DE202019005825U1

DE202019005825U1 - Biologische Synthese von Aminosäureketten zur Herstellung von Peptiden und Proteinen

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Publication number: DE202019005825U1
Application number: DE202019005825.7U
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CA3087218C; EA202091713A1; EP3740584A1; US20200347373A1; US11697809B2; DE102018200602A1; WO2019138125A1; CA3087218A1

Abstract

Fusionspolypeptid, umfassend in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus:
(i) eine Reinigungsdomäne,
(ii) eine Autoproteasedomäne und
(iii) eine Zielpeptiddomäne, wobei die Reinigungsdomäne (i) an ein Oligo- oder Polysaccharid, insbesondere an Cellulose, Chitin und/oder Stärke bindet, und eine Glucoamylase und/oder eine Amylase ist, und wobei Autoproteasedomäne (ii) die CSFV-N^pro-Mutante EDDIE umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionspolypeptide, Nukleinsäuremoleküle, die die Fusionspolypeptide kodieren, und gentechnisch modifizierte Zellen, die die Nukleinsäuremoleküle enthalten. Darüber hinaus werden Verfahren zur Herstellung von Zielpolypeptiden, insbesondere von Zielpeptiden mit einem authentischen N-Terminus, unter Verwendung der Fusionspolypeptide, beschrieben.
Natürlich vorkommende und synthetische Peptide und Polypeptide können in verschiedenen Anwendungen verwendet werden, wie etwa in der Entwicklung von Wirkstoffkomponenten, in der Kosmetik- und Lebensmittelindustrie, Medizin, Landwirtschaft, Materialforschung und asymmetrischen Katalyse. Tatsächlich ist fast jeder Industriezweig, der Spezialchemikalien herstellt oder verwendet, relevant. Diese zahlreichen Funktionen von Peptiden werden durch ihre hohe strukturelle und funktionelle Diversität möglich gemacht.
Es besteht daher ein hoher Bedarf, einfache und effiziente Mittel zur Herstellung von Peptiden zu entwickeln.
WO 2006/113957 betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Polypeptids, umfassend die Expression eines Fusionspolypeptids, wobei das Fusionspolypeptid eine Mutante der Autoprotease N^pro eines Pestivirus und ein zweites C-terminal verknüpftes Polypeptid umfasst, wobei das zweite Polypeptid autoproteolytisch gespalten werden kann. Außerdem können weitere Fusionsdomänen am N-Terminus vorhanden sein, die für die Bindung an ein Affinitätschromatographiesystem erforderlich sind, z. B. Poly(aminosäuren) wie Polylysin oder Epitop-Tags, d. h. kurze Peptidsequenzen, für die ein spezifischer Antikörper verfügbar ist.
Ein erheblicher Nachteil dieses Verfahrens ist die Notwendigkeit komplexer Reinigungsschritte, die zum Gewinnen (Sammeln) des Zielpeptids erforderlich sind, wie Affinitätschromatographie und HPLC. Für affinitätschromatographische Verfahren werden kostspielige Reagenzien (z. B. Ni/NTA, Antikörper, Sephadex™, Imidazol) und hohe Mengen an umweltschädlichen und/oder toxischen Lösungsmitteln benötigt. Außerdem müssen Kompatibilitätsprobleme der Autoproteasedomäne berücksichtigt werden. Eine unbeabsichtigte Aktivierung der Autoproteasedomäne während der Reinigung kann zu einer vorzeitigen Spaltung und somit zu einem Ausbeuteverlust führen. Darüber hinaus können die Eigenschaften des Zielpeptids wie Peptidlänge, Polarität und/oder Toxizität die Autoproteaseaktivität und/oder die Endausbeute beeinflussen. Ferner müssen affinitätschromatographisch gereinigte Peptide oft in einem zusätzlichen HPLC-Schritt gereinigt werden, um den gewünschten Grad an Reinheit zu erreichen. Dadurch wird die Ausbeute stark vermindert und die Wirtschaftlichkeit dieser Verfahren weiter eingeschränkt.
WO 2008/052387 offenbart Stärke-bindende Domänen und diese enthaltende rekombinante Polypeptide, wobei die Stärke-bindenden Domänen in N-terminaler und/oder C-terminaler Richtung vom Zielpolypeptid her angeordnet sind. Die Fusionspolypeptide können mittels Chromatographie auf einem Stärketräger gereinigt werden.
Ein schwerwiegender Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Reinigungsdomänen nicht abgespalten werden können und somit im Zielpeptid verbleiben. Diese Modifikation des Zielpeptids kann zu unvorhersehbaren und unbeabsichtigten Nebenreaktionen bei der Peptidanwendung führen.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Fusionspolypeptid, umfassend in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus

(i) eine Reinigungsdomäne,
(ii) eine Autoproteasedomäne, und
(iii) eine Zielpeptiddomäne, wobei die Reinigungsdomäne (i) an ein Kohlenhydrat bindet.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, kodierend ein wie oben beschriebenes Fusionspolypeptid, das optional mit einer Expressionssteuerungssequenz verknüpft ist.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine gentechnisch modifizierte Zelle, die ein Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben enthält.
Weiterhin wird hierin ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids beschrieben, umfassend die Schritte

(a) Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid wie oben beschrieben exprimiert,
(b) Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Kulturmedium und unter Bedingungen, die für die Expression des Fusionspolypeptids und die Bildung von Einschlusskörperchen, die das Fusionspolypeptid umfassen, geeignet sind,
(c) Solubilisieren der Einschlusskörperchen, die das Fusionspolypeptid umfassen,
(d) Inkontaktbringen des solubilisierten Fusionspolypeptids mit einer kohlenhydratbasierten Matrix, die Affinität für die Reinigungsdomäne (i) aufweist, unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet,
(e) Spaltung des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzung des Zielpeptids (iii), und
(f) Gewinnen des Zielpeptids (iii).

