JPH08245699A

JPH08245699A - 緑膿菌膜タンパク質由来免疫原性ハイブリッドＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ

Info

Publication number: JPH08245699A
Application number: JP7329154A
Authority: JP
Inventors: Bernhard Dr Knapp; ベルンハルト、クナップ; Klaus-Dieter Dr Hungerer; クラウス‐ディーター、フンゲラー; Michael Dr Broeker; ミヒャエル、ブレッカー; Bernd Ulrich Von Specht; ベルント、ウルリッヒ、フォン、シュペヒト; Horst Dr Domdey; ホルスト、ドムデイ
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-18
Publication date: 1996-09-24
Anticipated expiration: 2015-12-18
Also published as: AU4041995A; US6300102B1; JP2005097321A; DE69515613T2; EP0717106B1; US5955090A; CA2165401A1; JP3762779B2; CA2165401C; EP0717106A1; DE69515613D1; KR960022559A; ATE190657T1; JP3712244B2

Abstract

(57)【要約】【課題】実験動物又はヒトへの緑膿菌の感染を防止す
ることができるハイブリッドタンパク質及びハイブリッ
ドタンパク質に対する抗体の提供。【解決手段】そのアミノ末端で緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外膜タンパク質Ｆ
（ＯｐｒＦ）のカルボキシ末端部のカルボキシ末端に融
合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩ）を含ん
でなるハイブリッドタンパク質、並びにこのハイブリッ
ドタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、アミノ末端で、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外膜タンパク質Ｆ（Ｏｐ
ｒＦ又はＯＭＰＦ）のカルボキシ末端部のカルボキシ末
端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩ又
はＯＭＰＩ）を含んでなるハイブリッドタンパク質、並
びにこのハイブリッドタンパク質のモノクローナル又は
ポリクローナル抗体に関する。ハイブリッドタンパク質
並びにハイブリッドタンパク質の抗体の両方は、実験動
物又はヒトへの緑膿菌の感染を防止することができる。

【０００２】背景技術緑膿菌は、日和見性グラム陰性病原体である。これは、
とりわけ熱傷並びに移植又は癌患者を含む他の免疫日和
見患者における院内感染の主要な経路である。したがっ
て、緑膿菌は、ヒト用薬剤における「問題微生物」とみ
なされている。いままで、緑膿菌に対するワクチンの開
発に多くの努力がなされてきた。例えば、ＥＰ−０２９
７２９１では、外膜タンパク質Ｆの完全アミノ酸配列だ
けでなく、ＯｐｒＦをコードするヌクレオチド配列も開
示されている。ＥＰ−０３５７０２４では、外膜タンパ
ク質Ｉの完全アミノ酸配列及びさらにはＯｐｒＩをコー
ドするヌクレオチド配列が示されている。さらに、上記
両方のタンパク質の場合、動物又はヒト発端者（ｐｒｏ
ｂａｎｄ）に対して、緑膿菌に対する免疫保護を付与す
るのに有用なことがあることが示された。しかしなが
ら、致死緑膿菌感染に対するワクチン法は、依然として
改良が必要とされている。

【０００３】

【発明の概要】驚くべきことに、本発明者等は、Ｏｐｒ
ＩがそのＮ末端においてＯｐｒＦのＣ末端部と連結して
いるハイブリッドタンパク質が、ＯｐｒＩ若しくはＯｐ
ｒＦを含んでなる融合タンパク質単独又は後者の融合タ
ンパク質の混合物よりも顕著に免疫原性があることを見
出した。即ち、本発明は、アミノ末端において、緑膿菌
外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端
に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハ
イブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ末端部
が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１６１番配列を含ん
でなるハイブリッドタンパク質に関する。好ましい実施
態様では、前記カルボキシ末端部の配列が配列番号４の
アミノ酸配列の１〜１５３番の配列である。

