JP2000503641A

JP2000503641A - 標識ビタミンｄ化合物およびその使用

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Publication number: JP2000503641A
Application number: JP09524458A
Authority: JP
Inventors: ホリック，マイケル・エフ; レイ，ラウル
Original assignee: エイ・アンド・ディ・アッセイ・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2000-03-28
Also published as: WO1997024127A1; US20020107411A1; EP0873126A1; CA2239617A1; US6455714B1; EP0873126A4; US5981779A; AU1429397A; DE873126T1; US6291693B1

Abstract

(57)【要約】ビオチン、蛍光および化学発光標識ビタミンＤ化合物、並びに生物学的液体におけるビタミンＤ、その代謝物およびビタミンＤ類似体の存在についてのアッセイにおけるその使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】標識ビタミンＤ化合物およびその使用発明の背景発明の分野本発明は、非放射性ビタミンＤ化合物、および、乳汁、血液または他の生物学的液体中に存在し得るビタミンＤ、ビタミンＤ類似体およびその代謝物の存在についてのアッセイ法に関する。本発明で使用するアッセイ法は、酵素免疫測定法 (ＥＬＩＳＡ)(ビオチン含有化合物を用いる)および蛍光比色法および化学発光定量法（フルオレセインまたは化学発光含有化合物を用いる）であり得る。関連分野皮膚で合成されたビタミンＤ₃であるセコーステロイドは、連続的に代謝され肝臓で２５−ヒドロキシビタミンＤ₃（２５−ＯＨ−Ｄ₃）に、腎臓で１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃に変換されることが確立されている。ビタミンＤ₃のジヒドロキシル化代謝物である１,２５（ＯＨ)₂Ｄ₃は、ビタミンＤホルモンの中で最も活性がある型であるが、これはカルシウムおよびリン酸のホメオスタシスに深く関与している (Holik,M.F.(1989)、「ビタミンＤ：生合成、代謝および作用形態」、Endocrino logy、vol.2、Degroot et al.(編)、Saunders,W.B.,Philadelphia,p.902-926)) 。ビタミンＤ₃（これは皮膚で合成される）に加えて、ビタミンＤ₂と呼ばれるビタミンＤ₃の別の化学型のものが天然に存在する。ビタミンＤ₂は、ビタミンＤ₃ と類似の方法で、２５−ヒドロキシビタミンＤ。（２５−(ＯＨ)₂−Ｄ）および1 ,２５(ＯＨ)₂Ｄ₂に代謝される。ビタミンＤ₂は、主に、食餌およびビタミンＤ補助食品から得られ、食餌中に存在するビタミンＤ₂と太陽光への暴露により皮膚で産生されるビタミンＤ₃との相対量に応じて、ビタミンＤ₂は２５−ＯＨ−Ｄ濃度の最低５〜１０％、または最高１００％であり得る(Holik,M.K.et al.(1986) 「カルシウム、リンおよび骨代謝：カルシウム調節ホルモン」、Harrison's Pri nciples of Internal Medicine、13版、Braunwald et al.(編)、McGraw-Hill、N ew York、p.2137-2151)。以下の論述において、特記しない限り、ビタミンＤ、２５−ＯＨ−Ｄおよび１,２５(ＯＨ)₂Ｄは、ビタミンＤおよびその代謝物の全プール量を示すと仮定してよい。２５−ＯＨ−Ｄおよび１,２５(ＯＨ)₂Ｄの生合成およびその代謝は、ミネラルおよび骨代謝を制御する因子により調節されている(Holick,M.F．(1989))。それゆえ、血清中１,２５(ＯＨ)₂Ｄレベルは、種々の疾患における重要な病態生理学的指標である。例えば、１,２５(ＯＨ)₂Ｄの産生は、例えば後天性または先天性ビタミンＤ代謝障害〔腎性骨ジストロフィー、特定の代謝性骨疾患、サルコイドーシス、慢性肉芽種（granulotomous）疾患に伴う高カルシウム血症、およびビタミンＤ依存性くる病Ｉ型およびII型を含む〕などの数多くの疾患によって強く影響を受ける(Holik,M.F.et al.(1986))。一方、２５−ＯＨ−Ｄの循環濃度は、ヒトにおけるビタミンＤの状態の重要な指標であると考えられている(Holik,M.F.et al.(1989)；Holik,M.F.et al.(1986 ))。例えば、皮膚におけるビタミンＤの内因性産生が不充分であること、および食餌による補給が不充分であること、および／または小腸が食餌から充分量のビタミンＤを吸収できないことが原因で起こる低ビタミン血症は、低カルシウム血症および低リン血症および対応する二次性副甲状腺機能冗進症を引き起こす(Hol ik,M.F.et al.(1986))。ビタミンＤ欠損は、臨床的に血中の２５−ＯＨ−Ｄを測定することで最も良好に決定される。２５−ＯＨ−Ｄ濃度が正常範囲の下限以下である場合、その患者はビタミンＤが欠損していると考える。低ビタミンＤ血症はまたミネラル代謝障害も引き起こす（すなわち、それぞれ小児および成人におけるくる病および骨軟化症）。血清中の２５−ＯＨ−Ｄレベルもまた、腸吸収不良症候群、肝疾患(慢性および急性)、およびネフローゼ症候群において、正常よりも低いことが判明している。高齢者の骨不足では、血清中２５−ＯＨ−Ｄレベルは、しばしば、正常よりも低いことが判明している。ビタミンＤ中毒の場合、血清中の２５−ＯＨ−Ｄレベルは、予期された通り、正常よりも高いことが判明している(Holik,M.F.et a1 .(1986))。病態生理学的に重要であることから、２５−ＯＨ−Ｄの循環濃度を正確に測定するアッセイ法の開発に向けて多大なる努力がなされている。かかる２５−ＯＨ −Ｄアッセイは、特に高齢者並びに肝疾患および腸疾患の患者におけるビタミンＤの状態を検査するために開発されている。現在までに知られている最も有効な２５−ＯＨ−Ｄのアッセイ法は、正常またはビタミンＤ欠損ラット血清（ラットＤＢＰ）の「コールド」および「ホット」（放射性）２５−ＯＨ−Ｄ₃との間の競合的結合に関する理論の種々の方法を含む。