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Herstellung eines Zielpeptids unter Verwendung eines Fusionspolypeptids, das eine Kohlenhydrat-bindende Reinigungsdomäne und eine Autoprotease umfasst, zu einer signifikanten Vereinfachung des Herstellungsverfahrens, z. B. durch Vermeiden komplexer HPLC-Reinigungsschritte, und/oder zu einer verbesserten Ausbeute eines akkurat prozessierten Zielpeptids, insbesondere eines Zielpeptids mit authentischem N-Terminus, führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionspolypeptid die Domänen (i), (ii) und (iii) und optional eine N-terminale Signalsequenz, die optional die Startaminosäure der Reinigungsdomäne (i) ersetzt, und/oder eine Linkersequenz, die zwischen den Domänen (i) und (ii) vorhanden ist.
Das Fusionspolypeptid gemäß der Erfindung umfasst (i) eine Reinigungsdomäne, die an ein Kohlenhydrat bindet. Zum Beispiel bindet die Reinigungsdomäne an ein Oligosaccharid oder Polysaccharid, insbesondere an Cellulose, Chitin und/oder Stärke. Vorzugsweise weist die Reinigungsdomäne (i) eine Länge von 25-2000 Aminosäuren, bevorzugtermaßen von 50-1000 Aminosäuren und stärker bevorzugt von 70-800 oder 100-600 Aminosäuren auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet die Reinigungsdomäne an Stärke. Der Begriff „Stärke“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet ein lineares, vernetztes oder zyklisches Kohlenhydrat aus α-1,4- und/oder α-1,6-verknüpften Glucoseeinheiten, beispielsweise Amylose, Amylopektin, Glykogen, Dextrin oder Cyclodextrin. Eine an Stärke bindende Reinigungsdomäne umfasst zum Beispiel eine Glucoamylase und/oder eine Amylase und/oder eine Stärkebindungsdomäne davon, zum Beispiel humane Amylasen, von Aspergillus niger abgeleitete Amylase oder von Rhizopus spp. abgeleitete Glucoamylase, z. B. die Kohlenhydrat-bindenden Module CBM20, CBM21 und/oder CBM26 oder Kombinationen davon.
Eine Endoglucanase oder eine Cellobiase oder ein Cellulose-bindendes Fragment davon kann z. B. als an Cellulose bindende Reinigungsdomäne verwendet werden. Eine Intein-Chitin-bindende Domäne (iCBD) kann z. B. als an Chitin bindende Reinigungsdomäne verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen weist eine Reinigungsdomäne (i) gemäß der vorliegenden Erfindung eines oder mehrere der folgenden Merkmale auf

(a) sie bindet an Stärke, wie Amylose, Amylopektin, Glykogen, ein Dextrin und/oder ein Cyclodextrin;
(b) sie enthält keine, eine oder mehrere Stärkebindungsdomänen;
(c) sie enthält keine, eine oder mehrere Oberflächenbindungsstellen für Kohlenhydrate;
(d) sie weist keine, eine oder mehrere Kohlenhydratbindungsstellen auf; oder
(e) sie stellt eine Kombination eines oder mehrerer Merkmale von (a)-(d) bereit.

