CN1854730A - 筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法。本发明所提供的筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法，是检测待测血清中包括黄嘌呤和次黄嘌呤在内的嘌呤化合物的含量，如待测血清中黄嘌呤含量为1.00－2.35mg/L，和/或次黄嘌呤含量为4.1－16.00mg/L，则待测血清为痛风疑似患者血清；如待测血清中黄嘌呤含量为0.20－1.20mg/L，和/或次黄嘌呤含量为1.30－3.50mg/L，则待测血清为高尿酸血症疑似患者血清。本发明的方法简便，避免了使用昂贵的同位素内标进行定量，使得此方法易于在临床上应用，对于早期发现痛风并进行早期治疗有重要的参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法。
背景技术
痛风是嘌呤代谢紊乱及(或)尿酸排泄减少所引起的一类疾病。临床特点为高尿酸血症(hyperuricemia)、反复发作的急性单一关节炎(recurrent acute monoarthritis)、尿酸钠盐形成痛风石(tophi)沉积、痛风石性慢性关节炎，若未经适当治疗，最终通常发展为痛风性肾病(gouty nephropathy)。
高尿酸血症是痛风最重要的生化基础，但并不是痛风的同义词。正常人群中高尿酸血症的发病率为5％～10％，但高尿酸血症患者中只有5％～18.8％最终发展为痛风。因此如果能在高尿酸血症的发病阶段检测到与痛风发病的相关因子，就可以对患者进行及早治疗。目前临床检测只测定血液中尿酸含量，但临床上也有少数患者的尿酸值正常，如果而且能同时测定其它相关嘌呤代谢因子，就能对高尿酸血症和痛风患者的诊断提供更大的帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法。
本发明所提供的筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法，是检测待测血清中包括黄嘌呤和次黄嘌呤在内的嘌呤化合物的含量，如待测血清中黄嘌呤含量为1.00-2.35mg/L，和/或次黄嘌呤含量为4.1-16.00mg/L，则待测血清为痛风疑似患者血清；如待测血清中黄嘌呤含量为0.20-1.20mg/L，和/或次黄嘌呤含量为1.30-3.50mg/L，则待测血清为高尿酸血症疑似患者血清。
所述嘌呤化合物还包括尿酸、腺苷、鸟苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧腺苷、肌苷、2’-脱氧肌苷、腺嘌呤。
所述检测待测血清中嘌呤化合物的方法，包括用高效液相色谱对待测血清进行分离，用串联质谱对每个高效液相色谱峰进行定性鉴定，用在线紫外检测对包括黄嘌呤和次黄嘌呤在内的嘌呤化合物进行定量的步骤。
所述检测待测血清中嘌呤化合物的方法中，还包括如下对待测血清进行前处理的步骤：取1体积待测血清加入到5体积的甲醇中，在4℃下以12000r/min的速度离心10min，将得到的上清液在50℃下用氮气吹干，将剩余的残渣加入到1体积的纯水中溶解，然后以12000r/min的速度离心10min，得到的上清溶液即可用于检测。
所述高效液相色谱所采用的色谱柱是supelcosil LC-18-DB柱。
所述高效液相色谱分析中，流动相为pH6.5的10mM的醋酸铵溶液和甲醇。
所述高效液相色谱分析中，用A和B进行如下梯度洗脱：
0min至10min 100％A 0％B
16min 92％A 8％B
30min 80％A 20％B
60min 0％A 100％B；
所述A为pH6.5的10mM醋酸铵溶液，所述B为甲醇；所述百分数均为体积百分数。
所述串联质谱分析中的质谱条件为干燥气(N2)流量8.0L/min；雾化气(N2)流量1.72×105Pa；干燥气温度325℃；目标质量参数200m/z；化合物稳定性参数60％；离子阱驱动度50％；ICC目标参数20000。
