JP2000503641A - 標識ビタミンd化合物およびその使用 - Google Patents

標識ビタミンd化合物およびその使用

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JP2000503641A JP09524458A JP52445896A JP2000503641A JP 2000503641 A JP2000503641 A JP 2000503641A JP 09524458 A JP09524458 A JP 09524458A JP 52445896 A JP52445896 A JP 52445896A JP 2000503641 A JP2000503641 A JP 2000503641A
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Abstract

(57)【要約】 ビオチン、蛍光および化学発光標識ビタミンD化合物、並びに生物学的液体におけるビタミンD、その代謝物およびビタミンD類似体の存在についてのアッセイにおけるその使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 標識ビタミンD化合物およびその使用 発明の背景 発明の分野 本発明は、非放射性ビタミンD化合物、および、乳汁、血液または他の生物学 的液体中に存在し得るビタミンD、ビタミンD類似体およびその代謝物の存在に ついてのアッセイ法に関する。本発明で使用するアッセイ法は、酵素免疫測定法 (ELISA)(ビオチン含有化合物を用いる)および蛍光比色法および化学発光定 量法(フルオレセインまたは化学発光含有化合物を用いる)であり得る。 関連分野 皮膚で合成されたビタミンD3であるセコーステロイドは、連続的に代謝され 肝臓で25−ヒドロキシビタミンD3(25−OH−D3)に、腎臓で1,25(O H)23に変換されることが確立されている。ビタミンD3のジヒドロキシル化代 謝物である1,25(OH)23は、ビタミンDホルモンの中で最も活性がある型 であるが、これはカルシウムおよびリン酸のホメオスタシスに深く関与している (Holik,M.F.(1989)、「ビタミンD:生合成、代謝および作用形態」、Endocrino logy、vol.2、Degroot et al.(編)、Saunders,W.B.,Philadelphia,p.902-926)) 。ビタミンD3(これは皮膚で合成される)に加えて、ビタミンD2と呼ばれるビ タミンD3の別の化学型のものが天然に存在する。ビタミンD2は、ビタミンD3 と類似の方法で、25−ヒドロキシビタミンD。(25−(OH)2−D)および1 ,25(OH)22に代謝される。ビタミンD2は、主に、食餌およびビタミンD補 助食品から得られ、食餌中に存在するビタミンD2と太陽光への暴露により皮膚 で産生されるビタミンD3との相対量に応じて、ビタミンD2は25−OH−D濃 度の最低5〜10%、または最高100%であり得る(Holik,M.K.et al.(1986) 「カルシウム、リンおよび骨代謝:カルシウム調節ホルモン」、Harrison's Pri nciples of Internal Medicine、13版、Braunwald et al.(編)、McGraw-Hill、N ew York、p.2137-2151)。以下の論述において、特記しない限り、ビタミンD、 25−OH−Dおよび1,25(OH)2Dは、ビタミンDおよびその代謝物の全プ ール量を示すと仮定してよい。 25−OH−Dおよび1,25(OH)2Dの生合成およびその代謝は、ミネラル および骨代謝を制御する因子により調節されている(Holick,M.F.(1989))。それ ゆえ、血清中1,25(OH)2Dレベルは、種々の疾患における重要な病態生理学 的指標である。例えば、1,25(OH)2Dの産生は、例えば後天性または先天性 ビタミンD代謝障害〔腎性骨ジストロフィー、特定の代謝性骨疾患、サルコイド ーシス、慢性肉芽種(granulotomous)疾患に伴う高カルシウム血症、およびビ タミンD依存性くる病I型およびII型を含む〕などの数多くの疾患によって強く 影響を受ける(Holik,M.F.et al.(1986))。 一方、25−OH−Dの循環濃度は、ヒトにおけるビタミンDの状態の重要な 指標であると考えられている(Holik,M.F.et al.(1989);Holik,M.F.et al.(1986 ))。例えば、皮膚におけるビタミンDの内因性産生が不充分であること、および 食餌による補給が不充分であること、および/または小腸が食餌から充分量のビ タミンDを吸収できないことが原因で起こる低ビタミン血症は、低カルシウム血 症および低リン血症および対応する二次性副甲状腺機能冗進症を引き起こす(Hol ik,M.F.et al.(1986))。ビタミンD欠損は、臨床的に血中の25−OH−Dを測 定することで最も良好に決定される。25−OH−D濃度が正常範囲の下限以下 である場合、その患者はビタミンDが欠損していると考える。低ビタミンD血症 はまたミネラル代謝障害も引き起こす(すなわち、それぞれ小児および成人にお けるくる病および骨軟化症)。 血清中の25−OH−Dレベルもまた、腸吸収不良症候群、肝疾患(慢性およ び急性)、およびネフローゼ症候群において、正常よりも低いことが判明してい る。高齢者の骨不足では、血清中25−OH−Dレベルは、しばしば、正常より も低いことが判明している。ビタミンD中毒の場合、血清中の25−OH−Dレ ベルは、予期された通り、正常よりも高いことが判明している(Holik,M.F.et a1 .(1986))。 病態生理学的に重要であることから、25−OH−Dの循環濃度を正確に測定 するアッセイ法の開発に向けて多大なる努力がなされている。かかる25−OH −Dアッセイは、特に高齢者並びに肝疾患および腸疾患の患者におけるビタミン Dの状態を検査するために開発されている。 現在までに知られている最も有効な25−OH−Dのアッセイ法は、正常また はビタミンD欠損ラット血清(ラットDBP)の「コールド」および「ホット」 (放射性)25−OH−D3との間の競合的結合に関する理論の種々の方法を含 む。