標準曲線は、測定量の２５−ＯＨ−Ｄ₃を用いて作成する。血液サンプルの有機抽出物をアッセイに加え、２５−ＯＨ−Ｄの濃度を標準曲線から決定する。２５−ＯＨ−Ｄの血清中濃度はビタミンＤのジヒドロキシル化代謝物よりもはるかに高く(１００〜１０００倍のオーダーである)、従って、かかる代謝物はアッセイに有意に影響しない。かかる状況は、ＤＢＰが、他のビタミンＤのジヒドロキシル化代謝物と比べて２５−ＯＨ−Ｄにより高い結合親和力をもつことによりさらに補われる。さらに、ＤＢＰは２５−ＯＨ−Ｄ₂と２５−ＯＨ−Ｄ₃を識別しないので、血清中の２５−ＯＨ−Ｄの測定濃度は、２５−ＯＨ−Ｄ₂と２５−ＯＨ−Ｄ₃との合計濃度を表す(Chen et al.、J.Nutritional Biochem.1:315-319(1 990))。 DeLuca、米国特許第４,２９７,２８９号では、６位がジュウテリウムまたはトリチウム原子で同位体標識されたビタミンＤ化合物、およびビタミンＤ代謝解析におけるその使用が開示されている。 DeLuca、米国特許第４,８１６,４１７号では、ビタミンＤ輸送タンパク質を含有するサンプル中における１,２５(ＯＨ)₂Ｄ_X（ただし、ｘは２、３、４、５および／または６である）の存在に関する競合的結合アッセイが開示されている。このアッセイでは、１,２５(ＯＨ)₂Ｄおよび標識１,２５(ＯＨ)₂Ｄに結合できるレセプタータンパク質を、レセプタータンパク質に結合できる抗体と共にサンプルに加える。次いで、レセプタータンパク質への標識１,２５(ＯＨ)₂Ｄの相対的結合度を測定する。かかる１,２５(ＯＨ)₂Ｄは放射標識されている。上記のアッセイは、特異的かつ効率的であるにもかかわらず、いくつかの欠点がある。かかるアッセイは時間と費用がかかる。しかし、最も重要な問題は、本質的に放射能を使用するということである。放射性同位体は非常に高価で、取り扱いや保管が危険である。放射性廃棄物処理もまた極めて費用がかかるようになってきている。ほとんど放射能を使用しないＨＰＬＣ−ＵＶ検定法も、２５−ＯＨ−Ｄをアッセイするために開発されている(Jones,G.、Clin.Chem.24:287-298(1978))。かかる方法は、多段階のクロマトグラフィー分離、そして最後に２５−ＯＨ−Ｄ₂および２５−ＯＨ−Ｄ₃に対応するピークの検知および測定を伴う。かかる方法は最も正確な血清中２５−ＯＨ−Ｄ濃度測定法の１つであるが、２つの大きな欠点がある。例えば、２５−ＯＨ−Ｄの測定は、ＵＶ測定器の測定限界により制限される。従って、２mlの血液がアッセイに必要である。幼児の２５−ＯＨ−Ｄレベルの測定に際して、かかる量が必要とされることは特に困難な問題である。加えて、かかるアッセイ方法は非常に労力を要し、従って、非常に費用がかかる。また、同位体希釈質量分析を含む非放射性方法も開発されている。この方法では、血清サンプルを、安定なＨ原子で（すなわち、ジュウテリウムでＣ−２６( ２７)位(Bjorkhem and Holmberg、Clin.Chim.Acta 68:215-224(1976))またはＣ６およびＣ−19位(Ray,R.et al.、Steroids 57:142-146(1992))について）標識した２５−ＯＨ−Ｄ₃の合成類似体に加える。「添加された」血清サンプルを、通常の方法で処理し、すなわち２５−ＯＨ−Ｄ画分を抽出し部分的に精製（種々のクロマトグラフィー段階による）し、質量分析にかける。血清中の代謝物の濃度は、標識フラグメントと比較した特定の「分子フラグメント」（親代謝物から産生されたもの）の相対量により測定する。この方法は非常に正確であるが、非常に精密で高価な機器を必要とすることからあまり実用化されていない。かかる方法はまた、非常に時間と費用がかかる。さらに、かかる方法は２５−ＯＨ−Ｄ₃ または２５−ＯＨ−Ｄ₂のいずれかに特異性があるので、２５−ＯＨ−Ｄの循環総濃度よりも低く算定される。要約として、現在までに知られている２５−ＯＨ−Ｄおよび１,２５(ＯＨ)₂Ｄアッセイには、長い所要時間、アッセイ間における誤差、多額の費用、および、特に、本質的に放射能を使用すること（ほとんどのアッセイにおいて）を含む種々の欠点があり、通常の臨床的なアッセイには最適ではない。さらに、かかるアッセイ（すなわち、ＨＰＬＣアッセイ）には、かなり大量の血清を必要とするものがある。これは、特に新生児、幼児および子供の場合には深刻な問題である。従って、手間も時間もあまり費用もかからない、血中２５−ＯＨ−Ｄおよび１,２５(ＯＨ)₂Ｄをアッセイするための非放射性で非常に高感度の方法が急いで必要とされる。本発明は、迅速で、比較的安価で容易に行える、血中２５−ＯＨ−Ｄおよび１,２５(ＯＨ)₂Ｄをアッセイするための新規な非放射性方法を提供することでかかる問題を克服する。１,２５(ＯＨ)₂Ｄの測定は、先天性および後天性２５−ＯＨ−Ｄ代謝障害の病因を決定するのに非常に価値がある(Holick(1989))。従って、１,２５(ＯＨ)₂Ｄのアッセイは臨床的に価値があり、迅速で放射能を使用しない新規な方法が非常に望ましい。多数の活性ビタミンＤ化合物が知られており、種々の治療目的に有用である。例えば、米国特許第５,４５７,２１７、５,４１４,０９８、５,３８４,３１３、５,３７３,００４、５,３７１,２４９、５,４３０,１９６、５,２６０,２９０、５,３９３,７４９、５,３９５,８３０、５,２５０,５２３、５,２４７,１０４、５,３９７,７７５、５,１９４,４３１、５,２８１,７３１、５,２５４,５３８、５,２３２,８３６、５,１８５,１５０、５,３２１,０１８、５,０８６,１９１、５,０３６,０６１、５,０３０,７７２、５,２４６,９２５、４,９７３,５８４、５,３５４,７４４、４,９２７,８１５、４,８５７,５１８、４,８５１,４０１、４,８５１,４００、４,８４７,０１２、４,７５５,３２９、４,９４０,７００、４,６１９,９２０、４,５９４,１９２、４,５８８,７１６、４,５６４,４７４、４,５５２,６９８、４,５８８,５２８、４,７１９,２０４、４,７１９,２０５、４,６８９,１８０、４,５０５,９０６、４,７６９,１８１、４,５０２,９９１、４,４８１,１９８、４,４４８,７２６、４,４４８,７２１、４,４２８,９４６、４,４１１,８３３、４,３６７,１７７、４,３３６,１９３、４,３６０,４７２、４,３６０,４７１、４,３０７,２３１、４,３０７,０２５、４,３５８,４０６、４,３０５,８８０、４,２７９,８２６および４,２４８,７９１号参照。