CN113917134A - 用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用。所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的TPX、CatB4或TPX+CatB4重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗TPX、CatB4或TPX+CatB4蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及TPX、CatB4或TPX+CatB4重组抗原包被的检测线。本发明的试纸条特异性强，稳定性好，操作简单，检测快速，只需5～10分钟即可读取结果，适合现场检测。

Description

用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及检测肝片形吸虫病抗体的试剂，尤其涉及用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，本发明属于寄生虫检测技术领域。
背景技术
肝片形吸虫(Fasciola hepatica)是肝片形吸虫病(Fascioliasis hepatica)的病原体。肝片形吸虫不但损害动物的肝脏、胆管，而且不断产生大量的能抑制宿主免疫细胞功能而有利于寄生虫逃避宿主免疫作用的有害物质。肝片形吸虫的感染会使动物出现贫血，繁殖能力、产奶能力、食物转化率和使役能力下降，肉和奶的品质降低等。超过6亿的动物受该病威胁，全球由于肝片形吸虫引起的动物生产过程中的损失保守估计每年超过32亿美元。肝片形吸虫被公认是影响动物生产经济非常严重的一种寄生虫。
目前肝片形吸虫病的诊断方法主要包括：粪便虫卵检查法，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测法，PCR检测法等方法。
粪便虫卵检查法是通过反复洗涤沉淀检查粪便中的虫卵。虽然这种方法的特异性较高，但灵敏性较差，漏诊率较高，且动物在染病后8～12周才能从粪便中检获虫卵，故不适合早期感染的检测。ELISA法是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，已发展了间接ELISA、双抗体夹心ELISA等，虽然其敏感性高，特异性好，适合大样本检测；并且最早可在感染2-4周后检测到，缩短了检测时间，但仍然需要专门的仪器(如酶标仪)，操作过程仍较复杂。PCR检测技术是通过提取粪便中肝片形吸虫虫卵的DNA，再通过PCR扩增特异性片段，来判断是否患病，该检测方法虽然灵敏度高，结果可靠，但测定方法繁琐、费时，效率低、成本高，需要有专门的检测设备，且不适用于早期诊断。
免疫层析技术是近年来发展起来的一种简易快速的免疫学检测技术，是以胶体金为标记物的快速免疫结合试验，抗原、抗体在NC膜上进行反应。该技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便、快速、结果直观、无须仪器设备等优点，操作人员不需要进行专业培训即可操作，减轻了劳动强度，具有广泛应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用。
为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条或其组合，所述的试纸条选自以下试纸条中的至少一种：
(1)一种用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的TPX重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗TPX蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及TPX重组抗原包被的检测线，样品垫提供了待测样品加入的位置；
(2)一种用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的CatB4重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗CatB4蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及CatB4重组抗原包被的检测线，样品垫提供了待测样品加入的位置；
(3)一种用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的TPX与CatB4重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗TPX以及CatB4蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及TPX与CatB4混合蛋白抗原包被的检测线，样品垫提供了待测样品加入的位置。
其中，优选的，(1)中所述的质控线分别是通过将兔抗TPX蛋白多克隆抗体以lmg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上、(2)(3)中所述的质控线是通过将兔抗CatB4蛋白多克隆抗体、兔抗TPX以及CatB4蛋白多克隆抗体分别以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；(1)(2)(3)中所述的检测线是分别通过将TPX、CatB4以及TPX与CatB4的混合蛋白以lmg/ml的浓度包被在在硝酸纤维素膜上得到的；检测线和质控线间隔0.5cm。
