来のピークはきわめて検出されにくくなってしまう。
　この問題を解決するために、消化ペプチドを多段階の精製により細分画し、全体から濃縮されたわずかな画分を集中的に分析に供する方法（非特許文献２）や、定量の対象となるペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫沈降やイオン交換クロマトグラフィー等のペプチドレベルでの濃縮を行う方法（非特許文献３）が提案されている。しかしながら、これらの方法は非常に煩雑な前処理を伴うため、臨床検査に求められるスループットとコストの制約から外れてしまう。
　すなわち、これらの方法においても、血清試料における濃度幅をどのように簡便に解消するかが、質量分析によるバイオマーカー等のタンパク質の定量的測定に汎用性をもたせるための鍵となっている。血清又は血漿を試料として、抗体を用いず、簡便かつ高速な処理により、目的ペプチドの検出効率を高められる汎用的な技術は、現在のところ報告されていない。
国際公開第１９９６／０３６７３２号 特許第４９８３８０３号
Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100 (12), 6940-5 Proc Natl Acad Sci USA 2012, 109 (38), 15395-400 J Proteome Res 2012, 11 (3), 1868-78
　本発明の目的は、血清又は血漿試料から単一又は複数の目的タンパク質を質量分析により検出するための血清又は血漿試料の前処理方法、及び該タンパク質の検出方法であって、アルブミン等の試料中に多量に存在するタンパク質を簡便な方法で除去し、目的のタンパク質由来の消化ペプチドを回収する方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく様々な測定方法を検討した結果、驚くべきことに、緩衝剤を用いた血清又は血漿の希釈や変性を最小限に抑えた状態で、血清又は血漿に対してプロテアーゼを直接添加して消化を行うことにより、アルブミン等に由来するペプチドの生成を抑えながら目的タンパク質の定量に必要なペプチドを確保できることを見出した。更に、プロテアーゼ処理の後、未消化のタンパク質を除去することにより、目的タンパク質由来のペプチドの割合を相対的に高めることができる。
　本発明の方法により、血清及び血漿中に多量に含まれているアルブミンは分解されず、質量分析においてアルブミン由来のペプチドのピークは全く検出されないという驚くべき結果が得られた。すなわち、本発明に記載の方法は、プロテアーゼによる消化に対する感受性に基づいて目的タンパク質の特異的消化と濃縮とを同時に行う方法であり、質量分析を用いて目的タンパク質を検出・定量する分析系において、低い血中濃度のタンパク質を従来法と比較して極めて簡便に検量することを可能にするものである。
　すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
１．血清又は血漿試料中のタンパク質を質量分析によって検出するための試料の前処理方法であって、タンパク質の未変性条件下で該試料にプロテアーゼを添加して消化する工程と、得られたペプチドを未消化のタンパク質と分離する工程とを含む、上記前処理方法。
２．血清又は血漿試料中のタンパク質を質量分析によって検出するための方法であって、タンパク質の未変性条件下で該試料にプロテアーゼを添加して消化する工程と、得られたペプチドを未消化のタンパク質と分離する工程と、該ペプチドを質量分析に供する工程とを含む、上記方法。
３．プロテアーゼ処理の前及び／又は後にタンパク質又はペプチドの濃縮工程を含まない、上記１又は２記載の方法。
４．プロテアーゼがトリプシンである、上記１～３のいずれか記載の方法。
５．プロテアーゼとして固定化酵素を用いる、上記１～４のいずれか記載の方法。
６．試料中にα２マクログロブリンが存在する、上記１～５のいずれか記載の方法。
７．ＬＣ／ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ法によって分析する、上記１～６のいずれか記載の方法。
８．ＭＳ／ＭＳ分析を行う、上記１～７のいずれか記載の方法。
９．アルブミンが消化されない、上記１～８のいずれか記載の方法。
　本発明は、質量分析を用いたタンパク質の検出において、従来の方法がタンパク質の効率的な断片化を追求していたのとは対照的に、プロテアーゼによる消化が生じにくい条件を利用して驚くべき結果が得られるとの発見に基づくものである。
　本発明の方法により、従来行われていたタンパク質の変性・還元・アルキル化等の前処理が不要となると共に、タンパク質又はペプチドの濃縮ステップを行う必要なしに試料中の微量タンパク質を定量することが可能となった。これにより、前処理に要する時間及びコストを削減し、ハイスループットの定量方法を提供することができる。