乳汁のビタミンＤ含量は、面倒なアッセイで測定する(Holick et al.、N.Eng. J.Med.132:1178-81(1992)、Tanner et al.、J.Assoc.of Analyt.Ｃhem.17:607-7 10(1988))。それ故、乳汁、血液、体液、食物および動物の飼料中のビタミンＤを迅速に非放射的にアッセイする必要がある。かかる非放射性アッセイを用いて、治療に有用なビタミンＤ化合物の存在を検知することができる。発明の要約本発明は、式［式中、Ｒ₁は、１つ以上のヒドロキシ、ハロ、低級アルコキシ、オキソ、オキシム、低級アルカノイルオキシ、アリールオキシ、アリール、ベンゾイル、Ｃ₄ラクトン、メチルおよびヒドロキシ基により置換されたＣ₄ラクトン、Ｃ₃−Ｃ₆シクロアルキル、またはヒドロキシ、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルにより置換されたＣ₃−Ｃ₆シクロアルキルにより置換されていてもよい１〜１５Ｃ原子を有する置換または非置換アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；Ｒ₂はメチル基であり、Ｒ₃は水素であるか、またはＲ₂は水素であり、Ｒ₃はメチル基である、またはＲ₂およびＲ₃は両方共水素であるか、またはＲ₂およびＲ₃は共にメチレン基（＝ＣＨ₂）であり、Ｒ₄は水素、ヒドロキシ、低級アルコキシまたは低級アルカノイルオキシであり、Ｗは酸素またはアミノであり；Ｘはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）またはメチレン（ＣＨ₂）であり；Ｙは酸素、硫黄、アミノ、−Ｃ(Ｏ)Ｏ−または−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−であり；Ｚはビオチン、蛍光基または化学発光基であり；およびｎ₁およびｎ₂は独立して１、２、３、４または５である］を有する化合物に関する。本発明はまた、サンプル中のビタミンＤ化合物の存在についてのアッセイ法に関し、改良点は標識ビタミンＤ化合物として本発明の標識化合物を使用することを含む。本発明はまた、ビタミンＤ、その代謝物または類似体を検知する固相アッセイ法に関し、これは（ａ）本発明の標識化合物に結合できるタンパク質または抗体を上に固定した固相支持体を提供し；（ｂ）該固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体に結合するに充分な時間、本発明の標識化合物の溶液と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）で得られた固相支持体を、非結合標識化合物を除去するに充分な時間で洗浄し；（ｄ）工程（ｃ）で得られた固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体と置換するに充分な時間、ビタミンＤ、その代謝物または類似体を含むことが疑われる液体サンプルと接触させ；（ｅ）工程（ｄ）で得られた液体を除去し；および（ｆ）工程（ｅ）で得られた液体中の標識化合物の存在を検知する；ことを含み、ここで、工程（ｆ）で検知された標識化合物の量は、該試験サンプル中のビタミンＤ、その代謝物または類似体の量に正比例する。図の簡単な説明図１は２５−ＯＨ−Ｄ₃ビオチンおよびフルオレセインコンジュゲートに関する競合的結合アッセイを示す。図２は本発明のアッセイの図解的説明を示す。図３は乳汁に関するビタミンＤアッセイフローチャートを示す。図４は二抗体法を用いたビタミンＤ₃および２５−ＯＨ−Ｄ₃に関するアッセイを示す。図５はアビジン−ビオチン化学技術を用いたビタミンＤ₃および２５−ＯＨ− Ｄ₃に関するアッセイを示す。図６は１,２５(ＯＨ₂)Ｄ₃のビオチンコンジュゲート製造に関するスキームである。好ましい態様の詳細な記載上記の式に関して：典型的なＣ_6-14アリール基は、フェニル、ナフチル、フェナントリル、アントラシル、インデニル、アズレニル、ビフェニル、ビフェニルエニルおよびフルオレニル基を含む。典型的なハロ基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。典型的なＣ_1-15アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル基並びに分枝鎖アルキル基を含む。好ましくは、Ｒ₁がアルキル基の場合、それはビタミンＤ₂ またはＤ₃のＣ−１７側鎖である。典型的なＣ_2-15アルケニル基は、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル基等並びに分枝鎖アルケニル基を含む。好ましくは、Ｒ₁がアルケニル基である場合、それはＣ２２−２３に二重結合をもつビタミンＤ₂またはＤ₃のＣ−１７側鎖である。典型的なＣ_2-4アルキニル基は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル基等並びに分枝鎖アルキニル基を含む。好ましくは、Ｒ₁がアルキニル基である場合、それはＣ２２−２３に三重結合をもつビタミンＤ₃のＣ−１７側鎖である。典型的な低級アルコキシ基は、上記したＣ_1-4アルキル基の１つにより置換された酸素を含む。典型的な低級アルカノイルオキシ基は、例えばアセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシ等の任意のＣ_1-6 アシルオキシ基を含む。典型的なアリールオキシ基は、上記のアリール基のいずれか１つにより置換された酸素を含む。好ましくは、Ｒ₁はビタミンＤ₂（炭素位置Ｃ₂₀−Ｃ₂₇)またはＤ₃（炭素位置Ｃ₂₀ −Ｃ₂₇）の側鎖であるか、またはかかる鎖はＣ₂₃、Ｃ₂₄および／またはＣ₂₅で１つ以上のヒドロキシ基により部分的に修飾されている。