標準曲線は、測定量の25−OH−D3を用いて作成する。血液サンプルの 有機抽出物をアッセイに加え、25−OH−Dの濃度を標準曲線から決定する。 25−OH−Dの血清中濃度はビタミンDのジヒドロキシル化代謝物よりもはる かに高く(100〜1000倍のオーダーである)、従って、かかる代謝物はアッ セイに有意に影響しない。かかる状況は、DBPが、他のビタミンDのジヒドロ キシル化代謝物と比べて25−OH−Dにより高い結合親和力をもつことにより さらに補われる。さらに、DBPは25−OH−D2と25−OH−D3を識別し ないので、血清中の25−OH−Dの測定濃度は、25−OH−D2と25−O H−D3との合計濃度を表す(Chen et al.、J.Nutritional Biochem.1:315-319(1 990))。 DeLuca、米国特許第4,297,289号では、6位がジュウテリウムまたはト リチウム原子で同位体標識されたビタミンD化合物、およびビタミンD代謝解析 におけるその使用が開示されている。 DeLuca、米国特許第4,816,417号では、ビタミンD輸送タンパク質を含 有するサンプル中における1,25(OH)2X(ただし、xは2、3、4、5お よび/または6である)の存在に関する競合的結合アッセイが開示されている。 このアッセイでは、1,25(OH)2Dおよび標識1,25(OH)2Dに結合できる レセプタータンパク質を、レセプタータンパク質に結合できる抗体と共にサンプ ルに加える。次いで、レセプタータンパク質への標識1,25(OH)2Dの相対的 結合度を測定する。かかる1,25(OH)2Dは放射標識されている。 上記のアッセイは、特異的かつ効率的であるにもかかわらず、いくつかの欠点 がある。かかるアッセイは時間と費用がかかる。しかし、最も重要な問題は、本 質的に放射能を使用するということである。放射性同位体は非常に高価で、取り 扱いや保管が危険である。放射性廃棄物処理もまた極めて費用がかかるようにな ってきている。 ほとんど放射能を使用しないHPLC−UV検定法も、25−OH−Dをアッ セイするために開発されている(Jones,G.、Clin.Chem.24:287-298(1978))。かか る方法は、多段階のクロマトグラフィー分離、そして最後に25−OH−D2お よび25−OH−D3に対応するピークの検知および測定を伴う。かかる方法は 最も正確な血清中25−OH−D濃度測定法の1つであるが、2つの大きな欠点 がある。例えば、25−OH−Dの測定は、UV測定器の測定限界により制限さ れる。従って、2mlの血液がアッセイに必要である。幼児の25−OH−Dレベ ルの測定に際して、かかる量が必要とされることは特に困難な問題である。加え て、かかるアッセイ方法は非常に労力を要し、従って、非常に費用がかかる。 また、同位体希釈質量分析を含む非放射性方法も開発されている。この方法で は、血清サンプルを、安定なH原子で(すなわち、ジュウテリウムでC−26( 27)位(Bjorkhem and Holmberg、Clin.Chim.Acta 68:215-224(1976))またはC 6およびC−19位(Ray,R.et al.、Steroids 57:142-146(1992))について)標識 した25−OH−D3の合成類似体に加える。「添加された」血清サンプルを、 通常の方法で処理し、すなわち25−OH−D画分を抽出し部分的に精製(種々 のクロマトグラフィー段階による)し、質量分析にかける。血清中の代謝物の濃 度は、標識フラグメントと比較した特定の「分子フラグメント」(親代謝物から 産生されたもの)の相対量により測定する。この方法は非常に正確であるが、非 常に精密で高価な機器を必要とすることからあまり実用化されていない。かかる 方法はまた、非常に時間と費用がかかる。さらに、かかる方法は25−OH−D3 または25−OH−D2のいずれかに特異性があるので、25−OH−Dの循環 総濃度よりも低く算定される。 要約として、現在までに知られている25−OH−Dおよび1,25(OH)2D アッセイには、長い所要時間、アッセイ間における誤差、多額の費用、および、 特に、本質的に放射能を使用すること(ほとんどのアッセイにおいて)を含む種 々の欠点があり、通常の臨床的なアッセイには最適ではない。さらに、かかるア ッ セイ(すなわち、HPLCアッセイ)には、かなり大量の血清を必要とするもの がある。これは、特に新生児、幼児および子供の場合には深刻な問題である。従 って、手間も時間もあまり費用もかからない、血中25−OH−Dおよび1,2 5(OH)2Dをアッセイするための非放射性で非常に高感度の方法が急いで必要 とされる。本発明は、迅速で、比較的安価で容易に行える、血中25−OH−D および1,25(OH)2Dをアッセイするための新規な非放射性方法を提供するこ とでかかる問題を克服する。 1,25(OH)2Dの測定は、先天性および後天性25−OH−D代謝障害の病 因を決定するのに非常に価値がある(Holick(1989))。従って、1,25(OH)2D のアッセイは臨床的に価値があり、迅速で放射能を使用しない新規な方法が非常 に望ましい。 多数の活性ビタミンD化合物が知られており、種々の治療目的に有用である。 例えば、米国特許第5,457,217、5,414,098、5,384,313、 5,373,004、5,371,249、5,430,196、5,260,290、 5,393,749、5,395,830、5,250,523、5,247,104、 5,397,775、5,194,431、5,281,731、5,254,538、 5,232,836、5,185,150、5,321,018、5,086,191、 5,036,061、5,030,772、5,246,925、4,973,584、 5,354,744、4,927,815、4,857,518、4,851,401、 4,851,400、4,847,012、4,755,329、4,940,700、 4,619,920、4,594,192、4,588,716、4,564,474、 4,552,698、4,588,528、4,719,204、4,719,205、 4,689,180、4,505,906、4,769,181、4,502,991、 4,481,198、4,448,726、4,448,721、4,428,946、 4,411,833、4,367,177、4,336,193、4,360,472、 4,360,471、4,307,231、4,307,025、4,358,406、 4,305,880、4,279,826および4,248,791号参照。 