本発明による前処理方法及び従来法による前処理により得られた血清消化ペプチドのマススペクトルを示す。観測されたピークのうち、＊印はアルブミンに由来するピークを示す。内部標準としてＰ１４Ｒ（配列番号１２、ｍ／ｚ　１５３３．９）を脱塩後にスパイクした。上段の結果は従来法、下段の結果は本発明の方法によって得られた結果を示す。 ３００、１５０、７５及び３８μｇ／ｍＬのアネキシン　Ａ４（ＡＮＸＡ４）スパイク濃度の血清試料より得られた血清消化ペプチドのマススペクトルについて、ｍ／ｚ　１３７９周辺を拡大して示す。ＡＮＸＡ４に由来するペプチドを矢印で示す（Ａ：従来法、Ｂ：本発明による方法）。 ３００、１５０、７５及び３８μｇ／ｍＬのＡＮＸＡ４スパイク濃度の血清試料より従来法にて得られた血清消化ペプチドのスポットから、ｍ／ｚ　１３７９．６に対してＭＳ／ＭＳ測定を行ったプロダクトイオンスペクトルを示す。 ３００、１５０、７５、３８、１９、９及び５μｇ／ｍＬのＡＮＸＡ４スパイク濃度の血清試料より本発明の方法にて得られた血清消化ペプチドのスポットから、ｍ／ｚ　１３７９．６に対してＭＳ／ＭＳ測定を行ったプロダクトイオンスペクトルを示す。 アネキシンＡ４（ＡＮＸＡ４）をトリプシン消化に供し得られたペプチドのマススペクトルを示す。上段は、ＡＮＸＡ４単独をトリプシン消化に供した結果、下段は、ＡＮＸＡ４をあらかじめα２マクログロブリンと混合及び加熱の後に消化した結果をそれぞれ示す。 ３００、１５０、７５及び３８μｇ／ｍＬのアネキシン　Ａ４（ＡＮＸＡ４）スパイク濃度の血清試料より従来法にて得られた血清消化ペプチドのマススペクトルについて、ｍ／ｚ　１５８１周辺を拡大して示す。ＡＮＸＡ４に由来するペプチドを矢印で示す。 ３００、１５０、７５及び３８μｇ／ｍＬのアネキシン　Ａ４（ＡＮＸＡ４）スパイク濃度の血清試料より本発明の方法にて得られた血清消化ペプチドのマススペクトルについて、ｍ／ｚ　１５８１周辺を拡大して示す。ＡＮＸＡ４に由来するペプチドを矢印で示す。 ３００、１５０、７５及び３８μｇ／ｍＬのＡＮＸＡ４スパイク濃度の血清試料より従来法にて得られた血清消化ペプチドのスポットから、ｍ／ｚ　１５８１．７に対してＭＳ／ＭＳ測定を行ったプロダクトイオンスペクトルを示す。 ３００、１５０、７５、３８、１９、９及び５μｇ／ｍＬのＡＮＸＡ４スパイク濃度の血清試料より本発明の方法にて得られた血清消化ペプチドのスポットから、ｍ／ｚ　１５８１．７に対してＭＳ／ＭＳ測定を行ったプロダクトイオンスペクトルを示す。
　本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
　本明細書において、「血清又は血漿試料」とは、目的のタンパク質の存在について検出することが意図される、被験者から採取した血液由来の試料であって、血清若しくは血漿そのもの、またはこれらに由来する試料であり、例えば試料の保存等のために薬剤を添加したものも含まれることは当業者に理解されるであろう。被験者としては、限定するものではないが、哺乳動物、特にヒトが挙げられる。
　上記のように、従来の方法では、血清又は血漿試料は、目的とするタンパク質の検出に先立って、タンパク質の変性・還元処理、アルキル化処理を行い、その後にプロテアーゼ処理を行っている。また、微量タンパク質・ペプチドの検出のためには、プロテアーゼ処理の前及び／又は後に、例えば免疫沈降やイオン交換クロマトグラフィー等によって、適宜タンパク質・ペプチドの濃縮処理を行っている。更に、一般的に、プロテアーゼによってタンパク質を消化する際に、反応液を適度なｐＨやイオン強度の環境に調整する目的で酵素消化反応緩衝剤が添加される。例えば、トリプシンを反応させる場合は、ｐＨ調整を目的として重炭酸アンモニウム溶液、トリス緩衝液等を用いることが多い。従来法では更に、前処理のために添加した試薬、特に変性のために添加した高濃度の尿素や界面活性剤がプロテアーゼ処理や質量分析に影響しないように更なる処理も必要とされる。
　本明細書において、タンパク質の「変性」とは、タンパク質の立体構造が生体内で本来とっていた高次構造を失い変化することを意味する。たとえば、イオン強度、ｐＨ、温度の急速な変化のほか、高濃度のカオトロープ剤や界面活性剤の添加により変性が生じることが知られている。
　本発明は、タンパク質の未変性条件下で血清又は血漿試料にプロテアーゼを添加して消化する工程と、得られたペプチドを未消化のタンパク質と分離する工程とを含む前処理方法、更に該ペプチドを質量分析に供する工程を含む、質量分析によるタンパク質の検出方法を提供する。本発明の方法は、好ましくはプロテアーゼ処理の前及び／又は後に従来行われていたようなタンパク質又はペプチドの濃縮工程を含まない。
　「未変性条件」とは、タンパク質を変性させるために当分野において通常用いられる変性のための処理、例えば尿素等の変性剤による処理等を行わないことに加えて、血清又は血漿等の生体試料が本来有する構成成分の組成及び温度等の状態を変化させないことを意味する。具体的には、以下に挙げる処理内容を避けることを意味する：有機溶媒の添加；臨界ミセル濃度以上の界面活性剤及び合成高分子の添加；２倍以上の塩濃度の増減；酸化剤、還元剤及び反応性の高い試薬の添加；１０倍以上のタンパク質濃度の減少；水分の除去（ただし凍結乾燥を除く）；ｐＨ７以下又は９以上への誘導；－３０℃以上における長時間の放置；６０℃以上への加熱。当業者であれば、上記を含め、タンパク質を変性させる具体的条件、あるいは変性させない具体的条件について理解することができる。
　本発明の方法において、検出結果に若干の影響を与え得る内在性プロテアーゼ活性を抑制し、なおかつ目的タンパク質に対する検出効果を高める工程として、プロテアーゼ処理に先立って、非働化処理を行うことが好ましい。非働化は、例えば５６℃で３０～４０分間の加熱処理によって行うことができる。非働化のための条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