好ましくは、Ｚはビオチン、フルオレセインまたはその天然または合成誘導体のいずれか、またはビオチンまたはフルオレセインとして機能するとされる他の合成または天然誘導体である(例えば、４,４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−５−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミン)。Ｚは、例えばルミノール、イソルミノール、サーモマティックアクリジウムエステル(thermomatic acridium ester)、イミダゾール、アクリジニウム塩および１,２−ジオキセタンなどの化学発光分子であってもよい(米国特許第４ ,９３１,５６９、４,９５９,１８２、５,００４,５６５、４,８５７,６５２および４,９６２,１９２号参照)。標識は、別に、ビタミンＤ化合物の１位に結合していてもよい。この態様では、Ｒ₄は上記の式に示されるＣ₃置換基であり、３β位にヒドロキシ基がある。好ましい標識化合物は、２５−ヒドロキシ−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ ビオチンアミド、２５−ヒドロキシ−３β−[(５−ビオチンアミジル）ペンタンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシ−３β−[(６ −ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシ−３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミド、１,２５−ジヒドロキシ−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミド、１,２５−ジヒドロキシ−３β−[(５−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−３ −アミノプロポキシビタミンＤ₃、１,２５−ジヒドロキシ−３β−[(６−ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、１,２５− ジヒドロキシ−３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミド、３ −アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミド、３β−[(５−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、３β−[(６−ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、および３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミドを含む。本発明の標識化合物は、キットの製造に理想的である。かかるキットは区画化され、バイアル、チューブ、プレート等の１つ以上の容器が近接して制限されて入れられているキャリヤーからなり得、各々の容器には、別々のアッセイ成分が入っている。例えば、所望により溶液中または容器の壁に結合した、本発明の標識ビタミンＤ化合物を含む容器であってもよい。さらに容器は、例えば、アビジンでコートしたビーズ、プレートまたはチューブ；ビタミンＤ化合物、その代謝物および／または類似体に結合するタンパク質；ＤＢＰ；酵素標識抗体、ビタミンＤ結合タンパク質またはビタミンＤレセプターおよびその基質；および／またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの緩衝液を含有し得る。本発明の標識化合物は、患者に投与し得るビタミンＤ化合物、その代謝物およびビタミンＤ類似体についての慣用的なアッセイに使用し得る。かかるアッセイは競合的結合アッセイおよび酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。例えば、Ch en et al.、J.Nutr.Biochem.1:272-276(1990)；Chen et al.、J.Nutr.Biochem.1 :315-319(1990)；Chen et al.、J.Nutr.Biochem.1:320-327(1990)；Engvall,V.M eth.Enzymol.70:419-439(1980)；Millipore Catalogue 1994-1995、Marlborough ,MA；および米国特許第４,２９７,２８９、４,８１６,４１７、５,２３２,８３６および４,５８５,７４１号参照。本発明に包含される改良点は、先行技術の放射標識化合物を本発明の標識ビタミンＤ化合物と置換したことである。本発明はまた、試験サンプル中のビタミンＤ、その代謝物または類似体を検知するための固相アッセイ法に関し、これは（ａ）本発明の標識化合物に結合できるタンパク質または抗体を上に固定した固相支持体を提供し；（ｂ）該固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体に結合するに充分な時間、本発明の標識化合物の溶液と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）で得られた固相支持体を、非結合標識化合物を除去するに充分な時間で洗浄し；（ｄ）工程（ｃ）で得られた固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体と置換するに充分な時間、ビタミンＤ、その代謝物または類似体を含むことが疑われる液体サンプルと接触させ；（ｅ）工程（ｄ）で得られた液体を除去し；および（ｆ）工程（ｅ）で得られた液体中の標識化合物の存在を検知する；ことを含み、ここで、工程（ｆ）で検知された標識化合物の量は、該試験サンプル中のビタミンＤ、その代謝物または類似体の量に正比例する。アッセイを用いて試験し得る試験サンプルには、動物の飼料、ビタミンＤを含有する食物、乳汁、幼児用調合乳、血液、血清、尿、唾液、腹膜および胸膜液の抽出液並びにビタミンＤまたはその代謝物または類似体を含有する丸薬または医薬品が包含される。固相支持体の例には、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロンおよびマイクロタイタープレートが包含される。標識ビタミンＤ化合物に結合するタンパク質は、公知のこのようなタンパク質が包含される。典型的には、かかるタンパク質は、ビタミンＤ、その代謝物および／または類似体に結合するレセプタータンパク質である。好ましいタンパク質は、ビタミンＤ結合タンパク質(ＤＢＰ)、ビタミンＤレセプターまたはアビジンである。別に、ビタミンＤ、その代謝物または類似体に結合できる抗体を使用できる。固相支持体はＰＢＳ等の慣用的な任意の緩衝液で洗浄してよい。標識は、例えば視覚検知、蛍光比色法または分光測定法などの任意の公知の方法で検知できる。固相アッセイにおけるかかる標識の検知法は、米国特許第５, ０９８,８４６号に開示されている。本発明の標識化合物は、以下の実施例に従って製造できる。出発物質のビタミンＤ化合物およびビタミンＤ類似体は米国特許第５,４５７,２１７、５,４１４, ０９８、５,３８４,３１３、５,３７３,００４、５,３７１,２４９、５,４３０, １９６、５,２６０,２９０、５,３９３,７４９、５,３２１,０１８、５,０８６, １９１、５,０３６,０６１、５,０３０,７７２、５,２４６,９２５、４,９７３, ５８４、５,３５４,７４４、４,９２７,８１５、４,８５７,５１８、４,８５１, ４０１、４,８５１,４００、４,８４７,０１２、４,７５５,３２９、４,９４０, ７００、４,６１９,９２０、４,５９４,１９２、４,５８８,７１６、４,５６４, ４７４、４,５５２,６９８、４,５８８,５２８、４,７１９,２０４、４,７１９, ２０５、４,６８９,１８０、４,５０５,９０６、４,７６９,１８１、４,５０２, ９９１、４,４８１,１９８、４,４４８,７２６、４,４４８,７２１、４,４２８, ９４６、４,４１１,８３３、４,３６７,１７７、４,３３６,１９３、４,３６０, ４７２、４,３６０,４７１、４,３０７,２３１、４,３０７,０２５、４,３５８, ４０６、４,３０５,８８０、４,２７９,８２６および４,２４８,７９１号に従って得ることができる。以下の実施例は、本発明の方法および組成物を説明するものであり、制限するものではない。他の適当な修飾、および臨床治療で通常見られ当業者に明らかである種々の条件およびパラメーターの適用は、本発明の精神および範囲内である。実施例実施例１ビタミンＤ₃−３−アミノプロピルエーテルのビオチンコンジュゲート（Ａ）化合物Ａは、トリエチルアミン（Ｅｔ₃Ｎ）の存在下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、ビタミンＤ₃−３−アミノプロピルエーテルとビオチン−４−ニトロフェニルエステルとの反応により合成した。生成物を分取ＴＬＣにより精製した。Ａの収率は７０％であった。ＡのＮＭＲスペクトルはその構造を支持した。本発明の関連化合物は、対応するビタミンＤ₃−アミノプロピルエーテルの反応により製造し得る。実施例２２５−ヒドロキシビタミンＤ₃−３−アミノプロピルエーテルのビオチンコンジュゲート（Ｂ）化合物Ｂは、Ｅｔ₃Ｎの存在下、ＤＭＦ中、２５−ＯＨ−Ｄ₃−３−アミノプロピルエーテルとビオチン−４−ニトロフェニルエステル（Aldrich Chemical Co. ）との反応により合成した。生成物はシリカゲル上で分取ＴＬＣ（塩化メチレン中１０％メタノール）により４５％の収率で精製した。付加物Ｂは、２６５nmに λ_maxのＵＶスペクトルを有した。Ｂのスペクトルは、ＮＭＲにより確認した。実施例３２５−ＯＨ−Ｄ₃−３−アミノプロピルエーテルとビオチン−Ｘ−ＮＨＳのコンジュゲート（Ｃ）２５−ＯＨ−Ｄ₃−アミノプロピルエーテルおよびビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（Cal biochem Inc.、San Diego CA）のイソプロパノール溶液を１時間撹拌し、次いで、未反応のビオチン−Ｘ−ＮＨＳを拡散させるために少量のｎ−ブチルアミンを添加した。１時間撹拌した後、溶液をアルゴン気流下で乾燥させ、反応混合物を分取ＴＬＣ（ＣＨ₂Ｃ１₂中１０％メタノール）により精製した。主に２本のＵＶ活性バンドが存在した。極性バンドをさらにＨＰＬＣ（Ｃ₁₈カラム、ＭｅＯＨ中、水５％）により精製した。メタノール中の化合物ＣのＵＶスペクトルは、２６５nmにλ_max、２８nmにλ_minをもつビタミンＤ様のスペクトルであった。ＣのＮＭＲスペクトルはその構造と一致した。実施例４２５−ＯＨ−Ｄ₃−３−アミノプロピルエーテルおよびフルオレセイン誘導体のコンジュゲート（Ｆ）の製造フルオレセイン化合物Ｅ（６−(フルオレセイン−５−(および６−)−カルボキサミドヘキサン酸スクシニルエステル、Molecular Probes,Inc.,Eugene,Or)および過剰量の２５−ＯＨ−Ｄ₃−３−アミノプロピルエーテルのイソプロパノール溶液を１時間撹拌し、次いで、溶媒を除去した。かかる反応混合物のＴＬＣ（酢酸：アセトン：メタノール：ベンゼン−０．２５：０．２５：０．２５：０．５：４．０）から、強力な蛍光化合物が形成されていることが示された。同溶出液を用いて分取ＴＬＣにより単離した。実施例５２５−ＯＨ−Ｄ₃−３−アミノプロピル−３−(６−アミノ)ヘキサン酸のビオチンコンジュゲート（Ｄ）化合物Ｄは、このスキームに従って製造した。生成物はＵＶ（メタノール）で確認し、これは２６５nmにλ_maxを有し、これはビタミンＤ−トリエン系に典型的である。ＤのＮＭＲスペクトル：δ４.８および５.１（ＡＢ_qパターン、環外ＣＨ₂、２Ｈ）、δ５.９および６.２(ダブルダブレット、２Ｈ、ＣＨ₂オレフィン性プロトン）。実施例６類似体（Ｃ）および（Ｆ）とヒトビタミンＤ−結合タンパク質（ｈＤＢＰ）との競合的放射リガンド結合アッセイかかるアッセイは、かかる合成類似体がｈＤＢＰの基質として使用できるかを決定するために行った。ｈＤＢＰに結合する³Ｈ−２５−ＯＨ−Ｄ₃の置換において、化合物Ｃは２５−ＯＨ−Ｄ₃よりも約１１倍効力が低いことがモル単位で観察された。化合物Ｆは³Ｈ−２５−ＯＨ−Ｄ₃の置換において２５−ＯＨ−Ｄ₃と類似していた（図１）。図１に示された結果は、化合物ＣおよびＤがＤＢＰ結合に関して２５−ＯＨ−Ｄ₃と置換できることを実証する。