乳汁のビタミンD含量は、面倒なアッセイで測定する(Holick et al.、N.Eng. J.Med.132:1178-81(1992)、Tanner et al.、J.Assoc.of Analyt.Chem.17:607-7 10(1988))。それ故、乳汁、血液、体液、食物および動物の飼料中のビタミンD を迅速に非放射的にアッセイする必要がある。かかる非放射性アッセイを用いて 、治療に有用なビタミンD化合物の存在を検知することができる。 発明の要約 本発明は、式 [式中、 R1は、1つ以上のヒドロキシ、ハロ、低級アルコキシ、オキソ、オキシム、低 級アルカノイルオキシ、アリールオキシ、アリール、ベンゾイル、C4ラクトン 、メチルおよびヒドロキシ基により置換されたC4ラクトン、C3−C6シクロア ルキル、またはヒドロキシ、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルにより 置換されたC3−C6シクロアルキルにより置換されていてもよい1〜15C原子 を有する置換または非置換アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; R2はメチル基であり、R3は水素であるか、または R2は水素であり、R3はメチル基である、または R2およびR3は両方共水素であるか、または R2およびR3は共にメチレン基(=CH2)であり、 R4は水素、ヒドロキシ、低級アルコキシまたは低級アルカノイルオキシであり 、 Wは酸素またはアミノであり; Xはカルボニル(C=O)またはメチレン(CH2)であり; Yは酸素、硫黄、アミノ、−C(O)O−または−C(O)−NH−であり; Zはビオチン、蛍光基または化学発光基であり;および n1およびn2は独立して1、2、3、4または5である] を有する化合物に関する。 本発明はまた、サンプル中のビタミンD化合物の存在についてのアッセイ法に 関し、改良点は標識ビタミンD化合物として本発明の標識化合物を使用すること を含む。 本発明はまた、ビタミンD、その代謝物または類似体を検知する固相アッセイ 法に関し、これは (a)本発明の標識化合物に結合できるタンパク質または抗体を上に固定した固 相支持体を提供し; (b)該固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体に結合するに充分 な時間、本発明の標識化合物の溶液と接触させ; (c)工程(b)で得られた固相支持体を、非結合標識化合物を除去するに充分 な時間で洗浄し; (d)工程(c)で得られた固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗 体と置換するに充分な時間、ビタミンD、その代謝物または類似体を含むことが 疑われる液体サンプルと接触させ; (e)工程(d)で得られた液体を除去し;および (f)工程(e)で得られた液体中の標識化合物の存在を検知する; ことを含み、ここで、工程(f)で検知された標識化合物の量は、該試験サンプ ル中のビタミンD、その代謝物または類似体の量に正比例する。 図の簡単な説明 図1は25−OH−D3ビオチンおよびフルオレセインコンジュゲートに関す る競合的結合アッセイを示す。 図2は本発明のアッセイの図解的説明を示す。 図3は乳汁に関するビタミンDアッセイフローチャートを示す。 図4は二抗体法を用いたビタミンD3および25−OH−D3に関するアッセイ を示す。 図5はアビジン−ビオチン化学技術を用いたビタミンD3および25−OH− D3に関するアッセイを示す。 図6は1,25(OH2)D3のビオチンコンジュゲート製造に関するスキームで ある。 好ましい態様の詳細な記載 上記の式に関して: 典型的なC6-14アリール基は、フェニル、ナフチル、フェナントリル、アント ラシル、インデニル、アズレニル、ビフェニル、ビフェニルエニルおよびフルオ レニル基を含む。 典型的なハロ基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。 典型的なC1-15アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ チル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル基並びに分枝 鎖アルキル基を含む。好ましくは、R1がアルキル基の場合、それはビタミンD2 またはD3のC−17側鎖である。 典型的なC2-15アルケニル基は、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニ ル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル基等並びに分枝 鎖アルケニル基を含む。好ましくは、R1がアルケニル基である場合、それはC 22−23に二重結合をもつビタミンD2またはD3のC−17側鎖である。 典型的なC2-4アルキニル基は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニ ル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル基等並びに分枝 鎖アルキニル基を含む。好ましくは、R1がアルキニル基である場合、それはC 22−23に三重結合をもつビタミンD3のC−17側鎖である。 典型的な低級アルコキシ基は、上記したC1-4アルキル基の1つにより置換さ れた酸素を含む。 典型的な低級アルカノイルオキシ基は、例えばアセトキシ、プロパノイルオキ シ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシ等の任意のC1-6 アシルオキシ基を含む。 