　本発明の方法においては、得られた血清又は血漿試料にプロテアーゼを直接添加する。ここで「直接添加」するとは、採取された血清又は血漿試料に対してタンパク質の変性処理を行うことなく、必要最小限の溶液組成で、タンパク質を含む試料中に添加することである。例えば、添加するプロテアーゼは超純水又は１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の濃度の塩酸を用いて１０ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度に調製し、これを血清又は血漿試料の容量に対して約１／５０量を直接添加することにより、試料本来の組成をほとんど変えることなく、消化反応を開始することができる。血清又は血漿中のｐＨは本来重炭酸イオンの緩衝によりｐＨ７．４０に保たれているため、別途緩衝液によるｐＨ調整を行うことなくトリプシンを含む多くのプロテアーゼに適した反応環境となっているが、特段の必要があれば、ｐＨ７～９の範囲、より好ましくはｐＨ７．４～７．８の範囲で、ｐＨ調整を行ってもよい。ｐＨ調整のための条件は、当業者であれば適宜決定することができるが、特に好ましくはリン酸ナトリウムによる緩衝が挙げられる。
　本発明において好適に用いられる「プロテアーゼ」としては、好ましくは、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ　Ａｓｐ－Ｎ、Ｖ８プロテアーゼ、メタロエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｎ等が挙げられ、特に好ましくは、トリプシンが挙げられる。トリプシンは基質特異性が高く、また切断後のペプチドのＣ末端にＬｙｓ又はＡｒｇがあるためにペプチドの電荷量及び電荷局在を均質にすることができ、質量分析のための試料の作製のために特に好適である。
　試料へ添加するプロテアーゼの量は、用いるプロテアーゼ及び試料の種類、温度、処理時間等の条件に応じて変動し得るが、好ましくは、血清又は血漿試料１００μＬに対し、添加するプロテアーゼ量が１～５０μｇ、好ましくは２０～４０μｇとなるようにする。一実施形態として、本発明の方法において、血清１００μＬあたりおよそ２０μｇのトリプシンを添加する。
　プロテアーゼ処理における反応温度は０～４０℃、好ましくは４℃～３７℃であり、処理時間は１～２４時間、好ましくは３～１６時間、更に好ましくは８～１２時間の範囲で好適にプロテアーゼ処理を行うことが可能であるが、当業者であれば、これらの条件を適宜変更・選択し得る。また、プロテアーゼは、特に限定するものではないが、上記のように高濃度に調製した溶液又は懸濁液として使用される。分解後、プロテアーゼはタンパク質を分離させる工程で容易に除去することができる。また、プロテアーゼを固体担体に結合させた固定化酵素として用い、固定化した酵素に対して試料を適用することもできる。固定化酵素の作製方法は当分野において周知である。担体としては、特に限定するものではないが、例えばアガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、及び磁性体が挙げられる。これらの固定化酵素も、タンパク質を分離する工程で除去することができる。
　血清又は血漿試料を用い、上記の条件下で処理した場合、驚くべきことに、血清又は血漿中に高濃度に存在するアルブミン、グロブリン、トランスフェリンが消化されず、得られたペプチドを質量分析にかけた結果、マススペクトル中にこれらのタンパク質由来のピークが含まれないことが見出された。特に、タンパク質の５０％以上を占めるアルブミンが消化されないことから、従来の方法では微量であるために検出が困難であったペプチドの検出が可能となり、試料中の目的のタンパク質・ペプチドの検出を非常に簡便・迅速に行うことができる。
　あるタンパク質について用いる「消化されない」及び「未消化」との用語は、試料中に存在するそのタンパク質の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上が添加されたプロテアーゼによる分解を受けずにタンパク質のままで残存することを意味する。換言すれば、血清又は血漿を試料として用いる場合、試料中に多量に存在する夾雑タンパク質、特に多量に含まれるアルブミンのプロテアーゼによる分解は１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、更に好ましくは１％未満である。最も好ましくは、本発明の方法において、アルブミンは全くプロテアーゼによる分解を受けない。未消化のタンパク質は、本発明の方法において、後のタンパク質とペプチドとの分離工程によって除去される。
　「未消化のタンパク質」とは、試料中において、その三次構造及び四次構造が高度に折り畳まれている、及び、他のタンパク質と結合した状態である、等の理由により、プロテアーゼとの相互作用が阻害され、本発明の条件下においては消化を受けないタンパク質を意味する。本発明の方法は、このような性質をもつタンパク質以外の消化を優先的に進めることにより、消化ペプチドのレベルで本来の濃度比を逆転するように設計されている。