Der Begriff „Stärkebindungsdomäne“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf bestimmte Schlüsselmoleküle, die in manchen Enzymen vorhanden sind und am Polysaccharid-Stoffwechsel beteiligt sind. Diese nichtkatalytischen Module werden als essentiell für die Bindung von Stärke und für die katalytische Aktivität von Stärkesynthase III beschrieben (Barchiesi etal., BMC Res Notes 2015, 8, 613).
Der Begriff „Oberflächenbindungsstelle“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Ligandenbindungsstelle, die auf dem katalytischen Modul eines Enzyms, jedoch außerhalb des aktiven Zentrums, angeordnet ist. Bisher wurden Oberflächenbindungsstellen in der Kristallstruktur von mehr als 45 kohlenhydrataktiven Enzymen beobachtet, wobei etwa die Hälfte dieser Enzyme der GH13-Familie angehört (Cockburn et al., Biologica 2014, 69, 705; Rauter und Lindhorst (Hrsg.) Carbohydrate Chemistry - Chemical and Biological Approaches - Bd. 39, Specialist Periodical Reports, 2013).
Der Begriff „Kohlenhydratbindungsstelle“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Proteindomäne, die in kohlenhydrataktiven Enzymen wie zum Beispiel Glykosidhydrolasen vorhanden ist. Die Mehrheit dieser Domänen besitzt eine Kohlenhydrat-bindende Aktivität. Kohlenhydratbindungsstellen werden auch als Cellulose-bindende Stellen bezeichnet (Gilkes et al., Microbiol Rev 1991, 55, 303). Basierend auf der Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit werden sie in zahlreiche Familien eingeteilt, von denen bis heute mehr als 65 bekannt sind (Carbohydrate-Active EnZymes Datenbank (CAZy) www.cazypedia.org/index.php/Carbohydate-binding_modules; 10. Januar oder 19. Dezember 2018).
Ein weiteres Element des Fusionspolypeptids gemäß der Erfindung ist die Autoproteasedomäne (ii). Der Begriff „Autoproteasedomäne“ bezeichnet eine Protease, die einen Fusionspartner, der daran gebunden ist, an einer vorbestimmten Stelle spaltet. Die Autoproteasedomäne (ii) kann eine virale Autoprotease umfassen, vorzugsweise eine aus einem Virus der Familie Flaviviridae abgeleitete Autoprotease, stärker bevorzugt eine aus einem Pestivirus abgeleitete Autoprotease und noch bevorzugter eine N^pro-Autoprotease oder ein aktives Fragment oder eine aktive Mutante einer solchen Autoprotease. Zum Beispiel kann die Autoproteasedomäne (ii) eine N^pro-Autoprotease von CSFV (Classical Swine Fever Virus), z. B. aus dem CSFV-Stamm Alfort (Gottipati et al., PLoS Pathog 2013, 9, e1003704; Patron etal., Vet Microbiol 2010, 73, 137; Meyers et al., Virology 1989, 171, 555; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04358, 10. Januar 2018) oder eine Mutante einer N^pro-Autoprotease umfassen. Zum Beispiel kann eine Mutante einer N^pro-Autoprotease verwendet werden, bei der mindestens ein Cysteinrest der natürlich vorkommenden N^pro-Autoprotease durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, wobei bevorzugte Mutanten in WO 2006/113957 beschrieben sind, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Bevorzugte Mutationsstellen sind C112, C134 und C138 der natürlich vorkommenden N^pro-Autoprotease. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist die Mutante EDDIE, die als SEQ ID NO: 5 in WO 2006/113957 offenbart ist, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Ebenfalls geeignet sind Wildtyp-N^pro-Autoproteasen oder N^pro-Autoprotease-Mutanten ohne Mutation eines der darin vorhandenen Cysteinreste. Solche Mutationen können eine Substitution von z. B. mindestens einer basischen Aminosäure durch eine saure Aminosäure, mindestens einer sauren Aminosäure durch eine basische Aminosäure, mindestens einer hydrophoben Aminosäure durch eine hydrophile Aminosäure und/oder mindestens einer hydrophilen Aminosäure durch eine hydrophobe Aminosäure umfassen.
Die Autoproteasedomäne (ii) kann das Fusionspolypeptid nach dem Autoprotease-C-Terminus und vor dem Zielpeptid-N-Terminus, d. h. vor dem Beginn des Zielpeptids (iii) spalten. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung so, dass keine Aminosäurereste der Autoproteasedomäne (ii) bei dem Zielpeptid (iii) verbleiben und ein Zielpeptid mit einem authentischen N-Terminus erhalten wird. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Cysteinrest am N-Terminus des Zielpeptids verbleiben.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Reinigung verschiedener Zielpeptide. Der Begriff „Zielpeptid“ umfasst Peptidsequenzen mit einer Länge von 2 oder mehr Aminosäuren, z. B. von 2-1000 oder mehr Aminosäuren. Somit kann das Zielpeptid beispielsweise eine Kettenlänge von (a) 2-100, z. B. 2-50 Aminosäuren, (b) 100-500 Aminosäuren oder (c) mehr als 500 Aminosäuren aufweisen.