【０００４】さらに、本発明は、アミノ末端において、
緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキ
シ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んで
なるハイブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ
末端部がＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ３及びＳＥＥ４か
らなる群から選択された少なくとも一種の表面露出Ｂ細
胞エピトープを含んでなるハイブリッドタンパク質に関
する。これらのＢ細胞エピトープは、ＯｐｒＦの以下の
アミノ酸（ａａ）位置に位置している。ここで、ＳＥＥ
１はａａ２１２〜２４０、ＳＥＥ２はａａ２４３〜２５
６、ＳＥＥ３はａａ２８５〜２９８及びＳＥＥ４はａａ
３３２〜３５０である（アミノ酸の位置は実施例１及び
Ｈｕｇｈｅｓ等（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．６０、第３４９７〜３５０３頁参照）。本発明の別
の実施態様では、上記ハイブリッドタンパク質の少なく
とも一つを含んでなるワクチンが提供される。

【０００５】さらに、本発明は、上記ハイブリッドタン
パク質の一つ以上のモノクロ−ナル又はポリクロ−ナル
抗体に関する。これらの抗体は、緑膿菌による感染に対
する受動的防御を被験者に付与するためにワクチンに使
用することもできる。本発明のさらなる態様によれば、
上記ハイブリッドタンパク質をコードする核酸が提供さ
れる。さらに、本発明は、原核細胞又は真核細胞におい
て本発明に係るハイブリッドタンパク質をコードしてい
る上記核酸を発現させることを含んでなる上記ハイブリ
ッドタンパク質の製造法に関する。

【０００６】

【発明の具体的説明】本発明を、以下より詳細に説明す
る。以下では、微生物源及びＤＮＡ源だけでなく以下の
実施例で使用した方法及び例えば本発明を実施するのに
有用とみなされる方法も示す。

【０００７】アミノ酸配列等ＯｐｒＦのカルボキシ末端部のアミノ酸配列は配列番号
４に記載されている。上記ＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ
３及びＳＥＥ４は、それぞれ、配列番号４のアミノ酸配
列の２３〜５１番、５４〜６７番、９６〜１０９番、及
び１５３〜１６１番の各配列に対応する。また、後記す
るＤ１（ａａ１９０〜２１３）は、配列番号４のアミノ
酸配列の１〜２４番の配列に対応する。更にこれらアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号３に記載され
ている。また、シグナル配列を含まないＯｐｒＩをコー
ドする塩基配列及びそのアミノ酸配列は配列番号１及び
２に記載されている。

【０００８】微生物緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌＡｎｔｉｇｅｎｉｃＴｙｐｉｎｇＳｃ
ｈｅｍｅセログループＩ（ＡＴＣＣ３３３４８）を、
Ａ．Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ、Ｍａｘ．ｖｏｎＰｅｔ
ｔｅｎｋｏｆｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、ミュンヘン大学
から入手した。バクテリアは、Ｆｉｎｋｅ，Ｍ．等（１
９９０），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８、第２２
４１〜２２４４頁に記載されているようにして成長させ
且つ調製した。組換え体タンパク質の発現については、
大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０ｌａｃｌ^ＱＬ８を使用し
た。酵母におけるＯＰＲの発現については、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＨＴ３９３
（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｐｒａ１，ｐｒｂ１，ｐｒｃ
１，ｐｒｅ１，ｃｐｓ１）を使用した。

【０００９】ＤＮＡ源ＤＮＡ源として３種の組換えプラスミドを使用した。ｐＦＳａｕｌ：アミノ酸位置５７〜３５０のタンパク質
のＣ末端をコードしている緑膿菌外膜タンパク質Ｆ遺伝
子の１．０ｋｂＳａｕ３Ａｌ断片を含んでいるｐＵ
Ｃ１９由来のプラスミド（Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｍ．等（１
９８８）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０、第１５５
〜１６２頁）。ｐｌＴａｑ１：完全ＯｐｒＩ遺伝子を有する６２６ｂｐ
Ｔａｑｌ断片を含むｐＵＣ１９由来プラスミド（Ｄｕｃ
ｈｅｎｅ，Ｍ．等（１９８９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７１、第４１３０〜４１３７頁）。ｐＧＥＸ−２ａ：ベクターｐＴＲＣから得たポリリンカ
ーを導入することにより変更したベクターｐＧＥＸ−２
Ｔ由来の発現ベクター。ベクターｐＧＥＸ−２ａはｔａｃプロモーターを含み、
その後に２６ｋＤａ日本住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓ
ｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍ）グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ、トロンビンの開裂部位及びｐＴＲＣ特
異的ポリリンカー領域が続いている。