実施例７試験溶液中のビタミンＤ₃および２５−ＯＨ−Ｄ₃の濃度を測定するための酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）の開発本法は、ＤＢＰをＥＬＩＳＡプレートに固着させ、次いで、既知量の２５−ＯＨ−Ｄ₃−ビオチンコンジュゲート（化合物Ｃ）を添加することを含む。この化合物は、ＤＢＰと２５−ＯＨ−Ｄ₃との間の強い結合親和性から、ＤＢＰ（プレートに固着している）に結合する。過剰量のＣを洗い去り、過剰量のアビジンを加え、これは２５−ＯＨ−Ｄ₃に結合したビオチンに結合する。次いで、プレートを、順次、抗−アビジン抗体、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体、および青色を発色する基質であるＡＢＴＳ（２,２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン）スルホネート）と共にインキュベートし、これを分光学的にまたは視覚的にモニターし得る。色の強度（吸光度）は、化合物Ｃの濃度に正比例する。第１の実験において、ＤＢＰおよび化合物Ｃの発色最適濃度を（視覚的に）測定した。かかる実験で、ＤＢＰの各サンプルを、各量の化合物Ｃに対して試験した。Ａ．比色シグナルを得るためのチェッカー盤力価測定（ＥＬＩＳＡ）における最適量のＤＢＰおよび化合物（Ｃ）の決定使用したＤＢＰ：２００、１００、５０、２５、１２.５、６.２５、３.１２５n ｇ使用したＣ：１、０.５、０.２５、０.１２５、０.０６６、０.０３３、０.０１６μg フローチャート種々の量の精製ｈＤＢＰ(Calbiochem、San Diego、CA、１００mＭＮａ₂ＣＯ₃緩衝液中、ｐＨ８.４）をＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加 ↓ ３７℃でインキュベートＢＳＡ（１mg/ml、３００μl）で過剰な部位をブロック ↓ ０.０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで洗浄種々の量のＣのＥｔＯＨ溶液を添加 ↓ ４℃でインキュベート０.０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ（Biorad、Richmond、CA）で洗浄 ↓ １００mＭＮａ₂ＣＯ₃、ｐＨ８.４中のアビジン１００ng（Sigma Chemical Co. 、St.Louis、Mo.）を添加 ↓ ４℃でインキュベートＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いで、一次抗−アビジン抗体（Sigma Chemical Co.、 St.Louis、Mo.）を添加 ↓ ４℃でインキュベート ↓ ＰＢＳおよびＴＷＥＥＮ２０で洗浄ＨＲＰに結合した二次抗体（ロバ由来の抗−ウサギＩgＧ、Amersham Corp.、Spr ingfield,III)を添加 ↓ ４℃でインキュベート ↓ ＰＢＳおよびＴＷＥＥＮ２０で洗浄基質（ＡＢＴＳ；２,２'−アジノ−ジ−(３−エチルベンゾチアゾリン）スルホネート）を添加 ↓ ２５℃でインキュベート発色を視覚的にまたは分光測定で検知した。結果：黄色の発色に必要な最少量のＤＢＰおよび化合物（Ｃ）は、それぞれ、６.２５ngおよび３０ngであった。次の実験で、ＤＢＰ（これはＥＬＩＳＡプレートに固着している）に結合した化合物Ｃを、既知濃度の２５−ＯＨ−Ｄ₃で置換可能かどうかを決定した。実際のサンプルでは、２５−ＯＨ−Ｄの量を測定するのであって、化合物Ｃの量を測定するのではない。Ｂ．化合物Ｃは２５−ＯＨ−Ｄ₃と競合できることを実証するアッセイ３つの濃度のＤＢＰ/Ｃを選択した。実験方法：前記と同じように、Ｃ、またはＣおよび２μgの２５−ＯＨ−Ｄ₃を除いたものを各プレートに加える。各濃度（ポイント）はトリプリケートに行った。ブランクは全く２５−ＯＨ−Ｄ₃またはＣを含まない。２５−ＯＨ−Ｄ₃を含有するサンプルは全て発色せず、このことは、２５−ＯＨ−Ｄ₃が、ＥＬＩＳＡプレート上でＤＢＰに結合した化合物Ｃと置換可能であることを実証している。さらに、化合物Ｃの量は添加した２５−ＯＨ−Ｄ₃の濃度に正比例している。従って、置換された化合物Ｃの量はアッセイ系において２５−ＯＨ−Ｄ₃の量として使用できる。高感度でビタミンＤまたは２５−ＯＨ−Ｄを測定する別法は、以下の通りである：フローチャート１．３７℃で２時間、マイクロタイタープレートのウェルを２００ngのＤＢＰでコートする２．３７℃で２時間、ＢＳＡ（mg/ml、ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ２０緩衝液中）で過剰な部位をブロックする３．２５−ＯＨ−Ｄ₃（３６pgから８.７６ng）またはビタミンＤ₃（０.３６ngから８５ng）の連続希釈液を作成する４．単独または種々の濃度の２５−ＯＨ−Ｄ₃またはビタミンＤ₃と共に化合物Ｃ (２５−ＯＨ−Ｄ₃−ビオチン)(８００pg)を添加する５．４℃で１２時間インキュベートする６．プレートを洗浄し、４℃で２時間アビジン（１００ng/ウェル）と共にインキュベートする７．プレートを洗浄し、４℃で２時間抗アビジン抗体（１：１０,０００希釈）と共にインキュベートする８．プレートを洗浄し、４℃で２時間ＨＲＰ−結合二次抗体（１：５，０００希釈）と共にインキュベートする９．プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ溶液と共にインキュベートする１０．０．０５mlの２０％ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止する１１．４１０nmにおける各ウェルのＯＤを読む。上記の方法を用いて、ビタミンＤ₃および２５−ＯＨ−Ｄ₃を、図４で示したようにピコモル・レベルで検知した。実施例８アビジン−ビオチン化学を用いたビタミンＤ₃、２５−ＯＨ−Ｄ₃および１，２５(ＯＨ)Ｄ₂のアッセイビオチン標識ビタミンＤ化合物を用いて、ビタミンＤ₃、２５−ＯＨ−Ｄ₃および１，２５(ＯＨ)₂Ｄ₃を測定する別法に関する段階的な方法を、下記に詳述する。フローチャート１．マイクロタイタープレートのウェルを、１００mＭ重炭酸ナトリウム緩衝液、pＨ８.４中のアビジン（１ウェルにつき２００ng）でコートする２．３７℃で２時間、ＢＳＡ（０.０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ中１m g/ml）で過剰な部位をブロックする。