其中，优选的，(1)(2)(3)中将包被后的硝酸纤维素膜放置于37℃烘箱中烘干备用。
其中，优选的，(1)(2)(3)中所述的胶体金垫是通过以下方法制备得到：
(a)将所有玻璃器皿清洗干净，然后浸泡在洗液中24h；取出后用自来水冲洗8遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干后将玻璃容器浸泡于含有5％(w/v)的二氯二钾硅烷的氯仿溶液中lmin，然后用去离子水冲洗，再干燥备用；
其中，所述的洗液按照以下方法制备：重铬酸钾1000g，浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml，混匀；
(b)向步骤(a)处理后的玻璃器皿中加入0.01％(w/w)氯金酸溶液100mL，在磁力搅拌器上搅拌加热，迅速加入2.5mL 1％(w/w)柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸5-10min，溶液颜色逐渐由深蓝色转为橙红色，色泽鲜艳，停止煮沸，并回流至体积为100ml，然后用电镜镜检，制备的胶体金溶液的金颗粒大小一致，均匀，颗粒直径为20nm，4℃密闭避光保存备用；
(c)用0.2mol/L的K2CO3将步骤(b)的胶体金溶液的pH值调至pH8，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的TPX重组蛋白溶液逐滴加入至终浓度为18.75μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min，得到TPX金标抗原溶液；
用0.2mol/L的K2CO3将步骤(b)的胶体金溶液的pH值调至pH9，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的CatB4重组蛋白溶液逐滴加入至终浓度为37.5μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min，得到CatB4金标抗原溶液；
用0.2mol/L的K2CO3将步骤(b)的胶体金溶液的pH值调至pH9，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的TPX与CatB4的混合蛋白溶液逐滴加入至终浓度为37.5μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min，得到TPX+CatB4金标抗原溶液；
(d)将三种金标抗原溶液分别以4℃、2000r/min离心20min除去其中的胶体金聚合物，然后取上清，再以4℃，12000r/min离心50min，可见离心物分为3层，上清液含有尚未结合的重组蛋白，最下面的深黑色斑点即为尚未结合的胶体金颗粒聚合物，中间呈紫红色的絮状沉淀即为结合良好的金标抗原复合物；
(e)分别收集紫红色絮状沉淀，得到TPX金标抗原复合物、CatB4金标抗原复合物以及TPX+CatB4金标抗原复合物，分别用与步骤(d)第一次离心后取得上清的相同体积的含1％(w/w)BSA的0.01mol/L pH8、pH9、pH9 PBS悬浮，4℃避光保存备用；
(f)先将玻璃纤维膜分别浸泡在pH8、pH9、pH9含3％(w/w)BSA、0.1％(v/v)Tween-80的0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4℃过夜干燥备用；按每条玻璃纤维膜的大小为0.7cm宽×7cm长计算，将0.7ml TPX金标抗原复合物、CatB4金标抗原复合物以及TPX+CatB4金标抗原复合物分别均匀喷洒在玻璃纤维上，在室温下烘干。
其中，优选的，所述的TPX与CatB4的混合蛋白是TPX与CatB4按照1：1质量比混合得到的。
进一步的，本发明还提出了所述的免疫胶体金试纸条或其组合在制备检测肝片形吸虫病抗体试剂中的应用。
本发明的试纸条可以直接采取被检羊的血液分离血清作为检测样品，取80～100μL血清即可进行检验。
结果判断：阳性结果，质控线、检测线均呈现红色条带，说明有肝片形吸虫抗体存在。阴性结果，检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有肝片形吸虫抗体存在。如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，则说明产品失效。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明的检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，具有特异性强，与常见易感染的寄生虫抗体无反应；稳定性好，批次内和批次间制备的胶体金试纸条都有很好的检出效果。
2、本发明的免疫胶体金试纸条操作简单，无需有专门的检测设备、复杂的前期处理工艺，对技术人员无需特殊培训，无需特殊设备要求检测成本低。
3、本发明的免疫胶体金试纸条检测快速，只需5～10分钟即可读取结果，适合现场检测。
附图说明
图1为TPX和CatB4基因RT-PCR扩增结果；
M：DNA分子质量标准DL2 000；1：PCR扩增的TPX目的片段；2：PCR扩增的CatB4目的片段；
图2为肝片吸虫TPX基因序列比较；
图3为肝片吸虫CatB4基因序列比较；