　一方、血清又は血漿中には、α２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）と呼ばれるタンパク質が存在することが知られている。Ａ２Ｍは、幅広い種類のプロテアーゼをカゴ状のＡ２Ｍ分子の内部に固定する機能をもつプロテアーゼ阻害剤であり、血清中に約１～２ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれている。Ａ２Ｍ内部に固定された状態のプロテアーゼは活性を維持したままであり、Ａ２Ｍ内部にアクセス可能な分子量の小さい分子であれば、継続して消化を受けることが知られている（Sottrup-Jensen, L., J Biol Chem 1989, 264 (20), 11539-42）。特に理論に拘束されるものではないが、本発明の方法の条件下において優先的に消化を受けるタンパク質の中には、血中のＡ２Ｍ分子を介して消化を受けるものが含まれることが考えられる。すなわち、血清等の試料に添加されたプロテアーゼは、試料中のＡ２Ｍと反応し、Ａ２Ｍ内部に共有結合した状態で、試料中のタンパク質に対して作用しているものと考えられる。従って、分析対象のタンパク質としては、約１０ｋＤａ以下の分子量を有するものが本発明においてより好適であり得る。また、本発明の方法で消化を受けるタンパク質の中には、タンパク質を消化した際に生じ得る全ペプチドのうち、一部のみが感度よく検出される場合がある。これは、Ａ２Ｍ内部のプロテアーゼが作用する際に、対象のタンパク質の一部が選択的に消化される状況を反映しているものと考えられる。
　また、試料中の検出の目的とするタンパク質の濃度は、測定系の感度に依存するが、１μｇ／ｍＬ以上、特に５～１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度が本発明の方法で有利に検出される。より具体的には、実際に検出するペプチドの量が１０～１０，０００ｆｍｏｌの範囲の量であれば良い。５μg／ｍＬのタンパク質を含むサンプル０．１μＬをＭＳによる測定に用いた場合、検出されるペプチドの量は約１５ｆｍｏｌになる。
　本発明の方法において、上記の未消化のタンパク質は、タンパク質と消化されたペプチドの性質の違いを利用して、ペプチドと分離する。このためには、例えば、有機溶媒又は酸を添加してタンパク質を沈殿させその遠心上清を回収する、限外ろ過やゲルろ過により高分子量のタンパク質と低分子量のペプチドに分画する、タンパク質のもつ強い疎水性相互作用を利用して担体に選択的に結合させる、などの方法が挙げられる。プロテアーゼによる反応後にこの工程を行うことにより、血清又は血漿試料中において本来濃度が高く、かつプロテアーゼ消化に対して抵抗性を示すタンパク質が、試料から除去され、微量タンパク質由来のペプチドを含む試料を質量分析に供することができる。
　上記のように、本発明の方法に従って血清又は血漿試料の前処理を行い、得られたペプチドを質量分析計によって測定を行うことで、試料中に多量に存在する、例えばアルブミン等のタンパク質による妨害を受けることなく、試料中の微量タンパク質の検出を簡便かつ高スループットで実施することができる。
　質量分析は、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法等を用いてイオン化したペプチドを、二重収束型、四重極型、飛行時間型（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサクロトロン共鳴型等の分析装置を用いて行うことができる。また、高速液体クロマトグラフィーと組み合わせた液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）で分析しても良い。質量分析はペプチドの定量的検出のために当分野において広く用いられているＬＣ／ＭＳシステムの、トリプル四重極型質量分析計によるマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）によって行うことができる。ＭＲＭの測定は、例えばＬＣＭＳ－８０８０（島津製作所）で行うことができる。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの測定は、例えばＡＸＩＭＡ－Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（島津製作所）で行うことができる。
　詳細かつ精密な分析のために使用されるタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析は、目的のペプチド由来の前駆イオンを選択して更に質量分析に供するものであり、生成されたプロダクトイオンによってペプチドの同定・定量をすることができる。得られた分析結果により、対照サンプルを用いて同様にして得たピーク情報、あるいは既知のデータベース内の情報を参照して目的のペプチドであることを確認することができ、またペプチドのアミノ酸配列の決定を行うことができる。ＭＳ／ＭＳの測定は、例えばＡＸＩＭＡ－Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（島津製作所）で行うことができる。
　本発明の方法において、より具体的には、まず、検出対象のタンパク質において実際に質量分析によって分析するペプチドを選択する。
　タンパク質のアミノ酸配列の情報は、例えば http://www.uniprot.org/ から入手することができる。タンパク質をプロテアーゼで分解した際に生じうるペプチドの種類については、例えば http://web.expasy.org/peptide_mass/から予測することができる。プロテアーゼ消化により生じたペプチドの質量分析による測定結果のデータは、例えば http://peptide.nist.gov/ にて照会することができる。