Mittels der vorliegenden Erfindung können verschiedene Typen von Zielpeptiden hergestellt werden, insbesondere Peptide, die durch übliche Verfahren, wie rekombinante Synthese und Festphasensynthese, nicht oder kaum verfügbar sind. Peptide gemäß der Erfindung umfassen zum Beispiel stark hydrophobe Zielpeptide mit einem Anteil an hydrophoben Aminosäuren von ≥10%, bevorzugt ≥20%, stärker bevorzugt ≥30% und noch bevorzugter ≥40%, bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren des Zielpeptids, wobei hydrophobe Aminosäuren aus Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Tryptophan und Phenylalanin ausgewählt sind. Andererseits können auch stark hydrophile Zielpeptide hergestellt werden, beispielsweise mit einem Anteil an hydrophilen Aminosäuren von ≥10%, bevorzugt ≥20%, stärker bevorzugt ≥30%, noch bevorzugter ≥40%, bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren des Zielpeptids, wobei hydrophile Aminosäuren ausgewählt sind aus Serin, Threonin, Glutamin, Asparagin, Tyrosin, Glycin, Cystein, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Histidin, Arginin und Lysin. Darüber hinaus können Zielpeptide mit einer Kombination aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäureblöcken, wie oben beschrieben, hergestellt werden. Zum Beispiel können diese Zielpeptide einen Anteil von ≥10%, bevorzugt ≥20%, stärker bevorzugt ≥30%, noch bevorzugter ≥40% und bis zu 100% an hydrophoben Aminosäuren, bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren des Zielpeptids, über längere Abschnitte, z. B. Abschnitte mit einer Länge von vorzugsweise 2 bis 100 Aminosäuren des Zielpeptids, sowie einen Anteil von ≥10%, bevorzugt ≥20%, stärker bevorzugt ≥30%, noch bevorzugter ≥40% und bis zu 100% an hydrophilen Aminosäuren, bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäuren des Zielpeptids, über weitere Abschnitte, z. B. Abschnitte mit einer Länge von vorzugsweise 2 bis 100 Aminosäuren des Zielpeptids, aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das ein wie oben beschriebenes Fusionspolypeptid kodiert. Das Nukleinsäuremolekül kann in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen, z. B. als RNA oder DNA. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Optional kann die Nukleinsäuresequenz, die das Fusionspolypeptid kodiert, funktionsfähig mit einer Expressionssteuerungssequenz, z. B. mit einem Promotor und/oder Enhancer, d. h. einer Sequenz, die die Expression in einer Wirtszelle ermöglicht, verbunden sein. Zum Beispiel kann die Expressionssteuerungssequenz einen autoinduzierbaren, chemisch und/oder thermisch induzierbaren Promotor umfassen, der eine gezielte Steuerung der Expression ermöglicht.
Das Nukleinsäuremolekül kann ferner auf einem Vektor angeordnet sein, d. h. einem Nukleinsäurekonstrukt, das in eine Wirtszelle eingebracht werden kann. Beispielhafte Vektoren sind Virusvektoren, Plasmide und Cosmide, die sich zum Einbringen in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle eignen. Vorzugsweise ist der Vektor ein Plasmid, insbesondere ein Plasmid, das zum Einbringen in eine prokaryotische Wirtszelle geeignet ist.
Optional umfasst das Nukleinsäuremolekül, das das Fusionspolypeptid kodiert, eine Signalpeptid-Kodierungssequenz, die den Typ der Fusionspolypeptidexpression in der Wirtszelle steuert. Vorzugsweise ist eine Signalpeptid-Kodierungssequenz vorhanden, die die Expression in Form unlöslicher Einschlusskörperchen in der Wirtszelle steuert. Eine beispielhafte geeignete Signalsequenz ist in SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 angegeben. Vorzugsweise ersetzt die Signalpeptid-Kodierungssequenz das Startcodon der Reinigungsdomäne (i). Außerdem kann das rekombinante Nukleinsäuremolekül optional eine Linker-kodierende Sequenz zwischen der Reinigungsdomäne (i) und der Autoproteasedomäne (ii) aufweisen. Die Länge des Linkers kann 1-50 oder mehr Aminosäuren betragen. In einer anderen Ausführungsform sind die Domänen (i) und (ii) direkt, d. h. ohne Linker, fusioniert. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die das Fusionspolypeptid kodierende Gensequenz eine zusätzliche Klonierungsstelle, zum Beispiel eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle, am 3'-Terminus der Autoproteasedomäne (ii) auf. Beispielsweise kann die zusätzliche Klonierungsstelle durch eine stille Mutation, d. h. eine Mutation der DNA-Sequenz ohne jeglichen Einfluss auf die Aminosäuresequenz, eingeführt werden und kann zum Beispiel die Codons 2 und 3, von der Richtung des C-Terminus der Autoproteasedomäne her, umfassen. Darüber hinaus kann das rekombinante Nukleinsäuremolekül ein zusätzliches Stopcodon am C-Terminus, beispielsweise das Codon TAA, enthalten.
Die gentechnisch modifizierte Zelle gemäß der Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben, vorzugsweise ein auf einem Vektor angeordnetes Nukleinsäuremolekül, und ist vorzugsweise in der Lage, das Fusionspolypeptid, insbesondere in Form eines unlöslichen Einschlusskörperchens, aber auch in löslicher Form, zu exprimieren. Die gentechnisch modifizierte Zelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, vorzugsweise eine prokaryotische Zelle, z. B. eine gramnegative Bakterienzelle wie eine E.coli-Zelle oder eine grampositive Bakterienzelle wie eine Bacillus-subtilis- oder Bacillus-licheniformis-Zelle. Andererseits kann die Zelle auch eine eukaryotische Zelle sein, beispielsweise eine Hefezelle, Insektenzelle oder Säugerzelle.
Weiterhin wird hierin ein Verfahren zum Herstellen eines Zielpeptids beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid wie oben beschrieben exprimiert,
(b) Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Kulturmedium und unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionspolypeptids und zur Bildung von Einschlusskörperchen, die das Fusionspolypeptid umfassen, geeignet sind,
(c) Solubilisieren der Einschlusskörperchen, die das Fusionspolypeptid umfassen,
(d) Inkontaktbringen des solubilisierten Fusionspolypeptids mit einer kohlenhydratbasierten Matrix mit Affinität für die Reinigungsdomäne (i) unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet,
(e) Spaltung des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzung des Zielpeptids (iii), und
(f) Gewinnen des Zielpeptids (iii).