ウェルを洗浄する３．標準的な方法によりセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＤＢＰ＊）をＤＢＰと結合させる４．５０mＭトリスＨＣ1緩衝液、pＨ８.３、１５０mＭＮａＣｌ、１.５mＭＥＤＴＡ、０.１％ＴritonＸ１００中の種々の濃度のビタミンＤ₃（１.２５、２. ５、５.０）１０.０、２０.０、４０.０、８０.０、１６０.０、３２０.０および６４０ng）または２５−ＯＨ−Ｄ₃（２０.０、４０.０、８０.０、１６０.０、３２０.０、６４０.０および１２８０.０pg）または１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃（１．２５、２.５、５.０、１０.０、２０.０、４０.０、８０.０、１６０.０、３２０.０および６４０ng）の存在下および非存在下、１.５mlマイクロヒュージチューブ（全量０.１ml）中、４℃で一晩、化合物Ｃ（４００pg）と共にＤＢＰ＊（１００ng）をインキュベートする５．それぞれのウェルに、ＤＢＰ＊／ビタミンＤ₃またはＤＢＰ＊／２５−ＯＨ −Ｄ₃またはＤＢＰ＊/１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃インキュベート混合物を添加し、２５ ℃で６０分間静置する６．ウェルを洗浄する７．基質（ＡＢＴＳ）を各ウェルに添加し、発色するまで待つ（１０−２０分間）８．２０％ＳＤＳを０．０5ml加えて反応を停止する９．４１０nmにおけるＯＤを読む。ビタミンＤ₃、２５−ＯＨ−Ｄ₃および１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃の標準的なサンプルを用いた上記のアッセイの結果を図５に示す。実施例９１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃のビオチンコンジュゲート（１α,２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃−３β−(６−アミドビオチニル)ヘキサノエート、Ｇ）の製造１,２５(ＯＨ)₂Ｄのアッセイのために、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に結合する１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃のビオチンコンジュゲートもまた望ましい。１,２５( ＯＨ)₂Ｄ₃のビオチニル化誘導体は以下のように製造した。表題化合物（Ｇ）は、１α−ＯＨ基がtert.ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）で保護された１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃の誘導体（Ｅ）を出発原料として、多段階の方法（図６）で合成した(Ray et al.、J.Chem.Soc.、702-703(1985) 、Ray et al.、Biochem.Biophys.Res.Comm.132：198-203(1985)、Ray and Holic k、Steroids 51：623-630(1988)、Ray et al.、Steroids 58:462-465(1993)、Ra yet al.、Bioorganic Chem.22:276-283(1994)、Ray et al.、J.Biol.Chem.271:2 012-2017(1996))。化合物ＥをＦＭＯＣ−カプロン酸とＤＣＣカップリングさせ、次いで、１−ＯＨ−およびＦＭＯＣ−保護基を除去するとアミン（Ｆ）が生成する。化合物Ｆをビオチンのｐ−ニトロフェニルエステルとカップリングさせると、所望の１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃ビオチンコンジュゲート（化合物Ｇ）が生成する( ここで、ビオチンは長い鎖を介して１,２５(ＯＨ)₂Ｄ₃に結合している)。全ての合成化合物は、ＮＭＲおよびＵＶスペクトルにより確認した。前記から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、その精神および範囲からそれることなく、不必要な実験をすることなく、本発明の種々の変化及び修飾をなし、種々の使用用途および状況に適用することができる。本明細書に記載した全ての特許および刊行物はその全てを参照することにより取り込む。

Claims

【特許請求の範囲】１．式［式中、Ｒ₁は、１つ以上のハロ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、オキソ、オキシム、低級アルカノイルオキシ、アリールオキシ、アリール、ベンゾイル、Ｃ₄ラクトン、メチルおよびヒドロキシ基により置換されたＣ₄ラクトン、Ｃ₃−Ｃ₆シクロアルキル、またはヒドロキシ、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルにより置換されたＣ₃−Ｃ₆シクロアルキルにより置換されていてもよい１〜１５Ｃ原子を有する置換または非置換アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；Ｒ₂はメチル基であり、Ｒ₃は水素であるか、またはＲ₂は水素であり、Ｒ₃はメチル基である、またはＲ₂およびＲ₃は両方共水素であるか、またはＲ₂およびＲ₃は共にメチレン基（=ＣＨ₂）であり、Ｒ₄は水素、ヒドロキシ、低級アルコキシまたは低級アルカノイルオキシであり、Ｗは酸素またはアミノであり；Ｘはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）またはメチレン（ＣＨ₂）であり；Ｙは酸素、硫黄、アミノ、−Ｃ(Ｏ)Ｏ−または−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−であり；Ｚはビオチン、蛍光基または化学発光基であり；およびｎ₁およびｎ₂は独立して１、２、３、４または５である］を有する化合物。２．Ｚがビオチンである、請求項１に記載の化合物。３．