典型的なアリールオキシ基は、上記のアリール基のいずれか1つにより置換さ れた酸素を含む。 好ましくは、R1はビタミンD2(炭素位置C20−C27)またはD3(炭素位置C20 −C27)の側鎖であるか、またはかかる鎖はC23、C24および/またはC25で 1つ以上のヒドロキシ基により部分的に修飾されている。 好ましくは、Zはビオチン、フルオレセインまたはその天然または合成誘導体 のいずれか、またはビオチンまたはフルオレセインとして機能するとされる他の 合成または天然誘導体である(例えば、4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4 a−ジアザ−5−インダセン(BODIPY)、ローダミン、フィコエリトリン 、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレ サミン)。Zは、例えばルミノール、イソルミノール、サーモマティックアクリ ジウムエステル(thermomatic acridium ester)、イミダゾール、アクリジニウム 塩および1,2−ジオキセタンなどの化学発光分子であってもよい(米国特許第4 ,931,569、4,959,182、5,004,565、4,857,652およ び4,962,192号参照)。 標識は、別に、ビタミンD化合物の1位に結合していてもよい。この態様では 、R4は上記の式に示されるC3置換基であり、3β位にヒドロキシ基がある。 好ましい標識化合物は、25−ヒドロキシ−3−アミノプロポキシビタミンD3 ビオチンアミド、25−ヒドロキシ−3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタ ンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、25−ヒドロキシ−3β−[(6 −ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、 25−ヒドロキシ−3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミド 、1,25−ジヒドロキシ−3−アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミド、 1,25−ジヒドロキシ−3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−3 −アミノプロポキシビタミンD3、1,25−ジヒドロキシ−3β−[(6−ビオチ ンアミジル)−ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、1,25− ジヒドロキシ−3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミド、3 −アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミド、3β−[(5−ビオチンアミジ ル)ペンタンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、3β−[(6−ビオチ ンアミ ジル)−ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、および3β−ア ミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミドを含む。 本発明の標識化合物は、キットの製造に理想的である。かかるキットは区画化 され、バイアル、チューブ、プレート等の1つ以上の容器が近接して制限されて 入れられているキャリヤーからなり得、各々の容器には、別々のアッセイ成分が 入っている。例えば、所望により溶液中または容器の壁に結合した、本発明の標 識ビタミンD化合物を含む容器であってもよい。さらに容器は、例えば、アビジ ンでコートしたビーズ、プレートまたはチューブ;ビタミンD化合物、その代謝 物および/または類似体に結合するタンパク質;DBP;酵素標識抗体、ビタミ ンD結合タンパク質またはビタミンDレセプターおよびその基質;および/また はリン酸緩衝溶液(PBS)またはウシ血清アルブミン(BSA)などの緩衝液 を含有し得る。 本発明の標識化合物は、患者に投与し得るビタミンD化合物、その代謝物およ びビタミンD類似体についての慣用的なアッセイに使用し得る。かかるアッセイ は競合的結合アッセイおよび酵素免疫測定法(ELISA)である。例えば、Ch en et al.、J.Nutr.Biochem.1:272-276(1990);Chen et al.、J.Nutr.Biochem.1 :315-319(1990);Chen et al.、J.Nutr.Biochem.1:320-327(1990);Engvall,V.M eth.Enzymol.70:419-439(1980);Millipore Catalogue 1994-1995、Marlborough ,MA;および米国特許第4,297,289、4,816,417、5,232,83 6および4,585,741号参照。本発明に包含される改良点は、先行技術の放 射標識化合物を本発明の標識ビタミンD化合物と置換したことである。 本発明はまた、試験サンプル中のビタミンD、その代謝物または類似体を検知 するための固相アッセイ法に関し、これは (a)本発明の標識化合物に結合できるタンパク質または抗体を上に固定した固 相支持体を提供し; (b)該固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体に結合するに充分 な時間、本発明の標識化合物の溶液と接触させ; (c)工程(b)で得られた固相支持体を、非結合標識化合物を除去するに充分 な時間で洗浄し; (d)工程(c)で得られた固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗 体と置換するに充分な時間、ビタミンD、その代謝物または類似体を含むことが 疑われる液体サンプルと接触させ; (e)工程(d)で得られた液体を除去し;および (f)工程(e)で得られた液体中の標識化合物の存在を検知する; ことを含み、ここで、工程(f)で検知された標識化合物の量は、該試験サンプ ル中のビタミンD、その代謝物または類似体の量に正比例する。 