　例えばトリプシンで消化後に質量分析に供し得るペプチドの選択において、そのアミノ酸配列についていくつかの排除基準が知られている（Nat. Biotechnol. 2009, 27(2), 190-8）。具体的には、例えば、検出結果の信頼性のためには同じ配列が複数のタンパク質中に存在しないことは必須であり、例えば８アミノ酸未満の親水性ペプチドや２０アミノ酸を超える疎水性ペプチドではないこと；トリプシン消化でカルボキシ末端となる塩基性アミノ酸が隣接していないこと（ＫＫ、ＲＲ、ＫＲ、ＲＫ）；システイン残基、メチオニン残基、Ｎ－末端グルタミン若しくはアスパラギンを含まないこと、が好ましいとされている。質量分析での検出のためのマーカーとして好適なペプチドは、これらの情報に基づいて、コンピュータ上で予測することができ、当業者はこの中から定量に用いるペプチドを任意に選択できる。
　一実施形態として、一部の卵巣癌で高発現することが知られているアネキシン　Ａ４（配列番号１）を血中から検出するためのペプチドとし、以下の条件：
　　（条件１）同じアミノ酸配列が他のタンパク質中に存在しないこと；
　　（条件２）配列中にシステインを含まないこと；
　　（条件３）配列のアミノ酸の数が８～２０であること；
　　（条件４）配列のＮ末端がグルタミンまたはアスパラギン以外であること；を満たすものを好適な候補ペプチドとした場合、以下のペプチドを選択することができる。
　　ＡＡＳＧＦＮＡＭＥＤＡＱＴＬＲ（配列番号２、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０－２４に相当）；
　　ＧＬＧＴＤＥＤＡＩＩＳＶＬＡＹＲ（配列番号３、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号２９－４４に相当）；
　　ＩＳＱＴＹＱＱＱＹＧＲ（配列番号４、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１２４－１３４に相当）；
　　ＳＤＴＳＦＭＦＱＲ（配列番号５、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１４２－１５０に相当）；
　　ＶＬＶＳＬＳＡＧＧＲ（配列番号６、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１５１－１６０に相当）；
　　ＤＥＧＮＹＬＤＤＡＬＶＲ（配列番号７、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１６１－１７２に相当）；
　　ＳＥＴＳＧＳＦＥＤＡＬＬＡＩＶＫ（配列番号８、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号２２６－２４１に相当）；
　　ＧＬＧＴＤＤＮＴＬＩＲ（配列番号９、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号２６０－２７０に相当）；
　　ＡＥＩＤＭＬＤＩＲ（配列番号１０、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号２７６－２８４に相当）；
　　ＧＤＴＳＧＤＹＲ（配列番号１１、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号３０１－３０８に相当）。
　コンピュータ上で予測されたペプチドは、実際にはタンパク質の立体構造中の位置等の条件によってプロテアーゼの消化を受けにくい場合もあり得る。特に、Ａ２Ｍを介して消化を受けるタンパク質においては、Ａ２Ｍ存在下で消化を受けやすい部位に由来するペプチドを測定対象として選択することが好ましい。また、たまたま同一の質量をもつ別個のペプチドが存在することにより、両者を区別することができない場合もあり得る。従って、あるタンパク質について本発明の方法を応用した検出を例えば臨床応用のために実現化するに際しては、予測されたペプチドがマーカーとして適するか否かを検討し、候補ペプチドの中から最適のペプチドを選別することが必要である。アネキシン　Ａ４の検出のためのペプチドとして、本発明の方法において特に好ましいものは配列番号２、３及び７に示すアミノ酸配列を有するペプチドである。
　以下に本発明を、実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
［分析対象ペプチドの選定］
　本発明の方法により、卵巣癌のバイオマーカーとして期待される、血清中に微量に含まれるアネキシン　Ａ４（ＡＮＸＡ４）（配列番号１）の半定量的な検出を行った。
　Expert Rev. Proteomics 2004, 1(4), 503-12; Nat. Biotechnol. 2009, 27(2), 190-8に記載された条件に従って、本発明の方法に好適なペプチドとして、ＤＥＧＮＹＬＤＤＡＬＶＲ（配列番号７）を選択した。
［試料及びプロテアーゼの調製］
　市販のヒト血清（製品コード１４－４０２Ｅ、ロンザジャパン）に対して、大腸菌の発現系により得た精製リコンビナントタンパク質ＡＮＸＡ４を３ｍｇ／ｍＬの濃度で１０％量添加し、それを上記の血清にて段階希釈することで、ＡＮＸＡ４の濃度が３００、１５０、７５、３８、１９、９、及び５μｇ／ｍＬの血清試料をそれぞれ調製した。血清試料は５６℃、４０分の加熱処理により非働化し、さらに０．４４μｍフィルター（ウルトラフリー、ミリポア社）にて清澄化した。粉末状のトリプシン（製品コード２０３－０９８９３、和光純薬）を１ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液にて１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、トリプシン溶液とした。