【００１０】合成ペプチドに対して誘発した抗血清の特
徴付けＯｐｒＦから得たアミノ酸領域１９０〜２１３（Ｄ
１）、２１２〜２４０（Ｄ２、ＳＥＥ１）、２３９〜２
５０（Ｄ３）、２８４〜３１６（Ｄ４）及び３３２〜３
５０（Ｄ５、ＳＥＥ４）を表す合成ペプチドを、Ｒｏｕ
ｓｓｉｌｈｏｎ，Ｃ．Ｅ．等（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．２５、第１４９〜１５４頁に記載のよう
にして合成した。ウサギを、リンパ節付近の異なる８箇
所に、完全フロイントアジュバントにＫＬＨ複合ペプチ
ド２００μｇを添加したもので皮下免疫し、２週間後、
不完全フロイントアジュバントに複合体４００μｇを添
加したもので再免疫した。これらの動物に、最初の免疫
から６週間後及び９週間後の２回、複合体１５０μｇ及
び１００μｇを静脈内にブースター注射した。ペプチド
に対する抗体価を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．５（ＰＢＳ）にペプチドを１ｍｌあたり５ｎｇ
添加した溶液を室温で一晩塗布したプレートについて、
ＥＬＩＳＡにより測定した。プレートを、０．０５Ｍク
エン酸及び０．０５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４で３回洗
浄した後、シリカゲルで３日間乾燥した。ウサギ血清を
１：１６０に希釈し、大腸菌タンパク質で飽和した。組
換えＧＳＴ融合タンパク質を用いたウエスタンブロッテ
ィング解析及び完全な緑膿菌セログループ１１（ＡＴＣ
Ｃ３３３５８）に対する免疫螢光測定を、Ｊｏｈｎｓｏ
ｎ，Ｄ．Ａ．ら（１９８４）ＧｅｎｅＡｎａｌ．Ｔｅ
ｃｈｎ．１、第３〜８頁およびＳｃｈｎｏｒｒ，Ｊ．
Ｂ．ら（１９９１）、Ｖａｃｃｉｎｅ９、第６７５〜６
８１頁に報告されている方法により実施した。

【００１１】グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融
合タンパク質としてのＯｐｒＦ及びＯｐｒＩの発現ＯｐｒＦ遺伝子の塩基５６８〜５９４番に相当する５´
端にＳａｃｌ制限部位を有するオリゴヌクレオチドｐ１
（５´−ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＧＧ
ＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＴＧＣＣＧＡ
Ｃ−３´）及びＯｐｒＦ遺伝子の塩基１０２８〜１０５
３番に相補的な５´端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有す
るｐ２（５´−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＧ
ＧＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧ
−３´）並びにプラスミドｐＦＳａｕｌ１０ｎｇを用い
て、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＧｅｎ−
ＡｍｐＫｉｔによりポリメラーゼ連鎖反応を行って５
００ｂｐ断片を得た。増幅断片をＳａｃＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、ベクターｐＧＥＸ−２ａに導入して、
アミノ酸１９０〜３５０のポリンＯｐｒＦのＣ末端をコ
ードするプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦを得た。Ｏｐｒ
Ｉ遺伝子のコード領域の塩基６１〜８７に相当する５´
端のＮｃｏｌ制限部位を有するｐ３（５´−ＣＧＴＡ
ＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣ
ＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＣＴ−３´）及び
ＯｐｒＩ遺伝子のコード領域の塩基２３１〜２５５に相
補の５´端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するｐ４（５
´−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＴ
ＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣ−３
´）並びにプラスミドＤＮＡｐｌＴａｑ１１０ｎｇ
をポリメラーゼ連鎖反応に使用して２１５ｂｐ断片を増
幅した後、制限酵素Ｎｃｏｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理
して、発現ベクターｐＧＥＸ−２ａの対応部位に導入し
て、ＯｐｒＩのアミノ酸２１〜８３をコードしているプ
ラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＩを得た。