Schritt (a) umfasst das Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid exprimiert. Eine solche Zelle ist durch Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine für ein Fusionspolypeptid kodierende Sequenz enthält, insbesondere in Form eines Vektors, in die Zelle mittels bekannter Verfahren erhältlich, wie beispielsweise durch Transfektion oder Transformation. Im Schritt (b) wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, z. B. in einem für den jeweiligen Zelltyp allgemein gebräuchlichen Kulturmedium, kultiviert. Die Kultivierung erfolgt unter Bedingungen, bei denen die Expression des Fusionspolypeptids und die Bildung von Einschlusskörperchen, die das Fusionspolypeptid umfassen, stattfindet. Zum Beispiel kann ein induzierbarer Promotor, z. B. ein autoinduzierbarer, chemisch oder thermisch induzierbarer Promotor verwendet werden, um die Expression des Fusionspolypeptids zu steuern. Der Schritt (c) umfasst das Solubilisieren der Einschlusskörperchen, die das Fusionspolypeptid umfassen, vorzugsweise nachdem sie von anderen zellulären Komponenten getrennt wurden. Das Solubilisieren der Einschlusskörperchen kann unter Verwendung eines Puffers durchgeführt werden, der eine hohe Menge an chaotropen Substanzen, wie Harnstoff und/oder Guanidiniumhydrochlorid, enthält.
In Schritt (d) wird das solubilisierte Fusionspolypeptid mit einer kohlenhydratbasierten Matrix mit Affinität für die Reinigungsdomäne (i) so in Kontakt gebracht, dass das Fusionspolypeptid dank seiner Reinigungsdomäne an die Matrix bindet. Zum Beispiel kann die Chromatographie des Fusionspolypeptids unter Verwendung der Matrix, z. B. unter Verwendung einer Säule, die die Matrix enthält, durchgeführt werden. Dieser Schritt wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die Autoproteasedomäne (ii) inaktiv ist, um eine vorzeitige Abspaltung der Zielpeptiddomäne (iii) zu vermeiden. Unter diesen Bedingungen beträgt die Menge an gespaltenem Fusionspolypeptid vorzugsweise ≤10%, ≤5%, ≤3% oder ≤1%. Bedingungen, unter denen eine „inaktive Autoproteasedomäne“ vorliegt, sind (1) Bedingungen, bei denen die Autoproteasedomäne konstitutionell inaktiv ist und erst durch eine Änderung der Umgebungsbedingungen, wie durch eine Anpassung der Temperatur, des pH-Werts und/oder der lonenstärke, aktiviert wird; oder (2) Bedingungen, bei denen die Autoproteasedomäne konstitutionell aktiv ist, jedoch eine unzureichende Aktivität zum Bewirken einer vorzeitigen Spaltung der Zielpeptiddomäne während des zum Durchführen des Verfahrensschritts (d) erforderlichen Zeitraums aufweist, d. h. kinetisch inaktiv ist, z. B. für bis zu 10 min, bis zu 20 min oder bis zu 30 min, während denen die Bindung des Fusionspolypeptids an die Matrix und die Abtrennung von Verunreinigungen erfolgt.
In einer besonderen Ausführungsform wird Schritt (d) unter nativen Bedingungen durchgeführt, d. h. unter Bedingungen, bei denen die Autoprotease konstitutionell aktiv ist. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass selbst wenn das Fusionspolypeptid in seinem nativen Zustand vorliegt, die Autoproteasedomäne während des Schritts (d) ausreichend inaktiv bleibt, wodurch Bedingungen bereitgestellt werden, unter denen das Fusionspolypeptid bei Kontakt mit einer kohlenhydratbasierten Matrix mit Affinität für die Reinigungsdomäne (i) gereinigt werden kann, während Ausbeuteverluste aufgrund einer unbeabsichtigten Abtrennung von vorzeitig abgespaltenem Zielpeptid zusammen mit Verunreinigungen vermieden werden. Vorzugsweise wird im Schritt (d) eine unlösliche Matrix verwendet, die die Abtrennung von Verunreinigungen erleichtert.
Im Schritt (e) wird das Fusionspolypeptid durch die Autoproteasedomäne (ii) gespalten, wodurch das Zielpeptid (iii) freigesetzt wird. Die Spaltung des Fusionspolypeptids kann aus der Zugabe eines Autoproteolysepuffers resultieren, d. h. eines Puffers, der Bedingungen bereitstellt, unter denen die Autoprotease aktiv ist, z. B. saure oder alkalische Bedingungen. In einer Ausführungsform resultiert die Spaltung des Fusionspolypeptids aus einer Änderung des pH-Wertes, beispielsweise durch Zugabe eines sauren Autoproteolysepuffers mit einem pH von ≤5,0, ≤4,5 oder ≤4,0, oder durch Zugabe eines alkalischen Autoproteolysepuffers mit einem pH von >7,0, ≥7,3 oder ≥7,5. Unter solchen Bedingungen wird ein Zielpeptid (iii) mit einem N-terminalen Cysteinrest erhalten, falls ein Fusionspolypeptid mit einem C-terminalen Cysteinrest in der Autoproteasedomäne (ii) verwendet wird.
Schließlich wird im Schritt (f) das Zielpeptid (iii) gewonnen, vorzugsweise umfassend eine Trennung von der Matrix und den daran gebundenen Überbleibseln des Fusionspolypeptids und/oder eine Isolierung des Zielpeptids, z. B. durch Fällung und/oder Zentrifugation. Vorzugsweise umfasst Schritt (f) das Fällen des Zielpeptids in einem organischen Lösungsmittel, z. B. einem Alkohol oder Gemisch von Lösungsmitteln. Hydrophobe Peptide können optional mit einem Lösungsmittel oder Gemisch von Lösungsmitteln extrahiert werden, das nicht mit Wasser mischbar ist. Das gewonnene Zielpeptid kann einen authentischen N-Terminus oder einen N-terminalen Cysteinrest aufweisen.
Weiterhin wird hierin ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids beschrieben, umfassend die folgenden Schritte:

(a') Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid, wie oben beschrieben, exprimiert,
(b') Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Kulturmedium und unter Bedingungen, die für die Expression des Fusionspolypeptids in löslicher Form geeignet sind,
(c') Inkontaktbringen des Fusionspolypeptids mit einer kohlenhydratbasierten Matrix mit Affinität für die Reinigungsdomäne (i) unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet,
(d') Spaltung des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzung des Zielpeptids (iii) und
(e') Gewinnen des Zielpeptids (iii).

Schritt (a') umfasst das Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid exprimiert. Eine solche Zelle ist durch Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine für ein Fusionspolypeptid kodierende Sequenz enthält, insbesondere in Form eines Vektors, in die Zelle mittels bekannter Verfahren, wie durch Transfektion oder Transformation, erhältlich. Im Schritt (b') wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, z. B. in einem für den jeweiligen Zelltyp allgemein gebräuchlichen Kulturmedium, kultiviert. Die Kultivierung erfolgt unter Bedingungen, bei denen die Expression des Fusionspolypeptids in löslicher Form stattfindet. Zum Beispiel kann ein induzierbarer Promotor, z. B. ein autoinduzierbarer, chemisch oder thermisch induzierbarer Promotor verwendet werden, um die Expression des Fusionspolypeptids zu steuern.
Hier wird vorzugsweise ein Fusionspolypeptid mit einer Autoproteasedomäne (ii) verwendet, die unter den Expressionsbedingungen in der Wirtszelle und/oder im Kulturmedium konstitutionell inaktiv ist und erst bei einer spezifischen Anpassung der Umgebungsbedingungen aktiviert wird, beispielsweise durch Zugabe einer aktivierenden Substanz und/oder Anpassung des pH-Wertes aktiviert wird. Zum Beispiel kann die Aktivierung durch Einstellen eines sauren oder alkalischen pH-Werts, wie oben beschrieben, durchgeführt werden.
Die Schritte (c') bis (e') können gemäß den Schritten (d) bis (f) der oben beschriebenen Ausführungsform erfolgen.
Ebenso wird hierin ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids beschrieben, umfassend die folgenden Schritte:

(a") Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid, wie oben beschrieben, sezerniert,
(b") Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Kulturmedium und unter Bedingungen, die für die Sekretion des Fusionspolypeptids geeignet sind,
(c") Inkontaktbringen des Fusionspolypeptids mit einer kohlenhydratbasierten Matrix mit Affinität für die Reinigungsdomäne (i) unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet,
(d") Spaltung des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzung des Zielpeptids (iii), und
(e") Gewinnen des Zielpeptids (iii).