［本発明による前処理］
　本発明による前処理工程を以下に説明する。上述のように調製した血清試料各１００μＬを１．５ｍＬ容量のエッペンドルフチューブに取り、トリプシン溶液２μＬを添加し、３７℃で１６時間反応させた（血清試料１００μＬに対してトリプシン約２０μｇ）。反応後の試料を限外濾過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ　１０，０００ＭＷＣＯフィルター、ミリポア社）の上部に移し、１０，０００ｇ、６０分の条件で遠心分離し、フィルター下部に移行した濾液をそのまま質量分析用の試料とした。
［従来の方法による前処理］
　従来の方法による血清のトリプシン消化ペプチドの調製工程を以下に説明する。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに粉末ウレア１０ｍｇを量りとり、上述のように調製した血清１０μＬを添加した（変性）。混合後、５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を２μＬ加え、３７℃，３０分間の条件で反応させた（還元）。次に、０．５ｍｏｌ／Ｌのヨードアセトアミド及び１ｍｏｌ／Ｌの重炭酸アンモニウムの混合溶液を０．８μＬ加え、常温で４５分間反応させた（アルキル化）。これを１６０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、さらに前述のトリプシン溶液を２μＬ加えて、３７℃で１６時間反応させた（血清試料１０μＬに対してトリプシン約２０μｇ）。反応後のペプチド溶液に１０％トリフルオロ酢酸を４μＬ加え、質量分析用の試料とした。
［ＭＡＬＤＩ　ＭＳ測定］
　上記で得られた試料０．５μＬを、ＺｉｐＴｉｐ（商標、ミリポア社）により脱塩した。この際、試料を１ｎｍｏｌ／ｍＬの標準ペプチド（アミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＲ（配列番号１２）、以下Ｐ１４Ｒ）を含む１０μＬの０．１％トリフルオロ酢酸にて希釈し、溶出液の１／１０をμＦｏｃｕｓｉｎｇプレート（島津ＧＬＣ）にスポッティングした。風乾後、マトリックスとして３ｍｇ／ｍＬの２，５－ジヒドロキシ安息香酸を１μＬスポッティングし、結晶化の後、ＭＡＬＤＩ　ＭＳ（ＡＸＩＭＡ－Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、島津製作所）にて測定した。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＭｉｄＭａｓｓモード、レーザー強度１００の条件でのラスター駆動により２００箇所から合計２００プロファイルを取得し積算することで、各スポットよりマススペクトルを取得した。
［ＭＳ／ＭＳ測定］
　ＭＳ／ＭＳの測定は、対象のモノアイソトピックマスに対してイオントラップを設定したうえで、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｍｉｄｍａｓｓモード、レーザー強度１１０の条件でのラスター駆動により２００箇所から合計２００プロファイルを取得し、積算した。ＣＩＤ（Collision Induced Dissociation、衝突誘起解離）の強度設定値は対象にあわせて適宜調整した。
［データの処理方法］
　マススペクトルからＰ１４Ｒに由来するシグナル（ｍ／ｚ　１５３３．９）の強度及びＡＮＸＡ４（配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチド）に由来するシグナル（ｍ／ｚ　１３７９．６）の強度をそれぞれ抽出し、集計した。また、ＭＳ／ＭＳモードにより取得したｍ／ｚ　１３７９．６のプロダクトイオンスペクトルより、プロダクトイオンｍ／ｚ　４５８．３の強度を抽出し、集計した。ＭＳモードにおける信号強度はｍ／ｚ　１５３３（Ｐ１４Ｒ）に対してノーマライズを行い、イオン化に伴う信号強度の強弱について補正を行った。
［結果］
　本発明による前処理方法及び従来法による前処理により得られた血清消化ペプチドのマススペクトルを図１に示す。観測されるピークのうち、アルブミンに由来するピークを＊印により記した。比較すると、従来法（上段）においてはスペクトル中に観測される主要なピークのほぼ全てがアルブミンに由来するのに対して、本発明による方法（下段）ではアルブミン由来のピークの発生が抑えられていることが示された。
　図２は、ｍ／ｚ　１３７９．６のピーク周辺の拡大図である。矢印で示すように、従来法（Ａ）による前処理では検出されないこのピークは、本発明による前処理（Ｂ）により３８μｇ／ｍｌ以上で検出された。この結果から明らかなように、従来の方法ではＡＮＸＡ４由来のピークは全く検出されなかったのに対し、本発明の方法では濃度に依存したピークが観察された。
　上記のピーク（ｍ／ｚ　１３７９．６）を前駆イオンとして選択し、ＭＳ／ＭＳ測定によってプロダクトイオンスペクトルを取得した。図３に結果を示す。図３の結果から、ｍ／ｚ　１３７９．６のピークはＡＮＸＡ４由来のペプチド（配列番号７）によるものであることが示された。このことは、試料に添加せずにＡＮＸＡ４を直接分析して得られたものと同じスペクトルであったことからも確認された。