【００１２】ＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ−及びＧＳＴ
−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブッリド遺伝子の構築オリゴヌクレオチドｐ１（上記参照）及びｐ５（５´−
ＴＴＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＧＴＴＧＡＴＡ
ＧＣＧＣＧ−３´）（ＯｐｒＦ遺伝子の塩基１００３
〜１０２６に相補）並びにプラスミドｐＦＳａｕ１１
０ｎｇを使用して４７０ｂｐＯｐｒＦ断片を増幅した。
第２ポリメラーゼ連鎖反応を、プラスミドｐｌＴａｑ１
１０ｎｇ並びにオリゴヌクレオチドｐ４（上記参照）
及びｐ６（５´−ＧＡＡＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡ
ＴＣＡＡＣＣＧＴＣＧＣＧＴＴＧＡＡＡＧＣ
ＡＧＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧ
ＡＡＧＣＴ−３´）（上記ヌクレオチドの１〜３０番
はＯｐｒＦ遺伝子の塩基９９７〜１０２６に相当し、上
記ヌクレオチドの３１〜５７番はＯｐｒＩコード領域の
塩基６１〜８７に相当する）を用いて実施した。これに
より、２４０ｂｐ断片が得られた。

【００１３】得られたＤＮＡ断片並びにオリゴヌクレオ
チドｐ１及びｐ４の両方１５０ｎｇを用いて、Ｈｏｒｔ
ｏｎ，Ｒ．Ｍ．等（１９８９）、Ｇｅｎｅ７７、第６
１〜６８頁に記載されているような第三ポリメラーゼ連
鎖反応を行った。得られた６６０ｂｐ断片を、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
ベクターｐＧＥＸ−２ａに導入して、ＯｐｒＦのアミノ
酸１９０〜３４２及びＯｐｒＩのアミノ酸２１〜８３を
コードしているプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒ
Ｉを得た。オリゴヌクレオチドｐ３及びＯｐｒＩ遺伝子
から得たコード領域の塩基２２３〜２４９に相補の５´
端にＳａｃＩ制限部位を有するｐ７（５´−ＡＡＡＧ
ＡＧＣＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＴ
ＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧ−３´）及びプラスミ
ドｐｌＴａｑ１１０ｎｇを使用して２１０ｂｐ断片を
増幅し、それを制限酵素ＮｃｏＩ及びＳＡｃＩを用いて
ベクターｐＧＥＸ２ａに導入した。得られたプラスミド
を酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、対応の
酵素を用いて、プラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦの消化に
より得た４９０ｂｐ断片を導入した。プラスミドｐＧＥ
Ｘ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦは、ＯｐｒＩから得たアミノ酸
２１〜８３及びＯｐｒＦから得たアミノ酸１９０〜３５
０をコードしており、これらはＳａｃＩクローニング部
位に導入された２アミノ酸リンカーにより分離されてい
る。

【００１４】大腸菌における組換えタンパク質の発現及
び精製４種のプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ、ｐＧＥＸ−Ｏｐ
ｒｌ、ｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒｌ及びｐＧＥＸ−Ｏ
ｐｒｌ−ＯｐｒＦを用いて、大腸菌Ｋ−１２株Ｗ３１１
０ｌａｃＩ^ＱＬ８を形質転換した。大規模抗原産生のた
めに、プラスミドを入れた５リットルバクテリア培養を
ＯＤ_６６０＝１まで成長させ、緑膿菌特異的組換え抗原
の発現を、イソプロピルチオガラクトシドにより誘発さ
せた。細胞の分裂後、４種の異なるグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ融合タンパク質が水溶液に溶解する
ことが分かった。したがって、４種の融合タンパク質
を、非変性条件下で粗バクテリア溶解産物からアフィニ
ティークロマトグラフィーにより純度約８０％に精製で
きた。