アッセイを用いて試験し得る試験サンプルには、動物の飼料、ビタミンDを含 有する食物、乳汁、幼児用調合乳、血液、血清、尿、唾液、腹膜および胸膜液の 抽出液並びにビタミンDまたはその代謝物または類似体を含有する丸薬または医 薬品が包含される。 固相支持体の例には、ガラス、プラスチック、ニトロセルロース、ジアゾセル ロース、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリエチレン、 デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロンおよびマイクロタイタ ープレートが包含される。 標識ビタミンD化合物に結合するタンパク質は、公知のこのようなタンパク質 が包含される。典型的には、かかるタンパク質は、ビタミンD、その代謝物およ び/または類似体に結合するレセプタータンパク質である。好ましいタンパク質 は、ビタミンD結合タンパク質(DBP)、ビタミンDレセプターまたはアビジン である。 別に、ビタミンD、その代謝物または類似体に結合できる抗体を使用できる。 固相支持体はPBS等の慣用的な任意の緩衝液で洗浄してよい。 標識は、例えば視覚検知、蛍光比色法または分光測定法などの任意の公知の方 法で検知できる。固相アッセイにおけるかかる標識の検知法は、米国特許第5, 098,846号に開示されている。 本発明の標識化合物は、以下の実施例に従って製造できる。出発物質のビタミ ンD化合物およびビタミンD類似体は米国特許第5,457,217、5,414, 098、5,384,313、5,373,004、5,371,249、5,430, 196、5,260,290、5,393,749、5,321,018、5,086, 191、5,036,061、5,030,772、5,246,925、4,973, 584、5,354,744、4,927,815、4,857,518、4,851, 401、4,851,400、4,847,012、4,755,329、4,940, 700、4,619,920、4,594,192、4,588,716、4,564, 474、4,552,698、4,588,528、4,719,204、4,719, 205、4,689,180、4,505,906、4,769,181、4,502, 991、4,481,198、4,448,726、4,448,721、4,428, 946、4,411,833、4,367,177、4,336,193、4,360, 472、4,360,471、4,307,231、4,307,025、4,358, 406、4,305,880、4,279,826および4,248,791号に従っ て得ることができる。 以下の実施例は、本発明の方法および組成物を説明するものであり、制限する ものではない。他の適当な修飾、および臨床治療で通常見られ当業者に明らかで ある種々の条件およびパラメーターの適用は、本発明の精神および範囲内である 。 実施例 実施例1 ビタミンD3−3−アミノプロピルエーテルのビオチンコンジュゲー ト(A) 化合物Aは、トリエチルアミン(Et3N)の存在下、ジメチルホルムアミド (DMF)中、ビタミンD3−3−アミノプロピルエーテルとビオチン−4−ニ トロフェニルエステルとの反応により合成した。生成物を分取TLCにより精製 した。Aの収率は70%であった。AのNMRスペクトルはその構造を支持した 。本発明の関連化合物は、対応するビタミンD3−アミノプロピルエーテルの反 応により製造し得る。 実施例2 25−ヒドロキシビタミンD3−3−アミノプロピルエーテルのビオ チンコンジュゲート(B) 化合物Bは、Et3Nの存在下、DMF中、25−OH−D3−3−アミノプロ ピルエーテルとビオチン−4−ニトロフェニルエステル(Aldrich Chemical Co. )との反応により合成した。生成物はシリカゲル上で分取TLC(塩化メチレン 中10%メタノール)により45%の収率で精製した。付加物Bは、265nmに λmaxのUVスペクトルを有した。Bのスペクトルは、NMRにより確認した。 実施例3 25−OH−D3−3−アミノプロピルエーテルとビオチン−X−N HSのコンジュゲート(C) 25−OH−D3−アミノプロピルエーテルおよびビオチン−X−NHS(Cal biochem Inc.、San Diego CA)のイソプロパノール溶液を1時間撹拌し、次いで 、未反応のビオチン−X−NHSを拡散させるために少量のn−ブチルアミンを 添加した。1時間撹拌した後、溶液をアルゴン気流下で乾燥させ、反応混合物を 分取TLC(CH2C12中10%メタノール)により精製した。主に2本のUV 活性バンドが存在した。極性バンドをさらにHPLC(C18カラム、MeOH中 、水5%)により精製した。メタノール中の化合物CのUVスペクトルは、26 5nmにλmax、28nmにλminをもつビタミンD様のスペクトルであった。CのN MRスペクトルはその構造と一致した。 実施例4 25−OH−D3−3−アミノプロピルエーテルおよびフルオレセイ ン誘導体のコンジュゲート(F)の製造 フルオレセイン化合物E(6−(フルオレセイン−5−(および6−)−カルボ キサミドヘキサン酸スクシニルエステル、Molecular Probes,Inc.,Eugene,Or)お よび過剰量の25−OH−D3−3−アミノプロピルエーテルのイソプロパノー ル溶液を1時間撹拌し、次いで、溶媒を除去した。かかる反応混合物のTLC( 酢酸:アセトン:メタノール:ベンゼン−0.25:0.25:0.25:0. 5:4.0)から、強力な蛍光化合物が形成されていることが示された。同溶出 液を用いて分取TLCにより単離した。 実施例5 25−OH−D3−3−アミノプロピル−3−(6−アミノ)ヘキサン 酸のビオチンコンジュゲート(D) 化合物Dは、このスキームに従って製造した。