２５−ヒドロキシ−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミドである、請求項１に記載の化合物。４．２５−ヒドロキシ−３β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−３ −アミノプロポキシビタミンＤ₃である、請求項１に記載の化合物。５．２５−ヒドロキシ−３β−[(６−ビオチンアミジル)ヘキサンアミド]−３ −アミノプロポキシビタミンＤ₃である、請求項１に記載の化合物。６．Ｚが蛍光基である、請求項１に記載の化合物。７．２５−ヒドロキシ−３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミドである、請求項１に記載の化合物。８．１,２５−ジヒドロキシ−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミドである、請求項１に記載の化合物。９．１,２５−ジヒドロキシ−３β−[(５−ビオチンアミジル)ペンタンアミド ]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃である、請求項１に記載の化合物。１０．１,２５−ジヒドロキシ−３β−[(６−ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃である、請求項１に記載の化合物。１１．１,２５−ジヒドロキシ−３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミドである、請求項１に記載の化合物。１２．３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミドである、請求項１に記載の化合物。１３．３β−[(５−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃である、請求項１に記載の化合物。１４．３β−[(６−ビオチンアミジル)ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃である、請求項１に記載の化合物。１５．３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミドである、請求項１に記載の化合物。１６．Ｒ₁がビタミンＤ₂またはビタミンＤ₃の側鎖である、請求項１に記載の化合物。１７．Ｒ₁が、Ｃ₂₃、Ｃ₂₄またはＣ₂₅位で少なくとも１つのヒドロキシ基により置換されたビタミンＤ₂またはビタミンＤ₃の側鎖である、請求項１に記載の化合物。１８．第一の容器が請求項１に記載の化合物を含有するものである、１つ以上の容器が近接して制限されて入れられているキャリヤーである、キット。１９．改良点が、標識ビタミンＤ化合物として請求項１に記載の標識化合物を使用することを含むものである、サンプル中のビタミンＤ化合物の存在をアッセイする方法。２０．Ｚがビオチンである、請求項１９に記載の方法。２１．標識化合物が、２５−ヒドロキシ−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ ビオチンアミド、２５−ヒドロキシ−３β−[(５−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシ−３β−[(６− ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシ−３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミド、１,２５−ジヒドロキシ−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミド、１ ,２５−ジヒドロキシ−３β−[(５−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−３− アミノプロポキシビタミンＤ₃、１,２５−ジヒドロキシ−３β−[(６−ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、１,２５−ジヒドロキシ−３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミド、３− アミノプロポキシビタミンＤ₃ビオチンアミド、３β−[(５−ビオチンアミジル) ペンタンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃、３β−[(６−ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−３−アミノプロポキシビタミンＤ₃または３β−アミノプロポキシビタミンＤ₃フルオレセインアミドである、請求項１９に記載の方法。２２．Ｒ₁がビタミンＤ₂またはビタミンＤ₃の側鎖である、請求項１９に記載の方法。２３．Ｒ₁が、Ｃ₂₃、Ｃ₂₄またはＣ₂₅位で少なくとも１つのヒドロキシ基により置換されたビタミンＤ₂またはビタミンＤ₃の側鎖である、請求項１９に記載の方法。２４．（ａ）請求項１に記載の標識化合物に結合できるタンパク質または抗体を上に固定した固相支持体を提供し；（ｂ）該固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体に結合するに充分な時間、請求項１に記載の標識化合物の溶液と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）で得られた固相支持体を、非結合標識化合物を除去するに充分な時間で洗浄し；（ｄ）工程（ｃ）で得られた固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体と置換するに充分な時間、ビタミンＤ、その代謝物または類似体を含むことが疑われる液体サンプルと接触させ；（ｅ）工程（ｄ）で得られた液体を除去し；および（ｆ）工程（ｅ）で得られた液体中の標識化合物の存在を検知する；ことを含み、ここで、工程（ｆ）で検知された標識化合物の量は、該試験サンプル中のビタミンＤ、その代謝物または類似体の量に正比例する、試験サンプル中のビタミンＤ、その代謝物または類似体を検知するための固相アッセイ法。