【００１５】活性免疫及び保護実験４グループ（Ａ〜Ｄ）の６８匹雌ＢＡＬＢ／ｃマウス
（１０〜１２週齢）の各々に、抗原：ＧＳＴ（Ａ）、Ｇ
ＳＴ−ＯｐｒＦ＋ＧＳＴ−ＯｐｒＩ（Ｂ）、ＧＳＴ−Ｏ
ｐｒＦ−ＯｐｒＩ（Ｃ）又はＧＳＴ−ＯｐｒＩ−Ｏｐｒ
Ｆ（Ｄ）１００μｇをアジュバント“ＡＢＭ２ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ”（Ｓｅｂａｋ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ）１０
０μｌに懸濁したものを０日目に投与した。等量の抗原
をＡｌ（ＯＨ）_３１００μｌに懸濁したものを、１４
日目、２８日目及び４２日目にブースター注射した。４
９日目に、尾部静脈から放血して血清を採取し、各グル
ープからのマウス７〜１０匹のプール血清における抗体
価を測定した。４日後、全ての動物に、免疫抑制処理を
施した。免疫抑制のために、マウスに、体重１ｇ当たり
シクロホスファミド（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ国ハイデル
ベルグ）１５０μｇをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
０．２５ｍｌを添加したものを、５３日目、５５日目、
５７日目の３回注射した。５８日目に、各抗原グループ
を、４つのサブグル−プＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ（各
サブグル−プに１６〜１７匹の動物）に分けた。グルー
プＡ〜Ｄのマウスには、腹腔内に、５×１０^１（サブグ
ル−プＩ）、５×１０^２（サブグル−プＩＩ），５×１
０^３（サブグル−プＩＩＩ）又は５×１０^４（サブグル
−プＩＶ）ＣＦＵの緑膿菌セログループ１を投与した。
１５匹のさらなる非免疫マウスに、バクテリア抗原投与
なしで免疫抑制のみを行った。この対照グループを使用
して、白血球減少症の状態の確認及び非特異的感染の排
除を行った。全ての生存動物を、感染後１０日間監視し
た。

【００１６】酵母における組換えＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの
発現及び精製Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける緑膿菌外膜タンパク
質の発現のために、酵母／大腸菌シャトルベクターｐＹ
ｅｐｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，Ｃ．等（１９８７）Ｅ
ＭＢＯ．Ｊ．６、第２２９〜２３４頁）を使用した。こ
のプラスミドは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃ
ｔｉｓキラートキシンのシグナル配列に融合したポリペ
プチドを発現する。ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタ
ンパク質をコードするｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩか
ら得たＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を分離し、ｐＹｅ
ｐｓｅｃ１にクローニングし、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断した（ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ−ｌが得られ
る）。ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を、結さつ前にクレ
ノー酵素により平滑末端とし、一方、ＨｉｎｄＩＩＩ部
位は処理しなかった。酵母中で発現させた可溶性Ｏｐｒ
Ｆ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質を、エピトープＤ
１に対するモノクローナル抗体を用いてアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製した。ＭＡｂを、製造業
者の教示にしたがってＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ドイツ国フライブルグ）に連
結した。ＰＢＳに添加した酵母エキスをカラムにロード
し、非特異的結合物質を０．５ＭＮａＣｌを含む０．１
ＭグリシンｐＨ９．０緩衝液で溶出させた。ＯｐｒＩ−
ＯｐｒＦハイブリッドタンパク質の溶出を、０．１Ｍグ
リシン緩衝液ｐＨ１１．０で実施した。カラムを、０．
１ＭグリシンンｐＨ２．５で洗浄後ＰＢＳで洗浄するこ
とにより再生した。