本发明创造性地发现了高尿酸血症和痛风的相关因子黄嘌呤和次黄嘌呤，利用高效液相色谱串联质谱方法检测血清中黄嘌呤和次黄嘌呤，并通过外标法对其进行定量；通过检测血清中黄嘌呤和次黄嘌呤的含量，即可筛查出痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者。本发明的方法简便，避免了使用昂贵的同位素内标进行定量，使得此方法易于在临床上应用，对于早期发现痛风并进行早期治疗有重要的参考价值。
附图说明
图1是10种嘌呤化合物标准品溶液HPLC色谱分离图(254nm下)
图2是10种嘌呤化合物标准品溶液加入空白血清的HPLC色谱分离图(254nm下)
图3是其中一名痛风患者血清的HPLC色谱分离图(254nm下)
图4是其中一名无症状高尿酸血症患者血清的HPLC色谱分离图(254nm下)
图5是其中一名正常人血清的HPLC色谱分离图(254nm下)
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、检测血清中10种嘌呤化合物的方法
标准品尿酸、次黄嘌呤和黄嘌呤购自Fluka公司；腺嘌呤、腺苷、肌苷、鸟苷、2’-脱氧腺苷、2’-脱氧肌苷、2’-脱氧鸟苷购自Sigma公司。
本方法通过高效液相色谱(HPLC)对血清进行分离，串联质谱(MS/MS)对每个色谱峰进行定性鉴定，用在线紫外检测(UV)对10个嘌呤化合物进行定量。其具体操作过程如下：
一、样品前处理
将于-80℃下保存的冰冻牛血清(作为空白对照)、正常人血清、痛风患者血清、无症状高尿酸血症患者血清分别在冰浴中慢慢融解，然后取0.1mL上清液加入到500μL甲醇中，在4℃下以12000r/min的速度离心10min，使上清液中的蛋白沉淀。转移出上清液，将其在50℃下用氮气吹干，将溶液吹干后剩余的残渣加入到100μL纯水中溶解，然后以12000r/min的速度离心10min，取离心后的上清溶液用于进样检测。
二、色谱及质谱条件
1、色谱条件
仪器：Agilent 1100series LC/MSD Trap
色谱柱：supelcosilTM LC-18-DB柱(25cm×4.6mm(id)，填料膜厚5μm).
流动相：A：10mM的醋酸铵溶液，用冰醋酸和氨水调至pH＝6.5
B：甲醇
流速：1mL/min
柱温：25℃
进样量：20μL
梯度洗脱程序：(每次进样之间平衡柱子10分钟)
时间(min) A％(体积百分数) B％(体积百分数)
0 100 0
10 100 0
16 92 8
30 80 20
60 0 100
70 0 100
2、在线紫外检测条件
利用Agilent 1100series LC/MSD Trap系统自带的紫外检测器用254nm紫外线进行紫外检测。
3、质谱条件
质谱检测在ESI电离负离子模式下进行，电离电压为3.5KV。质谱优化后条件为：干燥气(N2)流量8.0L/min；雾化气(N2)流量1.72×105Pa；干燥气温度325℃；目标质量参数200m/z；化合物稳定性参数60％；离子阱驱动度50％；ICC目标参数20000。
三、检测
(1)质谱定性鉴定：所有色谱峰都做自动的二级质谱。将10个嘌呤化合物标准品(尿酸，次黄嘌呤，黄嘌呤，腺嘌呤，肌苷，鸟苷，2’-脱氧肌苷，2’-脱氧鸟苷，腺苷和2’-脱氧腺苷)溶于10mM的醋酸铵中，使其终浓度均为5mg/L。鉴定每种嘌呤化合物的母离子和子离子碎片，如表1所示：
表1.10种嘌呤化合物的质谱鉴定母离子和子离子
| 化合物 | 分子量 | 母离子 | 子离子 |
| 尿酸 | 168.1 | 167 | 124 |
| 黄嘌呤 | 152.1 | 151 | 108 |
| 次黄嘌呤 | 136.1 | 135 | 92 |
| 腺嘌呤 | 135.1 | 134 | 107 |
| 腺苷 | 267.2 | 266 | 134 |
| 鸟苷 | 283.2 | 282 | 150 |
| 2’-脱氧鸟苷 | 267.2 | 266 | 150 |
| 2’-脱氧腺苷 | 251.2 | 250 | 134 |
| 肌苷 | 268.2 | 267 | 135 |
| 2’-脱氧肌苷 | 252.2 | 251 | 135 |