　また、従来の方法（図３Ａ）では血清中のＡＮＸＡ４濃度が７５μg／ｍＬ以上で検出可能となったのに対し、本発明の方法（図３Ｂ）ではわずか５μｇ／ｍＬの低濃度でも検出可能であり、検出感度が10倍以上向上した。さらに、従来法においてはＡＮＸＡ４由来ではないシグナルが多数混在しているのに対し、本発明による方法ではＡＮＸＡ４由来のシグナルのみが検出されており、Ｓ／Ｎ比も良好であった。
　上記で得られた結果に基づいて、以下の表１に、本発明による方法及び従来法によるＡＮＸＡ４由来のペプチドの検出についてまとめた。補正後のＡＮＸＡ４由来のシグナル強度について、変性を伴う従来法と本発明による直接消化法を比較したところ、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ両方のデータにおいて顕著に検出効率が向上していることがわかった。すなわち、従来の方法ではＡＮＸＡ４由来のｍ／ｚ　１３７９のピークは定量的に検出することができなかったのに対し、本発明の方法では濃度依存的にピークが検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
［分析対象ペプチドの選定］
　本発明の方法に好適なペプチドの候補として上記に挙げた配列番号２－１１のペプチドがあるが、この中から特に好適なペプチドを選択するため、α２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）を用いた予備実験を実施した。
　Ａ２Ｍタンパク質（製品コードＭ６１５９、シグマアルドリッチ社）及び大腸菌の発現系により得た精製リコンビナントタンパク質ＡＮＸＡ４を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて２ｍｇ／ｍＬ及び３ｍｇ／ｍＬの濃度にそれぞれ調製した。粉末状のトリプシン（製品コード２０３－０９８９３、和光純薬）を１ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液にて１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、トリプシン溶液とした。
　７．５μＬのＡ２Ｍ溶液、２μＬのＡＮＸＡ４溶液を混合し、ＰＢＳ１０μＬを加え、５６℃にて３０分間加熱した後、０．５μＬのトリプシン溶液を加えて４℃、１２時間の条件で消化を行った。比較対照として、Ａ２Ｍ溶液をＰＢＳに置き換え、同様に処理を行った。消化後、得られたペプチドをＺｉｐＴｉｐ（商標、ミリポア社）により脱塩し、溶出液をμＦｏｃｕｓｉｎｇプレート（島津ＧＬＣ）にスポッティングした。風乾後、マトリックスとして３ｍｇ／ｍＬの２，５－ジヒドロキシ安息香酸を１μＬスポッティングし、結晶化の後、ＭＡＬＤＩ　ＭＳ（ＡＸＩＭＡ－Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、島津製作所）にて測定した。
　Ａ２Ｍ（最終濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ）の存在下及び非存在下におけるＡＮＸＡ４消化ペプチドのマススペクトルを図４に示す。得られたマススペクトルを比較した結果、ＡＮＸＡ４単独を添加し、Ａ２Ｍ非存在下における消化（上段）においては種々のペプチド種が高い信号強度で検出されるのに対して、Ａ２Ｍ存在下（下段）では、ペプチドＡＡＳＧＦＮＡＭＥＤＡＱＴＬＲ（ｍ／ｚ　１５８１．７、配列番号２）及びペプチドＧＬＧＴＤＥＤＡＩＩＳＶＬＡＹＲ（ｍ／ｚ　１６８２．９、配列番号３）のピークが明瞭に確認され、これらが選択的に検出されていることが示された。本発明の方法においては、これらのペプチドが血清試料から感度良く検出されることが期待される。
　そこで、特に感度良く検出されることが明らかとなった、ＡＡＳＧＦＮＡＭＥＤＡＱＴＬＲ（配列番号２）を、分析対象ペプチドとして以下の実施例のために選択した。
［実施例３］
［試料及びプロテアーゼの調製］
　実施例１と同様にして行った。
［本発明による前処理］
　トリプシンによる消化条件を４℃で１６時間とする以外は実施例１と同様にして行った。
［従来の方法による前処理］
　実施例１と同様にして行った。
［ＭＡＬＤＩ　ＭＳ測定］
　上記で得られた試料０．５μＬを、ＺｉｐＴｉｐにより脱塩し、溶出液に１０ｐｍｏｌの標準ペプチドＰ１４Ｒを添加し、その１／１０量をμＦｏｃｕｓｉｎｇプレート（島津ＧＬＣ）にスポッティングした。風乾後、マトリックスとして３ｍｇ／ｍＬの２，５－ジヒドロキシ安息香酸を１μＬスポッティングし、結晶化の後、ＭＡＬＤＩ　ＭＳ（ＡＸＩＭＡ－Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、島津製作所）にて測定した。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＭｉｄＭａｓｓモード、レーザー強度１００の条件でのラスター駆動により２００箇所から合計２００プロファイルを取得し積算することで、各スポットよりマススペクトルを取得した。
［ＭＳ／ＭＳ測定］
　実施例１と同様にして行った。
［データの処理方法］