生成物はUV(メタノール)で 確認し、これは265nmにλmaxを有し、これはビタミンD−トリエン系に典型 的である。DのNMRスペクトル:δ4.8および5.1(ABqパターン、環外 CH2、2H)、δ5.9および6.2(ダブルダブレット、2H、CH2オレフィ ン性プロトン)。 実施例6 類似体(C)および(F)とヒトビタミンD−結合タンパク質(hD BP)との競合的放射リガンド結合アッセイ かかるアッセイは、かかる合成類似体がhDBPの基質として使用できるかを 決定するために行った。hDBPに結合する3H−25−OH−D3の置換におい て、化合物Cは25−OH−D3よりも約11倍効力が低いことがモル単位で観 察された。化合物Fは3H−25−OH−D3の置換において25−OH−D3と 類似していた(図1)。図1に示された結果は、化合物CおよびDがDBP結合 に関して25−OH−D3と置換できることを実証する。 実施例7 試験溶液中のビタミンD3および25−OH−D3の濃度を測定するた めの酵素免疫検定法(ELISA)の開発 本法は、DBPをELISAプレートに固着させ、次いで、既知量の25−O H−D3−ビオチンコンジュゲート(化合物C)を添加することを含む。この化 合物は、DBPと25−OH−D3との間の強い結合親和性から、DBP(プレ ートに固着している)に結合する。過剰量のCを洗い去り、過剰量のアビジンを 加え、これは25−OH−D3に結合したビオチンに結合する。次いで、プレー トを、順次、抗−アビジン抗体、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に 結合した二次抗体、および青色を発色する基質であるABTS(2,2’−アジ ノ−ジ−(3−エチルベンゾチアゾリン)スルホネート)と共にインキュベート し、これを分光学的にまたは視覚的にモニターし得る。色の強度(吸光度)は、 化合物Cの濃度に正比例する。第1の実験において、DBPおよび化合物Cの発 色最適濃度を(視覚的に)測定した。かかる実験で、DBPの各サンプルを、各 量の化合物Cに対して試験した。 A.比色シグナルを得るためのチェッカー盤力価測定(ELISA)における最 適量のDBPおよび化合物(C)の決定 使用したDBP:200、100、50、25、12.5、6.25、3.125n g 使用したC:1、0.5、0.25、0.125、0.066、0.033、0.01 6μg フローチャート 種々の量の精製hDBP(Calbiochem、San Diego、CA、100mM Na2CO3緩 衝液中、pH8.4)をELISAプレートのウェルに添加 ↓ 37℃でインキュベート BSA(1mg/ml、300μl)で過剰な部位をブロック ↓ 0.05%TWEEN20を含有するPBSで洗浄 種々の量のCのEtOH溶液を添加 ↓ 4℃でインキュベート 0.05%TWEEN20を含有するPBS(Biorad、Richmond、CA)で洗浄 ↓ 100mM Na2CO3、pH8.4中のアビジン100ng(Sigma Chemical Co. 、St.Louis、Mo.)を添加 ↓ 4℃でインキュベート PBS緩衝液で洗浄し、次いで、一次抗−アビジン抗体(Sigma Chemical Co.、 St.Louis、Mo.)を添加 ↓ 4℃でインキュベート ↓ PBSおよびTWEEN20で洗浄 HRPに結合した二次抗体(ロバ由来の抗−ウサギIgG、Amersham Corp.、Spr ingfield,III)を添加 ↓ 4℃でインキュベート ↓ PBSおよびTWEEN20で洗浄 基質(ABTS;2,2'−アジノ−ジ−(3−エチルベンゾチアゾリン)スルホ ネート)を添加 ↓ 25℃でインキュベート 発色を視覚的にまたは分光測定で検知した。 結果:黄色の発色に必要な最少量のDBPおよび化合物(C)は、それぞれ、 6.25ngおよび30ngであった。 次の実験で、DBP(これはELISAプレートに固着している)に結合した 化合物Cを、既知濃度の25−OH−D3で置換可能かどうかを決定した。実際 のサンプルでは、25−OH−Dの量を測定するのであって、化合物Cの量を測 定するのではない。 B.化合物Cは25−OH−D3と競合できることを実証するアッセイ 3つの濃度のDBP/Cを選択した。 実験方法:前記と同じように、C、またはCおよび2μgの25−OH−D3を 除いたものを各プレートに加える。各濃度(ポイント)はトリプリケートに行っ た。ブランクは全く25−OH−D3またはCを含まない。 25−OH−D3を含有するサンプルは全て発色せず、このことは、25−O H−D3が、ELISAプレート上でDBPに結合した化合物Cと置換可能であ ることを実証している。さらに、化合物Cの量は添加した25−OH−D3の濃 度に正比例している。従って、置換された化合物Cの量はアッセイ系において2 5−OH−D3の量として使用できる。 高感度でビタミンDまたは25−OH−Dを測定する別法は、以下の通りであ る: フローチャート 1.37℃で2時間、マイクロタイタープレートのウェルを200ngのDBPで コートする 2.37℃で2時間、BSA(mg/ml、PBS−TWEEN20緩衝液中)で過 剰な部位をブロックする 3.25−OH−D3(36pgから8.76ng)またはビタミンD3(0.36ngか ら85ng)の連続希釈液を作成する 4.単独または種々の濃度の25−OH−D3またはビタミンD3と共に化合物C (25−OH−D3−ビオチン)(800pg)を添加する 5.4℃で12時間インキュベートする 6.プレートを洗浄し、4℃で2時間アビジン(100ng/ウェル)と共にイン キュベートする 7.プレートを洗浄し、4℃で2時間抗アビジン抗体(1:10,000希釈) と共にインキュベートする 8.プレートを洗浄し、4℃で2時間HRP−結合二次抗体(1:5,000希 釈)と共にインキュベートする 9.プレートを洗浄し、ABTS溶液と共にインキュベートする 10.0.05mlの20%SDS溶液を加えて反応を停止する 11.410nmにおける各ウェルのODを読む。 上記の方法を用いて、ビタミンD3および25−OH−D3を、図4で示したよ うにピコモル・レベルで検知した。 