【００１７】特異的免疫グロブリンの産生及び受動免疫ウサギを、０日目、１４日目及び２８日目に、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ細胞抽出物から分離した精製組換えＯ
ｐｒＦ−ＯｐｒＩ（又は対照としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ単独からの細胞抽出物）１００μｇを不完全フロ
イントアジュバントに乳化したもので３回免疫した。３
８日目に、血液試料を得て、４℃で一晩凝固させた。血
清を除去し、遠心分離し、−２０℃で保存した。３０匹
の雌ＳＣＩＤマウス（１８〜２０ｇ、Ｂｏｍｈｏｌｔｇ
ａｒｄ社、デンマーク）のグループでは、このグループ
の全ての動物に、ウサギ抗ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ血清０．
５ｍｌ又はウサギ抗酵母血清０．５ｍｌを投与した。さ
らなる対照として、一グループの動物に、通常生理食塩
溶液０．５ｍｌを投与した。さらなる一グループの動物
に、緑膿菌のセログループ１の熱不活性化細胞に対する
ウサギ血清０．５ｍｌを注射した。３時間後、グループ
１〜６の動物を、５つのサブグル−プ（ａ〜ｅ）に分割
し、緑膿菌セログループＩ懸濁液（ムチンにそれぞれ１
０^１，１０^２，１０^３，１０^４，１０^５ＣＦＵ／ｍｌ懸
濁）を投与した。生存動物を、１週間観察した。ムチン
（Ｓｉｇｍａ社、ドイツ国Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）５
ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁し、ＵｌｔｒａＴｕｒｒ
ａｘブレンダーで１０分間処理し、ふるいを通過させ、
１２０℃で１５分間オートクレーブ処理した。使用直前
に、溶液を無菌１ＮＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に
調整した。

【００１８】

【実施例】実施例１ＯｐｒＦのエピトープマッピングＯｐｒを主成分とする緑膿菌ワクチンの合理的選択基準
としてＢ細胞エピトープを表すＯｐｒＦのアミノ酸配列
部を同定するために、ＯｐｒＦのアミノ酸５８〜３５０
を表す組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体を
調製した。ＭＡｂｓの結合を、大腸菌において発現した
ＯｐｒＦの一連の組換えサブ断片を用いて分析した。Ｍ
Ａｂｓは、次の５つの異なる領域を識別した：ａａ１９
０〜２１３（Ｄ１）、ａａ２１２〜２４０（Ｄ２、ＳＥ
Ｅ１）、ａａ２３９〜２５０（Ｄ３）、ａａ２８４〜３
１６（Ｄ４）及びａａ３３２〜３５０（Ｄ５、ＳＥＥ
４）。したがって、ａａ１９０とａａ３５０との間のＯ
ｐｒＦのＣ末端部は、ＯｐｒＦのＢ細胞エピトープのほ
とんどをカバーしていると思われた。エピトープをさら
に分析するために、上記で定義したアミノ酸部に関連し
た合成ペプチドを調製し、ＫＬＨに複合化した。これら
のペプチドに対するポリクローナル抗血清を、ウサギに
おいて生じさせた。結果は表１に示される通りであっ
た。

【００１９】

【表１】

【００２０】表１は、ペプチドＤ１〜Ｄ５が対応のポリ
クローナル抗血清により認識されたことを示している。
ペプチドＤ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５はモノクローナル抗
体と反応し、ペプチドＤ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５も、組
換えＯｐｒＦに対して生じさせたポリクローナル抗体に
より認識され、したがって、これらの５エピトープはＢ
細胞由来であることが確認された。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５
に対して生じさせた抗血清はウエスタンブロット分析に
おいてＯｐｒＦを認識したが、生存緑膿菌細胞は、Ｄ２
及びＤ５に対して生じさせた抗血清とともにインキュベ
ーションした後のみに陽性蛍光を示した。したがって、
これらの２種のエピトープは、表面露出していると思わ
れる。

【００２１】合成ペプチドのいずれとも反応しなかった
がＧＳＴ−ＯｐｒＦ及びさらには組換えサブ断片を認識
して２つの追加のエピトープＤ６及びＤ７を生じるさら
なるＭＡｂｓが確認された。これらのエピトープＤ６及
びＤ７は、それぞれアミノ酸残基２４０〜３１６及び１
９０〜２５０に相当する。したがって、ＯｐｒＦのアミ
ノ酸１９０〜アミノ酸３５０の領域は重要な抗原領域を
含むと考えられ、本発明者等は、これらのエピトープを
担持する組換えタンパク質が動物モデルにおける保護を
付与することができるかどうかを確認することにした。