图4为重组表达载体的酶切鉴定；
M：DNA分子质量标准DL15000；1：pCold I载体空质粒；2：pCold I-TPX双酶切产物；3：pET-32a载体空质粒；4：pET-32a-CatB4双酶切产物；
图5为胶体金免疫层析试纸条的组装；
图6为试纸条检测阴性结果(左)、阳性结果(右)；
图7为试纸条特异性检测；
A：TPX特异性检测；B：CatB4特异性检测；C：TPX+CatB4特异性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1TPX、CatB4蛋白抗原制备
1肝片吸虫TPX、CatB4基因的原核表达
1.1引物的设计与合成
根据GenBank发布的TPX(登录号：FJ168037.1)和CatB4(登录号：KM099340.1)基因序列设计两对特异性引物，在TPX引物的上下游加入Xho I、Sal I限制性酶切位点，在CatB4引物的上下游加入BamH I、Xho I限制性酶切位点。由吉林库美生物工程技术服务有限公司合成。引物序列设计如表1所示：
表1引物序列
Figure BDA0003216124990000061
1.2肝片吸虫总RNA的提取和反转录
按照RNA提取试剂盒说明书进行操作，完成后放-80℃保存。
提取的RNA按照反转录试剂盒说明书进行操作。完成后放-80℃保存。
1.3目的基因克隆
TPX、CatB4基因PCR反应体系如下表(表2、表3)，经琼脂糖凝胶电泳分析，可见657bp、765bp的特异性条带，如图1。PCR产物按胶回收试剂盒说明书进行操作。
表2TPX、CatB4基因PCR反应体系
Figure BDA0003216124990000062
表3PCR反应程序条件
Figure BDA0003216124990000063
Figure BDA0003216124990000071
1.4目的基因克隆载体的构建
按照表4体系，在16℃金属浴中过夜连接胶回收产物与pMD-18T载体。将连接产物转入DH5α感受态中，按照说明书操作。随后离心留少许上清，吹打均匀后取50μL涂在含氨苄抗性的固体培养基上，放入37℃培养箱中12-16h。随后挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。按说明书提取菌液质粒，将鉴定为阳性的质粒送测序，使用DNAMAN软件与参考序列比对分析，结果显示，TPX核苷酸的同源性为99.85％，仅存在1个变异位点，CatB4核苷酸的同源性为100％，如图2、3。将正确的质粒命名为pMD-18T-TPX、pMD-18T-CatB4。
表4目的基因连接体系
Figure BDA0003216124990000072
1.5目的基因表达载体的构建
将实验室保存的pCold I、pET-32a(+)、pMD-18T-TPX、pMD-18T-CatB4菌接种于含有氨苄抗性的LB培养基中，过夜摇菌提质粒，在37℃金属浴2h条件下，用限制性内切酶XhoI、Sal I对pMD-18T-TPX、pCold I进行双酶切，用限制性内切酶BamH I、Xho I对pMD-18T-CatB4、pET-32a(+)进行双酶切，反应体系如表5。酶切产物胶回收后，连接目的基因与表达载体，连接体系见表6。将连接产物转入BL21感受态中，涂板后过夜，挑菌、摇菌提质粒，经酶切鉴定正确后，将重组表达质粒命名为pColdI-TPX、pET-32a-CatB4，如图4，菌液于-80℃保存备用。
表5TPX、CatB4重组克隆载体和表达载体双酶切体系
Figure BDA0003216124990000073
Figure BDA0003216124990000081
表6TPX、CatB4目的片段与表达载体片段连接反应体系
Figure BDA0003216124990000082
1.6蛋白的表达及纯化
将重组大肠杆菌pColdI-TPX/BL21接种于液体培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，180r/m，37℃培养12h活化。将活化菌体按1:100的比例接种于液体培养基的三角瓶中(含氨苄青霉素50μg/mL)，180r/m，37℃培养，待培养至160min时加入IPTG至其终浓度为0.4mmol/L进行诱导，随后16℃继续培养960min时结束诱导表达。经SDS-PAGE电泳分析目的带表达后，对重组蛋白进行大量诱导表达，冰浴超声后取上清备用。使用Lysis Buffer平衡色谱柱，将回收的上清上柱，用Wash Buffer洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线，用Elution Buffer洗脱目的蛋白，速度约为1mL/min，流出液即为纯化后的目的蛋白，取少量加入SDS上样缓冲液，充分混匀，煮沸5分钟，以诱导后菌体为对照，在SDS-PAGE上进行电泳分析纯化结果。将蛋白放入复性缓冲液中进行透析，每6h更换透析液，重复三次，最后在PBS中透析12h，全程在4℃冰箱中操作，对透析后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定。
将重组大肠杆菌pET-32a-CatB4/BL21接种于液体培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，180r/m，37℃培养12h活化。将活化菌体按1:100的比例接种于液体培养基的三角瓶中(含氨苄青霉素50μg/mL)，180r/m，37℃培养，待培养至150min时加入IPTG至其终浓度为0.8mmol/L进行诱导，随后37℃继续培养360min时结束诱导表达。经SDS-PAGE电泳分析目的带表达后，对重组蛋白进行大量诱导表达，冰浴超声，取沉淀用Lysis buffer(含8M尿素)溶解后备用。蛋白纯化、透析步骤同上。