実施例8 アビジン−ビオチン化学を用いたビタミンD3、25−OH−D3およ び1,25(OH)D2のアッセイ ビオチン標識ビタミンD化合物を用いて、ビタミンD3、25−OH−D3およ び1,25(OH)23を測定する別法に関する段階的な方法を、下記に詳述する 。 フローチャート 1.マイクロタイタープレートのウェルを、100mM重炭酸ナトリウム緩衝液 、pH8.4中のアビジン(1ウェルにつき200ng)でコートする 2.37℃で2時間、BSA(0.05%TWEEN20を含有するPBS中1m g/ml)で過剰な部位をブロックする。ウェルを洗浄する 3.標準的な方法によりセイヨウワサビペルオキシダーゼ(DBP*)をDBP と結合させる 4.50mMトリスHC1緩衝液、pH8.3、150mM NaCl、1.5mM E DTA、0.1%TritonX100中の種々の濃度のビタミンD3(1.25、2. 5、5.0)10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0およ び640ng)または25−OH−D3(20.0、40.0、80.0、160.0 、320.0、640.0および1280.0pg)または1,25(OH)23(1. 25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、32 0.0および640ng)の存在下および非存在下、1.5mlマイクロヒュージチュ ーブ(全量0.1ml)中、4℃で一晩、化合物C(400pg)と共にDBP*( 100ng) をインキュベートする 5.それぞれのウェルに、DBP*/ビタミンD3またはDBP*/25−OH −D3またはDBP*/1,25(OH)23インキュベート混合物を添加し、25 ℃で60分間静置する 6.ウェルを洗浄する 7.基質(ABTS)を各ウェルに添加し、発色するまで待つ(10−20分間 ) 8.20%SDSを0.05ml加えて反応を停止する 9.410nmにおけるODを読む。 ビタミンD3、25−OH−D3および1,25(OH)23の標準的なサンプル を用いた上記のアッセイの結果を図5に示す。 実施例9 1,25(OH)23のビオチンコンジュゲート(1α,25−ジヒドロ キシビタミンD3−3β−(6−アミドビオチニル)ヘキサノエート、G)の製造 1,25(OH)2Dのアッセイのために、ビタミンDレセプター(VDR)に結 合する1,25(OH)23のビオチンコンジュゲートもまた望ましい。1,25( OH)23のビオチニル化誘導体は以下のように製造した。 表題化合物(G)は、1α−OH基がtert.ブチルジメチルシリルエーテル( TBDMS)で保護された1,25(OH)23の誘導体(E)を出発原料として 、多段階の方法(図6)で合成した(Ray et al.、J.Chem.Soc.、702-703(1985) 、Ray et al.、Biochem.Biophys.Res.Comm.132:198-203(1985)、Ray and Holic k、Steroids 51:623-630(1988)、Ray et al.、Steroids 58:462-465(1993)、Ra yet al.、Bioorganic Chem.22:276-283(1994)、Ray et al.、J.Biol.Chem.271:2 012-2017(1996))。化合物EをFMOC−カプロン酸とDCCカップリングさせ 、次いで、1−OH−およびFMOC−保護基を除去するとアミン(F)が生成 する。化合物Fをビオチンのp−ニトロフェニルエステルとカップリングさせる と、所望の1,25(OH)23ビオチンコンジュゲート(化合物G)が生成する( ここで、ビオチンは長い鎖を介して1,25(OH)23に結合している)。全ての 合成化合物は、NMRおよびUVスペクトルにより確認した。 前記から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、その精神および 範囲からそれることなく、不必要な実験をすることなく、本発明の種々の変化及 び修飾をなし、種々の使用用途および状況に適用することができる。本明細書に 記載した全ての特許および刊行物はその全てを参照することにより取り込む。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.式 [式中、 R1は、1つ以上のハロ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、オキソ、オキシム、低 級アルカノイルオキシ、アリールオキシ、アリール、ベンゾイル、C4ラクトン 、メチルおよびヒドロキシ基により置換されたC4ラクトン、C3−C6シクロア ルキル、またはヒドロキシ、低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキルにより 置換されたC3−C6シクロアルキルにより置換されていてもよい1〜15C原子 を有する置換または非置換アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり; R2はメチル基であり、R3は水素であるか、または R2は水素であり、R3はメチル基である、または R2およびR3は両方共水素であるか、または R2およびR3は共にメチレン基(=CH2)であり、 R4は水素、ヒドロキシ、低級アルコキシまたは低級アルカノイルオキシであり 、 Wは酸素またはアミノであり; Xはカルボニル(C=O)またはメチレン(CH2)であり; Yは酸素、硫黄、アミノ、−C(O)O−または−C(O)−NH−であり; Zはビオチン、蛍光基または化学発光基であり;および n1およびn2は独立して1、2、3、4または5である] を有する化合物。 2.Zがビオチンである、請求項1に記載の化合物。 3.25−ヒドロキシ−3−アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミドで ある、請求項1に記載の化合物。 