【００２２】実施例２ＯｐｒＩのエピトープマッピン
グ未変性ＯｐｒＩに対して生じさせたＭＡｂｓ２Ａ１、
６Ａ４及び５Ｂ４を用いて、緑膿菌感染に対して防御能
を示し、Ｎ末端に位置したエピトープを認識した二種の
異なるエピトープを特徴付けした（Ｆｉｎｋｅ，Ｍ．等
（１９９１）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９、第１
２５１〜１２５４頁）。続いて行った研究によって、も
しアミノ酸２１〜アミノ酸８３のアミノ酸配列全体が発
現されるならば、２Ａ１のみが結合することが分かっ
た。したがって、サブユニットワクチンの手段として組
換えＯｐｒＩ抗原を構築するために、完全なアミノ酸領
域２１〜８３が最も適当な抗原であると考えられた。

【００２３】実施例３大腸菌におけるＯｐｒの発現緑膿菌感染に対するワクチンにおける緑膿菌の単一外膜
タンパク質の効力は、２種の異なるＯｐｒの融合エピト
ープの共発現により向上する可能性がある。４種の異な
るグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク
質を、大腸菌中で大量に発現させた：ＧＳＴ−ＯｐｒＦ
_{（ａａ１９０−３５０）}、ＧＳＴ−ＯｐｒＩ
_{（ａａ２１−８３）}、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ
_{（ａａ１９０−３４２）}−ＯｐｒＩ_{（ａａ２１−８３）}
及びＧＳＴ−ＯｐｒＩ_{（ａａ２１−８３）}−ＯｐｒＦ
_（ａａ _{１９０−３５０）}（図１）。組換えタンパク質
を、免疫グルタチオンを用いたアフィニティークロマト
グラフィーにより約８０％に精製できた。ＯｐｒＩ特異
的ＭＡｂ６Ａ４及び２Ａ１並びにエピトープＤ１、Ｄ
２、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ５、Ｄ６及びＤ７に対する異なるＯ
ｐｒＦ特異的ＭＡｂを有する４種の組換え生成物をウエ
スタンブロット解析したところ、ＭＡｂ特異的エピトー
プが組換え融合タンパク質により発現されたことが分か
った。

【００２４】実施例４大腸菌由来融合タンパク質によ
る活性免疫マウスを、２週間間隔で４回、組換えＧＳＴ結合融合タ
ンパク質又はＧＳＴのみをアジュバント“ＡＢＭｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ”に懸濁したもので免疫した。マウス８〜
１０匹のプール血清からの各抗体価を、ＥＬＩＳＡだけ
でなく、緑膿菌に対する結合活性用ウエスタンブロッテ
ィング及びペプチドＤ１〜Ｄ５に対するＥＬＩＳＡによ
り分析した。

【００２５】図２は、緑膿菌に対する特異的抗体価が、
全ての免疫グループにおいて、血清希釈１：１５６２５
以下で得られたことを示している。緑膿菌ポリペプチド
を用いた血清のウエスタンブロット分析により、全ての
免疫グループ由来の血清によるＯｐｒＩ並びにＯｐｒＦ
の特異的染色が示された。ＧＳＴ免疫対照グループで
は、ＯｐｒＩ又はＯｐｒＦの染色は観察されなかった。
ペプチドＤ１〜Ｄ５に対する血清のさらなる分析（図
３）から、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒｌで免疫された動
物だけでなくＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦで免疫された
動物でも、ペプチドＤ５及びＤ４が優勢であった。外膜
融合タンパク質に対して誘発した抗体が緑膿菌感染から
マウスを保護できるかどうかを試験するために、マウス
に、免疫抑制用シクロホスファミドを３回投与した。非
免疫対照動物１５匹の末梢血試料において測定した白血
球数は、平均レベル４００／μｌ未満に低下した。１日
後、動物に、５×１０^１、５×１０^２、５×１０^３又は
５×１０^４ＣＦＵの緑膿菌セログループ１を抗原投与し
た。動物の生存を、１週間記録した。図４及び表２に、
４種の異なる抗原投与後の動物の生存率と、プロビット
回帰分析により算出した各ワクチンについてのＬＤ_５０
値とを示した。