实施例2兔抗TPX、CatB4、TPX+CatB4蛋白多克隆抗体的制备
用实施例1纯化得到的TPX、CatB4蛋白抗原或TPX与CatB4按照1：1质量比混合的蛋白抗原(TPX+CatB4)和佐剂等量混合乳化，初次免疫用弗氏完全佐剂(CFA)乳化，每隔14天加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)乳化。接种方式选择在兔背部进行多点注射，免疫前和每次免疫后7d从耳缘静脉采血，ELISA检测抗体效价达到105以上时，进行心脏采血。所采血液37℃放置30min，4℃过夜，第二天4℃，3000r/min，离心15min，取上清即为多克隆抗体。多克隆抗体纯化时首先采用辛酸-饱和硫酸铵法对血清进行粗提。向lmL血清中加入2mL的乙酸缓冲液(0.06mol/L、pH5.0)，用盐酸调pH至4.5，在室温搅拌下在30分钟内逐滴加入75μg/L辛酸，4℃静置2小时，12000r/min离心30分钟，弃沉淀取上清，在上清中加入1/10体积的pH7.4、0.lmol/LPB、8.5％NaCl，并用lmol/L的NaOH调pH至7.4，在4℃冰浴下于30min内加入0.2779μg/ml的硫酸铵，使成45％饱和度，静置lh以上，然后4℃12000r/min离心30min，弃上清，沉淀溶于pH7.8 0.01mol/L PB中，对100倍的pH7.8、0.lmol/LPB于4℃透析过夜，直至用0.5mol/L氯化钡溶液检测不出SO4 2-。然后采用蛋白A亲和层析方法进一步纯化多抗，经测定抗体纯度达到95％。
实施例3免疫胶体金试纸的制备及应用
免疫胶体金试纸的制备：
1、采用柠檬酸钠还原法制备胶体金
(1)将所有玻璃器皿清洗干净，然后浸泡在洗液(重铬酸钾1000g，浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml)中48h。取出后用自来水冲洗10遍，蒸馏水冲洗10遍，烘干后将玻璃容器浸泡于5％(w/w)的二氯二钾硅烷的氯仿溶液中lmin，然后用去离子水冲洗，再干燥备用。
(2)加入0.01％(w/w)氯金酸溶液100mL，在磁力搅拌器上搅拌加热，迅速加入2.5mL 1％(w/w)柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸5-10min，溶液颜色逐渐由深蓝色转为橙红色，色泽鲜艳，停止煮沸，并回流至体积为100ml，然后用电镜镜检，制备的胶体金溶液的金颗粒大小一致，均匀，颗粒直径为20nm，4℃密闭避光保存备用；
(3)用0.2mol/L的K2CO3将胶体金溶液的pH值调至pH8，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的TPX重组蛋白逐滴加入至终浓度18.75μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min。
用0.2mol/L的K2CO3将胶体金溶液的pH值调至pH9，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的CatB4重组蛋白逐滴加入至终浓度37.5μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min。
用0.2mol/L的K2CO3将胶体金溶液的pH值调至pH9，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的TPX与CatB4按照1：1质量比混合的蛋白抗原(TPX+CatB4)逐滴加入至终浓度37.5μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min。
(4)将三种金标抗原溶液分别以4℃、2000r/min离心20min除去其中的胶体金聚合物，然后取上清，再以4℃，12000r/min离心50min，可见离心物分为3层，上清液含有尚未结合的抗原，最下面的深黑色斑点即为尚未结合的胶体金颗粒聚合物。中间呈紫红色的絮状沉淀即为结合良好的金标抗原复合物。
(5)收集紫红色絮状沉淀，得到TPX金标抗原复合物、CatB4金标抗原复合物以及TPX+CatB4金标抗原复合物，用与步骤(4)第一次离心后取得上清的相同体积的1％(w/w)BSA的0.01mmol/L pH8、pH9、pH9 PBS悬浮，4℃避光保存备用。
2、胶体金垫的制备
先将玻璃纤维膜分别浸泡在pH8、pH9、pH9含3％(w/w)BSA、0.1％(v/v)Tween-80的0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4℃过夜干燥备用；按每条玻璃纤维膜的大小为0.7cm宽×7cm长计算，将0.7ml TPX金标抗原复合物、CatB4金标抗原复合物以及TPX+CatB4金标抗原复合物均匀喷洒在玻璃纤维上，在室温下烘干。
3、硝酸纤维素膜的制备
将制备得到的TPX重组蛋白以lmg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上的检测线上，抗TPX蛋白多克隆抗体以lmg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上的质控线上，包被稀释液为0.01mol/L pH 8的PB，两条线间隔0.5cm，4℃干燥备用。