Schritt (a") umfasst das Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid sezerniert. Eine solche Zelle ist durch Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine Sequenz, die ein Fusionspolypeptid und eine die Sekretion induzierende Signalsequenz kodiert, insbesondere in Form eines Vektors, in die Zelle durch bekannte Verfahren wie Transfektion oder Transformation erhältlich. Im Schritt (b") wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, z. B. in einem für den jeweiligen Zelltyp allgemein gebräuchlichen Kulturmedium, kultiviert. Die Kultivierung findet unter Bedingungen statt, bei denen die Sekretion des Fusionspolypeptids stattfindet. Zum Beispiel kann ein induzierbarer Promotor, z. B. ein autoinduzierbarer, chemisch oder thermisch induzierbarer Promotor, verwendet werden, um die Sekretion des Fusionspolypeptids zu steuern.
In dieser Ausführungsform wird vorzugsweise ein Fusionspolypeptid mit einer Autoproteasedomäne (ii) verwendet, die unter den Sekretionsbedingungen im Kulturmedium konstitutionell inaktiv ist und erst bei einer spezifischen Anpassung der Umgebungsbedingungen aktiviert wird, beispielsweise durch Zugabe einer aktivierenden Substanz und/oder Anpassung des pH-Wertes aktiviert wird. Zum Beispiel kann die Aktivierung durch Einstellen eines sauren oder alkalischen pH-Werts wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Die Schritte (c") bis (e") können gemäß den Schritten (d) bis (f) der oben beschriebenen Ausführungsform erfolgen.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, kodierend ein die Domänen (i) und (ii) wie oben beschrieben umfassendes Fusionspolypeptid und eine Klonierungsstelle zum Einbau eines die Domäne (iii) wie oben beschrieben umfassenden Nukleinsäuremoleküls, das optional funktionsfähig mit einer Expressionssteuerungssequenz verknüpft ist. Dieses Nukleinsäuremolekül ist ein Ausgangsmaterial für die Herstellung eines beliebigen Zielpeptids, da ein Nukleinsäuremolekül, das ein solches Zielpeptid kodiert, durch Standardverfahren wie Restriktionsspaltung und anschließende Ligation einkloniert werden kann. Dieses Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls auf einem Vektor wie oben beschrieben, z. B. einem Plasmid, angeordnet sein.
Darüber hinaus sollte die vorliegende Erfindung vermittels der folgenden Beispiele in größerer Ausführlichkeit dargelegt sein.
Beispiel 1: Konstruktion von Fusionspolypeptid kodierenden Gensequenzen
Gensequenzen, die ein Fusionspolypeptid mit drei Abschnitten kodieren, wurden hergestellt. Der N-terminale Abschnitt besteht aus einer Reinigungsdomäne (i), der mittlere Abschnitt besteht aus einer N^pro-Autoproteasedomäne (ii), und der C-terminale Abschnitt besteht aus der Zielpeptiddomäne (iii). Die Domänen (i) und (ii) sind optional durch einen Linker miteinander verknüpft (SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4).
Humane α-Amylase (AMY1c; SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6), Glucoamylase 1 (GA1), abgeleitet aus Aspergillus niger (SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8), sowie die Kohlenhydrat-bindenden Einheiten CBM20 (SEQ ID NO: 9/SEQ ID NO: 10) und CBM26 wurden als Reinigungsdomäne verwendet.
N^pro (CSFV Alfort 187, SEQ ID NO: 11/SEQ ID NO: 12), sowie die N^pro-Mutante EDDIE (SEQ ID NO: 13/SEQ ID NO: 14) nach WO 2006/113957 wurden als Autoproteasedomäne verwendet.
Eine Methionin-35-oxidierte Form von Amyloid-β (1-42), ein heptameres Valin-Peptid (Val₇), ein hydrophobes IIe₁₃Thr₈-Peptid und das bekannte Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP) wurden als Zielpeptide verwendet.
Beispiel 2: Herstellung von Zielpeptiden
Die in Beispiel 1 beschriebenen Gensequenzen wurden in gentechnisch modifizierten Wirtszellen exprimiert.
In einem ersten Schritt wurde ein Vektor (z. B. der Vektor pet28a(+)), der die jeweilige Gensequenz enthält, in eine Wirtszelle, z. B. E.coli, BL21 DE 3, eingebracht. Die Gensequenz ist auf diesem Vektor unter der Steuerung des Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)-induzierbaren lac-Promotors angeordnet. Die den Vektor enthaltenden Zellen wurden, z. B. durch Ausplattieren auf Kanamycin-haltigen Agaroseplatten, selektiert. Kolonien auf dieser Platte wurden für die Expression verwendet.
Die Bakterienzellen wurden unter Standardbedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, z. B. LB-Medium, kultiviert, bis eine optische Dichte OD₆₀₀ von 0,6 erreicht wurde. Zu diesem Zweck erfolgte eine Induzierung der Genexpression bei 37°C während eines Zeitraums von 12 h durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration).
Nach der Expression wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit einem Lysepuffer (z. B. 2 mM MgCl₂, 5 mM EDTA, 75 mM NaOAc, 20 mM HEPES pH 7,3) gemischt und durch Schallbehandlung aufgeschlossen. Das Fusionspolypeptid wurde während der Expressionsphase in Form von Einschlusskörperchen (IBs) innerhalb der Zellen produziert und lag somit in einer unlöslichen und kristallinen Form innerhalb der Zellen vor. Dann wurden die IBs zur Weiterverarbeitung in einem Solubilisierungspuffer (z. B. 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinium-HCI, 20 mM HEPES, 50 mM Dithiothreitol pH 7,3) vorzugsweise unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert. Für die aus 1 I Kultur gewonnene Zellmasse wurden 10-30 ml Puffer verwendet.
Im Denaturierungspuffer ist die Autoproteasedomäne des Fusionspolypeptids inaktiv. Zur Überführung in die native Konformation und somit zur Reinigung und Aktivierung der Autoprotease wurde die Lösung der solubilisierten IBs zu einer Suspension eines Autoproteolysepuffers (z. B. 0,5 M Arginin, 100 mM HEPES, 10 mM Saccharose, 5 mM EDTA pH 7,3) und von Stärke, z. B. Maisstärke, zugesetzt. Andere Stärkequellen sind ebenfalls geeignet. Dabei wurde das Fusionsprotein vermittels seiner Reinigungsdomäne (Amylase, Glucoamylase oder Stärkebindungsdomäne) an die Stärke gebunden.
Dann wurde das Fusionsprotein in der Suspension aus Autoproteolysepuffer und Stärke während 10 min bei 37°C unter konstantem Bewegen inkubiert. Anschließend wurde die Suspension zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Zentrifugat wurde zwei- oder mehrmals in Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die jeweiligen Überstände wurden verworfen. Auf diese Weise wurden mögliche Verunreinigungen entfernt. Als nächster Schritt wurde das Zentrifugat in Autoproteolysepuffer resuspendiert und 60 min lang bei 8°C gelagert. Nach Resuspendieren und anschließender Zentrifugation wurde der Überstand in Alkohol gefällt und erneut zentrifugiert. Auf diese Weise wurde ein Zielpeptid erhalten, das lyophilisiert und damit lagerfähig gemacht werden kann.
Falls das Zielpeptid ein wasserunlösliches Peptid oder Protein (z. B. Amyloid-β-Peptid) ist, wurde die Stärke vor der Fällung in Alkohol in einem geeigneten Lösungsmittel (wie Hexafluorisopropanol, HFIP) re-extrahiert, zentrifugiert und anschließend gefällt.
Beispiel 3: Charakterisierung der Zielpeptide
Die Identität der in Beispiel 2 erhaltenen Zielpeptide wurde durch spektroskopische und spektrometrische Verfahren verifiziert.