表1表明，其中碱基的母离子容易掉43(HNCO)的碎片，核苷类母离子易脱掉132(核糖)的碎片，脱氧核糖母离子易脱掉116(脱氧核糖)的碎片。这些特征丢失对于定性鉴定这些化合物是非常有意义的。
(2)HPLC对10种嘌呤化合物标准品的分离效果
将上述10种嘌呤化合物标准品配成标准品水溶液，在步骤二的色谱条件下进行HPLC色谱分离(254nm)，其分离效果如图1所示，表明在步骤二的色谱条件下，该10种嘌呤化合物可得到很好的分离。图1中，1是尿酸，2是次黄嘌呤，3是黄嘌呤，4是腺嘌呤，5是肌苷，6是鸟苷，7是2’-脱氧肌苷，8是2’-脱氧鸟苷，9是腺苷，10是2’-脱氧腺苷。
在经步骤一处理的作为空白对照的牛血清中加入上述10种嘌呤化合物标准品，在步骤二的色谱条件下进行HPLC色谱分离(254nm)，其分离效果如图2所示，表明在步骤二的色谱条件下，该10种嘌呤化合物可得到很好的分离。图2中，1是尿酸，2是次黄嘌呤，3是黄嘌呤，4是腺嘌呤，5是肌苷，6是鸟苷，7是2’-脱氧肌苷，8是2’-脱氧鸟苷，9是腺苷，10是2’-脱氧腺苷。
(3)定量工作曲线制定：
除尿酸外，所有标准品的储备液(水溶液)浓度为20mg/L，尿酸储备液(水溶液)的浓度为50mg/L。由储备液稀释得到不同浓度标准液(水溶液)，绘制工作曲线，如表2所示。
表2.10种嘌呤类化合物的检出限和工作曲线
| 化合物 | 工作曲线 | R2 | 检出限(μg/L) |
| 尿酸 | y＝0.0263x+7.6788 | 0.9995 | 50 |
| 黄嘌呤 | y＝0.0556x-1.4298 | 0.9997 | 20 |
| 次黄嘌呤 | y＝0.097x-1.4774 | 0.9992 | 20 |
| 腺嘌呤 | y＝0.1267x-4.3569 | 0.9993 | 40 |
| 腺苷 | y＝0.0219x-0.4839 | 0.9997 | 80 |
| 鸟苷 | y＝0.0345x-2.3863 | 0.9994 | 80 |
| 2’-脱氧鸟苷 | y＝0.0649x+1.7449 | 0.9994 | 40 |
| 2’-脱氧腺苷 | y＝0.0512x-1.2237 | 0.9999 | 50 |
| 肌苷 | y＝0.0411x-1.7115 | 0.9992 | 80 |
| 2’-脱氧肌苷 | y＝0.0453x-1.0927 | 0.9997 | 80 |
注：工作曲线中的y为峰面积，x为浓度(ug/L)。
其中检出限为3倍信噪比，定量下限为5～10倍信噪比，工作曲线范围均为3个数量级，方法的检出限较其它的方法低1倍，所有化合物工作曲线的R2都超过0.999，线性良好。
(4)方法的日内精密度：一日内重复7次测定一份高尿酸血症患者血清样品—血清-空白和三份加样样品(1mL原始患者血清样品中复溶各100ng的上述10种嘌呤类化合物得到加样样品—血清-低，1ml原始血清样品中复溶各500ng的上述10种嘌呤类化合物得到加样样品—血清-中，1ml原始血清样品中复溶各5μg的上述10种嘌呤类化合物得到加样样品—血清-高)中10种嘌呤类化合物的含量，精密度结果如表3所示。
表3中的数据表明，方法的日间精密度的CV基本都低于10％，高浓度样品的精密度要优于低浓度样品的精密度，总体的精密度能够满足临床检测的需要，而且远远高于现在临床检测尿酸的方法。
(5)方法的日间精密度：分别在7日内每日测定一份高尿酸血症患者血清样品—血清-空白和一份加样样品(在1ml原始血清样品中复溶各500ng的上述10种嘌呤类化合得到加样样品—血清-加样)中10种嘌呤类化合物的含量：精密度结果如表4所示：
表3.血清样品的日内精密度
| 化合物 | 血清—空白a | 血清—低b | 血清—中b | 血清—高b | ||||
| mg/L | CV％c | mg/L | CV％ | mg/L | CV％ | mg/L | CV％ | |