将制备得到的CatB4重组蛋白以lmg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上的检测线上，抗CatB4蛋白多克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上的质控线上，包被稀释液为0.01mol/L pH9的PB，两条线间隔0.5cm，4℃干燥备用。
将制备得到的TPX与CatB4按照1：1质量比混合的蛋白抗原(TPX+CatB4)以lmg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上的检测线上，抗TPX+CatB4蛋白多克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上的质控线上，包被稀释液为0.01mol/L pH 9的PB，两条线间隔0.5cm，4℃干燥备用。
4、试纸条的组装
如图5所示，将PVC做底板，上面一端依次粘有样品垫，胶体金垫，中间附硝酸纤维素膜，另一端粘附有吸水纸。其中胶体金垫上分别吸附着金标TPX、CatB4、TPX+CatB4抗原，硝酸纤维素膜上检测线分别包被有TPX、CatB4、TPX+CatB4抗原，质控线分别包被抗TPX、CatB4、TPX+CatB4蛋白多克隆抗体。将包被好的硝酸纤维素膜粘到PVC底板上，注意膜的下边缘与模具上的黑色标记线对齐，抹平膜面。将喷涂好金标抗原的胶体金垫紧靠标尺下边缘粘到PVC底板上，抹平。将样品垫紧靠模具下边缘粘到PVC底板上，抹平。将吸水纸紧靠模具上边缘粘到PVC底板上，抹平。用切条机切成4mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的包装袋内，备用。
5、试纸条使用及判定
5.1取少量绵羊血清，以pH7.2、0.lmol/L PBS溶解，接取80μL溶液上清作为样品进行检测。将所取液体滴到样品垫上，室温下作用5-10min。结果判断：阴性结果，检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有肝片形吸虫抗体存在。阳性结果，质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有肝片形吸虫抗体存在。如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，则说明产品失效，试纸条检测结果说明如图6所示。
5.2特异性试验
将华支睾吸虫阳性血清、捻转血矛线虫阳性血清、日本血吸虫阳性血清等常见的寄生虫阳性血清进行检测，结果表明，制备的3种试纸均与上述寄生虫无交叉反应，结果如图7所示。
5.3重复性试验
用肝片形吸虫阳性和阴性血清对同一批次和不同批次的试纸条重复检测3次，结果证实，不同批次制备的试纸条都能对肝片形吸虫抗体检出。
5.4符合度试验
对采自黑龙江省18个县(市)的261份绵羊血清样本用间接ELISA进行检测，检测结果如表7所示。采用本方法进行检测，检测结果如表8所示。TPX试纸条检测出来33份阳性血清，阳性率为12.64％(33/261)，与ELISA方法的符合率为84.62％，CatB4试纸条检测出来38份阳性血清，阳性率为14.56％(38/261)，与ELISA方法的符合率为90.48％，TPX+CatB4试纸条检测出来44份阳性血清，阳性率为16.86％(44/261)，与ELISA方法的符合率为89.8％，结果表明，本研究建立的免疫胶体金试纸条检测方法与间接ELISA检测方法二者具有较高一致性。
表7间接ELISA方法检测临床血清样本的检测结果
Figure BDA0003216124990000121
Figure BDA0003216124990000131
Figure BDA0003216124990000141
表8胶体金试纸条法检测临床血清样本的结果
Figure BDA0003216124990000142
Figure BDA0003216124990000151
Figure BDA0003216124990000161

Claims (6)

1.用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条或其组合，其特征在于，所述的试纸条选自以下试纸条中的至少一种：
(1)一种用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的TPX重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗TPX蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及TPX重组抗原包被的检测线，样品垫提供了待测样品加入的位置；
(2)一种用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的CatB4重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗CatB4蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及CatB4重组抗原包被的检测线，样品垫提供了待测样品加入的位置；