1 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von Amyloid-β (1-42), das am Methioninrest 35 oxidiert war (+ 16 Da). Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser (1:1, 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)) gelöst und mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) als Matrix (10 mg/ml) im Verhältnis 1:50 cokristallisiert. Die Messung wurde bei 100 Hz mit 1000 Laserpulsen durchgeführt.
2 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von IIe₁₃Thr₈. Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser 1:1, 0,1% TFA gelöst und mit DHB als Matrix (10 mg/ml) im Verhältnis 1:50 cokristallisiert. Die Messung wurde bei 100 Hz mit 1000 Laserpulsen durchgeführt. Es wurden zwei Signale erfasst, die IIe₁₃Thr₈ (M/Z=2) und IIe₁₃Thr₈ + Na (M/Z=2) entsprachen.
3 zeigt ein Fluoreszenzemissionsspektrum von GFP bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer detektierten Emissionswellenlänge von 510 nm.

Beispiel 4: Herstellung von Zielpeptiden
Gensequenzen gemäß Beispiel 1, wobei es sich bei dem Zielpeptid um IIe₁₃Thr₈, Val₇, Melittin oder GFP handelte, wurden in Wirtszellen eingebracht, und Fusionspolypeptide wurden gemäß Beispiel 2 exprimiert.
Nach der Expression wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in Lysepuffer (z. B. 2 mM MgCl₂, 5 mM EDTA, 75 mM NaOAc, 20 mM HEPES pH 7,5) in einem Verhältnis von z. B. 1:10 (w/v) resuspendiert und durch Schallbehandlung aufgeschlossen. Während der Expressionsphase wurden die Fusionspolypeptide in Form von Einschlusskörperchen (IBs) innerhalb der Zellen produziert. Die IBs wurden zur Weiterverarbeitung in einem Solubilisierungspuffer (z. B. 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinium-HCI, 20 mM HEPES, 50 mM Dithiothreitol pH 7,5) vorzugsweise unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert, z. B. während 40 Minuten bei Raumtemperatur. Für die aus 1 I Kultur gewonnene Zellmasse wurden 10-30 ml Puffer verwendet.
Im Solubilisierungspuffer ist die Autoproteasedomäne des Fusionspolypeptids inaktiv. Zur Überführung in die native Konformation und somit zur Reinigung und Aktivierung der Autoprotease wurde die Lösung der solubilisierten IBs zu einer Suspension eines Autoproteolysepuffers (z. B. 5 M Arginin, 1,7 M HEPES, 1,6 mM Saccharose, pH 7,5) und von Stärke, z. B. Maisstärke, zugesetzt. Andere Stärkequellen sind ebenfalls geeignet. Dabei wurde das Fusionsprotein vermittels seiner Reinigungsdomäne (Amylase, Glucoamylase oder Stärkebindungsdomäne) an die Stärke gebunden.
Dann wurde das Fusionsprotein in der Suspension aus Autoproteolysepuffer und Stärke während 10 min bei 37°C unter konstantem Bewegen inkubiert. Anschließend wurde die Suspension zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Zentrifugat wurde zwei- oder mehrmals in Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die jeweiligen Überstände wurden verworfen. Auf diese Weise wurden mögliche Verunreinigungen entfernt. Als nächster Schritt wurde das Zentrifugat in Autoproteolysepuffer (1,2 ml Puffer pro 100 mg Zentrifugat) resuspendiert und 30 min lang bei 37°C unter konstantem Bewegen gelagert. Nach anschließender Zentrifugation wurde der Überstand in Alkohol, vorzugsweise Ethanol, gefällt und erneut zentrifugiert. Auf diese Weise wurde ein Zielpeptid erhalten, das lyophilisiert und damit lagerfähig gemacht werden kann.
Falls das Zielpeptid ein wasserunlösliches Peptid oder Protein (z. B. Amyloid-β-Peptid) ist, wurde die Stärke vor der Fällung in Alkohol in einem geeigneten Lösungsmittel (wie HFIP) re-extrahiert, zentrifugiert und anschließend gefällt.
Beispiel 5: Charakterisierung der Zielpeptide
Die Identität der in Beispiel 4 erhaltenen Zielpeptide wurde durch spektroskopische und spektrometrische Verfahren verifiziert.
4 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von IIe₁₃Thr₈. Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser 1:1, 0,1% TFA (100 µg/ml) gelöst und mit DHB als Matrix cokristallisiert. Die Messung wurde im positiven Reflektormodus durchgeführt. Zwei Signale wurden detektiert: m/z = 1148 (durchschn.) entsprechend IIe₁₃Thr₈ (M+2, H); und m/z = 1160 entsprechend IIe₁₃Thr₈ + (M+2, Na).
5 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von Val₇. Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser 1:1, 0.1% TFA (100 µg/ml) gelöst und mit DHB als Matrix cokristallisiert. Die Messung wurde im positiven Reflektormodus durchgeführt. Es wurde ein Signal detektiert: m/z = 712 (durchschn.) entsprechend Val₇ (M+1, H).
6 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von Melittin. Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser 1:1, 0,1% TFA (100 µg/ml) gelöst und mit DHB als Matrix cokristallisiert. Die Messung wurde im positiven Reflektormodus durchgeführt. Es wurde ein einziges Signal detektiert: m/z = 2843 (durchschn.) entsprechend Melittin (M+1, H).
7 zeigt ein UV-Spektrum von Melittin bei 286 nm (Tryptophan) nach der HPLC-Reinigung (Flussrate 2 ml/min, linearer Gradient 5-80% Puffer B während 20 min; Puffer A: Wasser, 0,1% TFA; Puffer B: Acetonitril/Wasser 80:20 + 0,1% TFA; Probenkonzentration 1 mg/ml)
8 zeigt ein Fluoreszenzemissionsspektrum von GFP (10 mg/ml) bei einer Anregungswellenlänge von 395 nm. Eine einzelne Emissionsbande war bei einer Wellenlänge von 509 nm nachweisbar.
9 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von Amyloid-β (1-42). Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser 1:1, 0,1% TFA (100 µg/ml) gelöst und mit DHB als Matrix cokristallisiert. Die Messung wurde im positiven Reflektormodus durchgeführt. Es wurde ein einziges Signal detektiert: m/z = 4512 (durchschn.) entsprechend Amyloid-β (1-42) (M+1, H).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2006/113957 [0004, 0021, 0047]
WO 2008/052387 [0006]

Claims

Fusionspolypeptid, umfassend in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus: (i) eine Reinigungsdomäne, (ii) eine Autoproteasedomäne und (iii) eine Zielpeptiddomäne, wobei die Reinigungsdomäne (i) an ein Oligo- oder Polysaccharid, insbesondere an Cellulose, Chitin und/oder Stärke bindet, und eine Glucoamylase und/oder eine Amylase ist, und wobei Autoproteasedomäne (ii) die CSFV-N^pro-Mutante EDDIE umfasst.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei die Autoproteasedomäne (ii) das Fusionspolypeptid nach dem C-Terminus der Autoprotease und vor dem N-Terminus des Zielpeptids (iii) spaltet.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zielpeptid (iii) eine Kettenlänge von (a) 2-1000 Aminosäuren, (b) 100-500 Aminosäuren oder (c) mehr als 500 Aminosäuren aufweist.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Zielpeptid (iii) einen Anteil an (a) hydrophoben Aminosäuren von ≥10%, bevorzugt ≥20%, stärker bevorzugt ≥30%, noch bevorzugter ≥40%, (b) hydrophilen Aminosäuren von ≥10%, bevorzugt ≥20%, stärker bevorzugt ≥30%, noch bevorzugter ≥40%, und/oder (c) eine Kombination aus (a) und (b) aufweist.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, kodierend ein Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, optional funktionsfähig verknüpft mit einer Expressionssteuerungssequenz und optional angeordnet auf einem Vektor, insbesondere einem Plasmid.
Gentechnisch modifizierte Zelle, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Zelle eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle, vorzugsweise eine prokaryotische Zelle, stärker bevorzugt eine E.coli-Zelle ist.
Gentechnisch modifizierte Zelle nach Anspruch 6, die ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1-4 exprimiert.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, kodierend ein die Domänen (i) und (ii) nach einem der Ansprüche 1-4 umfassendes Fusionspolypeptid und eine Klonierungsstelle zum Einbau eines die Domäne (iii) nach einem der Ansprüche 1-4 umfassenden Nukleinsäuremoleküls, das optional funktionsfähig mit einer Expressionssteuerungssequenz verknüpft und optional auf einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, angeordnet ist.