| 尿酸黄嘌呤次黄嘌呤腺嘌呤腺苷鸟苷2’-脱氧鸟苷2’-脱氧腺苷肌苷2’-脱氧肌苷 | 66.550.791.430.110.210.390.480.170.690 | 1.06.35.210.97.86.47.18.04.80 | 66.640.871.510.200.290.490.560.250.780.09 | 0.94.73.99.27.16.54.76.94.37.5 | 67.011.251.890.590.670.830.940.631.140.46 | 0.63.63.35.64.73.43.84.73.16.2 | 71.175.336.274.814.875.185.194.965.334.85 | 0.81.81.42.31.51.31.51.72.11.8 |
| a原始血清.b血清加入低(100μg/L)，中(500μg/L)，高(5mg/L)不同浓度标准品cn＝7. | ||||||||
表4.血清样品的日间精密度
| 化合物 | 血清-空白a | 血清-加样b | ||
| mg/L | CV％c | mg/L | CV％ | |
| 尿酸黄嘌呤次黄嘌呤腺嘌呤腺苷鸟苷2’-脱氧鸟苷2’-脱氧腺苷肌苷2’-脱氧肌苷 | 57.910.431.220.150.270.320.520.190.390 | 3.710.86.419.915.817.49.724.812.90 | 58.420.861.730.580.730.790.980.610.840.44 | 4.48.36.812.814.39.110.118.77.36.2 |
| a原始血清.b血清加入500μg/L各种标准品.cn＝7. | ||||
表4表明，虽然日间精密度略高于日内精密度，但基本都在20％以内，其中低浓度的精密度稍差，但是方法足够满足目前临床检测需要。
(6)方法的回收率：分别测定7份三种不同浓度加样血清样品(1mL原始患者血清样品中复溶各100ng的上述10种嘌呤类化合物得到加样样品—血清-低，1ml原始血清样品中复溶各500ng的上述10种嘌呤类化合物得到加样样品—血清-中，1ml原始血清样品中复溶各5μg的上述10种嘌呤类化合物得到加样样品—血清-高)中加样的回收率，结果如表5所示：
表5.方法回收率
| 化合物 | 血清—低a | 血清—中a | 血清—高a | |||
| 回收率％ | CV％b | 回收率％ | CV％ | 回收率％ | CV％ | |
| 尿酸黄嘌呤次黄嘌呤腺嘌呤腺苷鸟苷2’-脱氧鸟苷2’-脱氧腺苷肌苷2’-脱氧肌苷 | 92.386.496.987.685.493.584.591.392.187.4 | 1.74.82.25.87.15.56.56.64.96.1 | 97.491.793.791.089.695.287.991.593.891.5 | 1.23.31.83.72.94.34.94.73.76.2 | 95.594.594.796.490.998.491.893.195.294.8 | 0.91.61.12.03.11.12.21.72.21.8 |
| a血清加入低(100μg/L)，中(500μg/L)，高(5mg/L)浓度的标准品bn＝7. | ||||||
表5表明，三个浓度的加样血清样品的回收率都高于85％，绝大多数都高于90％，在血液等复杂基质的检测中属于非常好的结果。而且每个浓度回收率的CV％都小于10，绝大多数都低于5，也完全能满足临床检测的需要。
实施例2、检测正常人、痛风和无痛风症状高尿酸血症患者的血清中嘌呤化合物
临床选择男性未治疗痛风患者49名，未治疗无痛风症状高尿酸血症患者20名，正常人35名。每名受检者静脉抽取血样2mL，血样经离心得到血清后，采取与实施例1同样的检测步骤进行对血清中10种嘌呤化合物进行定性定量检测，痛风，无症状高尿酸血症患者和正常人血清的HPLC检测图谱如图3、图4和图5所示。图3、图4和图5中，1是尿酸，2是次黄嘌呤，3是黄嘌呤，4是腺嘌呤，5是肌苷，6是鸟苷，7是2’-脱氧肌苷，8是2’-脱氧鸟苷，9是腺苷，10是2’-脱氧腺苷。在所检测的10种嘌呤化合物中，有8种含量有差别，含量有差别的8种嘌呤化合物定量检测结果如表6所示：
表6.正常人，痛风和高尿酸血症患者血清中嘌呤化合物的含量