(3)一种用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的TPX与CatB4重组抗原的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗TPX以及CatB4蛋白多克隆抗体包被的质控线，以及TPX与CatB4混合蛋白抗原包被的检测线，样品垫提供了待测样品加入的位置。
2.如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条或其组合，其特征在于，(1)中所述的质控线是通过将兔抗TPX蛋白多克隆抗体以lmg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上、(2)(3)中所述的质控线是通过将兔抗CatB4蛋白多克隆抗体、兔抗TPX以及CatB4蛋白多克隆抗体分别以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；(1)(2)(3)中所述的检测线是分别通过将TPX、CatB4以及TPX与CatB4的混合蛋白以lmg/ml的浓度包被在在硝酸纤维素膜上得到的；检测线和质控线间隔0.5cm。
3.如权利要求2所述的免疫胶体金试纸条或其组合，其特征在于，(1)(2)(3)中将包被后的硝酸纤维素膜放置于37℃烘箱中烘干备用。
4.如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条或其组合，其特征在于，(1)(2)(3)中所述的胶体金垫是通过以下方法制备得到：
(a)将所有玻璃器皿清洗干净，然后浸泡在洗液中24h；取出后用自来水冲洗8遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干后将玻璃容器浸泡于含有5％(w/v)的二氯二钾硅烷的氯仿溶液中lmin，然后用去离子水冲洗，再干燥备用；
其中，所述的洗液按照以下方法制备：重铬酸钾1000g，浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml，混匀；
(b)向步骤(a)处理后的玻璃器皿中加入0.01％(w/w)氯金酸溶液100mL，在磁力搅拌器上搅拌加热，迅速加入2.5mL 1％(w/w)柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸5-10min，溶液颜色逐渐由深蓝色转为橙红色，色泽鲜艳，停止煮沸，并回流至体积为100ml，然后用电镜镜检，制备的胶体金溶液的金颗粒大小一致，均匀，颗粒直径为20nm，4℃密闭避光保存备用；
(c)用0.2mol/L的K2CO3将步骤(b)的胶体金溶液的pH值调至pH8，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的TPX重组蛋白溶液逐滴加入至终浓度为18.75μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min，得到TPX金标抗原溶液；
用0.2mol/L的K2CO3将步骤(b)的胶体金溶液的pH值调至pH9，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的CatB4重组蛋白溶液逐滴加入至终浓度为37.5μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min，得到CatB4金标抗原溶液；
用0.2mol/L的K2CO3将步骤(b)的胶体金溶液的pH值调至pH9，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，取纯化的TPX与CatB4的混合蛋白溶液逐滴加入至终浓度为37.5μg/mL，继续震荡30min，静置10min，加入BSA作为稳定剂，使其终浓度达到1％(w/w)，再缓慢震荡30min，得到TPX+CatB4金标抗原溶液；
(d)将三种金标抗原溶液分别以4℃、2000r/min离心20min除去其中的胶体金聚合物，然后取上清，再以4℃，12000r/min离心50min，可见离心物分为3层，上清液含有尚未结合的重组蛋白，最下面的深黑色斑点即为尚未结合的胶体金颗粒聚合物，中间呈紫红色的絮状沉淀即为结合良好的金标抗原复合物；
(e)分别收集紫红色絮状沉淀，得到TPX金标抗原复合物、CatB4金标抗原复合物以及TPX+CatB4金标抗原复合物，分别用与步骤(d)第一次离心后取得上清的相同体积的含1％(w/w)BSA的0.01mol/L pH8、pH9、pH9 PBS悬浮，4℃避光保存备用；
(f)先将玻璃纤维膜分别浸泡在pH8、pH9、pH9含3％(w/w)BSA、0.1％(v/v)Tween-80的0.02mol/L Tris-HCl溶液中30min，4℃过夜干燥备用；按每条玻璃纤维膜的大小为0.7cm宽×7cm长计算，将0.7mlTPX金标抗原复合物、CatB4金标抗原复合物以及TPX+CatB4金标抗原复合物分别均匀喷洒在玻璃纤维上，在室温下烘干。
5.如权利要求4所述的免疫胶体金试纸条或其组合，其特征在于，所述的TPX与CatB4的混合蛋白是TPX与CatB4按照1：1质量比混合得到的。
6.权利要求1-5任一项所述的免疫胶体金试纸条或其组合在制备检测肝片形吸虫病抗体试剂中的应用。
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