4.25−ヒドロキシ−3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−3 −アミノプロポキシビタミンD3である、請求項1に記載の化合物。 5.25−ヒドロキシ−3β−[(6−ビオチンアミジル)ヘキサンアミド]−3 −アミノプロポキシビタミンD3である、請求項1に記載の化合物。 6.Zが蛍光基である、請求項1に記載の化合物。 7.25−ヒドロキシ−3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレセイン アミドである、請求項1に記載の化合物。 8.1,25−ジヒドロキシ−3−アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミ ドである、請求項1に記載の化合物。 9.1,25−ジヒドロキシ−3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタンアミド ]−3−アミノプロポキシビタミンD3である、請求項1に記載の化合物。 10.1,25−ジヒドロキシ−3β−[(6−ビオチンアミジル)−ヘキサンア ミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3である、請求項1に記載の化合物。 11.1,25−ジヒドロキシ−3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレ セインアミドである、請求項1に記載の化合物。 12.3−アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミドである、請求項1に 記載の化合物。 13.3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−3−アミノプロポキ シビタミンD3である、請求項1に記載の化合物。 14.3β−[(6−ビオチンアミジル)ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキ シビタミンD3である、請求項1に記載の化合物。 15.3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミドである、請 求項1に記載の化合物。 16.R1がビタミンD2またはビタミンD3の側鎖である、請求項1に記載の 化合物。 17.R1が、C23、C24またはC25位で少なくとも1つのヒドロキシ基によ り置換されたビタミンD2またはビタミンD3の側鎖である、請求項1に記載の化 合物。 18.第一の容器が請求項1に記載の化合物を含有するものである、1つ以上 の容器が近接して制限されて入れられているキャリヤーである、キット。 19.改良点が、標識ビタミンD化合物として請求項1に記載の標識化合物を 使用することを含むものである、サンプル中のビタミンD化合物の存在をアッセ イする方法。 20.Zがビオチンである、請求項19に記載の方法。 21.標識化合物が、25−ヒドロキシ−3−アミノプロポキシビタミンD3 ビオチンアミド、25−ヒドロキシ−3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタン アミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、25−ヒドロキシ−3β−[(6− ビオチンアミジル)−ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、2 5−ヒドロキシ−3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミド、 1,25−ジヒドロキシ−3−アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミド、1 ,25−ジヒドロキシ−3β−[(5−ビオチンアミジル)ペンタンアミド]−3− アミノプロポキシビタミンD3、1,25−ジヒドロキシ−3β−[(6−ビオチン アミジル)−ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、1,25−ジ ヒドロキシ−3β−アミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミド、3− アミノプロポキシビタミンD3ビオチンアミド、3β−[(5−ビオチンアミジル) ペンタンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3、3β−[(6−ビオチンア ミジル)−ヘキサンアミド]−3−アミノプロポキシビタミンD3または3β−ア ミノプロポキシビタミンD3フルオレセインアミドである、請求項19に記載の 方法。 22.R1がビタミンD2またはビタミンD3の側鎖である、請求項19に記載 の方法。 23.R1が、C23、C24またはC25位で少なくとも1つのヒドロキシ基によ り置換されたビタミンD2またはビタミンD3の側鎖である、請求項19に記載の 方法。 24.(a)請求項1に記載の標識化合物に結合できるタンパク質または抗体 を上に固定した固相支持体を提供し; (b)該固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗体に結合するに充分 な時間、請求項1に記載の標識化合物の溶液と接触させ; (c)工程(b)で得られた固相支持体を、非結合標識化合物を除去するに充分 な時間で洗浄し; (d)工程(c)で得られた固相支持体を、標識化合物が該タンパク質または抗 体と置換するに充分な時間、ビタミンD、その代謝物または類似体を含むことが 疑われる液体サンプルと接触させ; (e)工程(d)で得られた液体を除去し;および (f)工程(e)で得られた液体中の標識化合物の存在を検知する; ことを含み、ここで、工程(f)で検知された標識化合物の量は、該試験サンプ ル中のビタミンD、その代謝物または類似体の量に正比例する、試験サンプル中 のビタミンD、その代謝物または類似体を検知するための固相アッセイ法。
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