| 化合物(mg/L) | 痛风患者血清(n＝49) | 高尿酸血症患者血清(n＝20) | 正常人血清(n＝35) |
| 尿酸 | 68.6±42.8 | 72.1±57.1 | 46.5±13.2 |
| 黄嘌呤 | 1.26±0.70 | 0.76±0.63 | 0.29±0.07 |
| 次黄嘌呤 | 6.38±4.56 | 2.20±1.89 | 0.74±0.20 |
| 腺苷 | 0.64±0.42 | 0.54±0.36 | 0.15±0.29 |
| 鸟苷 | 0.65±0.47 | 0.47±0.38 | 0.13±0.19 |
| 2’-脱氧鸟苷 | 0.33±0.39 | 0.52±0.38 | 有的未检出 |
| 2’-脱氧腺苷 | 0.31±0.22 | 0.40±0.29 | 有的未检出 |
| 肌苷 | 0.78±0.77 | 0.64±0.41 | 0.11+0.12 |
注：表中数值为均值±标准差。
表6表明，两类患者及正常人血清中黄嘌呤和次黄嘌呤的含量差别较大，由t检验两者存在显著性差异(P＜0.01)。因此黄嘌呤和次黄嘌呤是区分两类患者较好的代谢标志物，监控无症状高尿酸血症患者血液中此两个化合物的含量，对于早期发现痛风并进行早期治疗有重要的参考价值。
Claims (8)
1、一种筛查痛风疑似患者及高尿酸血症疑似患者血清的方法，是检测待测血清中包括黄嘌呤和次黄嘌呤在内的嘌呤化合物的含量，如待测血清中黄嘌呤含量为1.00-2.35mg/L，和/或次黄嘌呤含量为4.1-16.00mg/L，则待测血清为痛风疑似患者血清；如待测血清中黄嘌呤含量为0.20-1.20mg/L，和/或次黄嘌呤含量为1.30-3.50mg/L，则待测血清为高尿酸血症疑似患者血清。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述嘌呤化合物还包括尿酸、腺苷、鸟苷、2’-脱氧鸟苷、2’-脱氧腺苷、肌苷、2’-脱氧肌苷、腺嘌呤。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测待测血清中嘌呤化合物的方法，包括用高效液相色谱对待测血清进行分离，用串联质谱对每个高效液相色谱峰进行定性鉴定，用在线紫外检测对包括黄嘌呤和次黄嘌呤在内的嘌呤化合物进行定量的步骤。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待测血清中嘌呤化合物的方法中，还包括如下对待测血清进行前处理的步骤：取1体积待测血清加入到5体积的甲醇中，在4℃下以12000r/min的速度离心10min，将得到的上清液在50℃下用氮气吹干，将剩余的残渣加入到1体积的纯水中溶解，然后以12000r/min的速度离心10min，得到的上清溶液即可用于检测。
5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱所采用的色谱柱是supelcosil LC-18-DB柱。
6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱分析中，流动相为pH6.5的10mM的醋酸铵溶液和甲醇。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱分析中，用A和B进行如下梯度洗脱：
0min至10min 100％A 0％B
16min 92％A 8％B
30min 80％A 20％B
60min 0％A 100％B；
所述A为pH6.5的10mM醋酸铵溶液，所述B为甲醇；所述百分数均为体积百分数。
8、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述串联质谱分析中的质谱条件为所述串联质谱分析中的质谱条件为干燥气流量8.0L/min；雾化气流量1.72×105Pa；干燥气温度325℃；目标质量参数200m/z；化合物稳定性参数60％；离子阱驱动度50％；ICC目标参数20000。
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