　マススペクトルから信号強度０．５ｍＶを閾値にピーク検出を行い、その中からＰ１４Ｒに由来するシグナル（ｍ／ｚ　１５３３．９）の強度及びＡＮＸＡ４（配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド）に由来するシグナル（ｍ／ｚ　１５８１．７）の強度をそれぞれ抽出し、集計した。また、ＭＳ／ＭＳモードにより取得したｍ／ｚ　１５８１．７のプロダクトイオンスペクトルより、プロダクトイオンｍ／ｚ　５８８．３（配列番号２のｙ５イオンに相当）の強度を抽出し、集計した。この際、閾値０．５ｍＶのピーク検出処理において認識されなかったシグナルを不検出（ＮＤ）とした。ＭＳモードにおける信号強度はｍ／ｚ　１５３３（Ｐ１４Ｒ）に対してノーマライズを行い、イオン化に伴う信号強度の強弱について補正を行った。
［結果］
　図５は、ｍ／ｚ　１５８１．７のピーク周辺の拡大図である。矢印で示すように、従来法（Ａ）による前処理では検出されないこのピークは、本発明による前処理（Ｂ）により３８μｇ／ｍｌ以上で検出された。この結果から明らかなように、従来の方法ではＡＮＸＡ４由来のピークは全く検出されなかったのに対し、本発明の方法では濃度に依存したピークが観察された。なお、本実験条件において、ＡＮＸＡ４由来ペプチドの候補ペプチド（配列番号２－１１）のうち、マススペクトル中から実際に検出されたのは配列番号２及び３のみであり、実施例２において好適とされたペプチドと一致していることが確認された。
　上記のピーク（ｍ／ｚ　１５８１．７）を前駆イオンとして選択し、ＭＳ／ＭＳ測定によってプロダクトイオンスペクトルを取得した。図６に結果を示す。図６の結果から、ｍ／ｚ　１５８１．７のピークはＡＮＸＡ４由来のペプチド（配列番号２）によるものであることが示された。このことは、試料に添加せずにＡＮＸＡ４を直接分析して得られたものと同じスペクトルであったことからも確認された。
　また、従来の方法（図６Ａ）では血清中のＡＮＸＡ４濃度が７５μg／ｍＬ以上で検出可能となったのに対し、本発明の方法（図４Ｂ）ではわずか５μｇ／ｍＬの低濃度でも検出可能であり、検出感度が10倍以上向上した。さらに、従来法においてはＡＮＸＡ４由来ではないシグナルが多数混在しているのに対し、本発明による方法ではＡＮＸＡ４由来のシグナルのみが検出されており、Ｓ／Ｎ比も良好であった。
　上記で得られた結果に基づいて、以下の表２に、本発明による方法及び従来法によるＡＮＸＡ４由来のペプチドの検出についてまとめた。補正後のＡＮＸＡ４由来のシグナル強度について、変性を伴う従来法と本発明による直接消化法を比較したところ、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ両方のデータにおいて顕著に検出効率が向上していることがわかった。すなわち、従来の方法ではＡＮＸＡ４由来のｍ／ｚ　１５８１．７のピークは定量的に検出することができなかったのに対し、本発明の方法では濃度依存的にピークが検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以上の結果から、本発明の前処理方法は、アルブミン等の血中に多量に存在するタンパク質の影響を排して目的タンパク質由来のペプチドシグナルを得るために有効であることは明らかであり、質量分析によるバイオマーカー測定のための前処理としてより利便性を提供しうるものである。
　本発明は、ＬＣ／ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより血液中のタンパク質を検出・同定するための方法として考案された。本発明は、これらの質量分析装置を用いた疾患バイオマーカーの探索や、バイオマーカー測定による臨床検査を実現するために有用な、血液試料の前処理方法を提供する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (9)

  1. 　血清又は血漿試料中のタンパク質を質量分析によって検出するための試料の前処理方法であって、タンパク質の未変性条件下で該試料にプロテアーゼを添加して消化する工程と、得られたペプチドを未消化のタンパク質と分離する工程とを含む、上記前処理方法。
  2. 　血清又は血漿試料中のタンパク質を質量分析によって検出するための方法であって、タンパク質の未変性条件下で該試料にプロテアーゼを添加して消化する工程と、得られたペプチドを未消化のタンパク質と分離する工程と、該ペプチドを質量分析に供する工程とを含む、上記方法。
  3. 　プロテアーゼ処理の前及び／又は後にタンパク質又はペプチドの濃縮工程を含まない、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　プロテアーゼがトリプシンである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　プロテアーゼとして固定化酵素を用いる、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　試料中にα２マクログロブリンが存在する、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　ＬＣ／ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ法によって分析する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　ＭＳ／ＭＳ分析を行う、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　アルブミンが消化されない、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
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