【００２６】

【表２】

【００２７】ＧＳＴのみ又はＧＳＴ−ＯｐｒＩ−Ｏｐｒ
Ｆで免疫したグループについては、ＬＤ_５０計算値は
１．５８及び２．６５と低かった。ＧＳＴ−ＯｐｒＩと
ＧＳＴ−ＯｐｒＦとの混合物の同時ワクチン接種では、
ＬＤ_５０値が８３．３ＣＦＵに増加した。しかしなが
ら、この差は、統計的に有意ではないことが分かった。
これに対して、ハイブリッドＧＳＴ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒ
Ｉのワクチン接種後では、ＬＤ_５０の計算値が、１５４
０ＣＦＵの方向に大きくシフトした（ｐ≦０．００
１）。ＧＳＴ免疫対照と比較して、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−
ＯｐｒＩグループについて計算された防御値は９６２で
あった。これらの結果は、同一に計画した二回目の実験
で確認された（ｐ≦０．００１）。

【００２８】比例リスクモデルによるデータの解析と、
異種のワクチン製剤によりリスク比の減少計算値を、上
記表２に示した。ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩのワクチ
ン接種により、リスク比が、ＧＳＴ免疫対照と比較し
て、０．３まで非常に有意（ｐ≦０．０００１）に減少
した。抗原投与量が５×１０^３ＣＦＵの場合でさえ、Ｇ
ＳＴ、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ＋ＧＳＴ−ＯｐｒＩ、ＧＳＴ−
ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ免疫グループ並びに投与１及び２
（５×１０^１及び５×１０^２）に対して、リスク比が
０．６９に有意（ｐ≦０．００１９）に減少した。

【００２９】実施例５酵母におけるＯｐｒＦ−Ｏｐｒ
Ｉの発現追加の融合成分のないＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッド
タンパク質の発現については、代替宿主としてＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを選択し、
プラスミドとしてｐＹｅｐｓｅｃ１を選択する。ｐＹｅ
ｐｓｅｃ１−Ｆ−Ｉ（図１）に含有されているＯｐｒＦ
−ＯｐｒＩは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは少量でし
か発現されなかった。ＯｐｒＩだけでなくＯｐｒＦもペ
リプラズム空間を介してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅ
ａｅにおいて移出されたので、本発明者等は、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅにおける移出を真似することを試み
た。このために、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタン
パク質を、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔ
ｉｓのキラートキシン（ｋｔ）の分泌シグナル配列に融
合させた。ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ−Ｉ（図１）によりコ
ードされているトリパータイトハイブリッドタンパク質
ｋｔ．ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、ここでは以下のポリペプ
チドストレッチから構成されている：まず酵母分泌シグ
ナル配列の１６アミノ酸があり、続いてＤＮＡリンカー
によりコードされた９アミノ酸があり、その後アミノ酸
１９０〜３４２のＯｐｒＦ特異的ポリペプチドストレッ
チ及びアミノ酸２１〜８３を含むＯｐｒＩペプチドが続
いている。ＯｐｒＦ特異的ポリペプチドは、可能なグリ
コシル化部位アスパラギン−Ｘ−トレオニン（表１参
照）を２回担持している。これらのグリコシル化部位
は、もし融合タンパク質が分泌経路に入ったならば認識
可能でなければならない。キラートキシンリーダー配列
へ融合すると、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、ＵＡＳ_ＧＡＬ／
ＣＹＣ１プロモーターの誘発条件下で発現したとき、酵
母細胞抽出物においてウエスタンブロット解析により検
出されたが、培養ブロスには、分泌抗原は検出されなか
った。

【００３０】酵母において発現したＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ
融合タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにお
いて鮮明なバンドとして移動しなかったが、不均一な分
布を示し、いくつかのスミアバンドに現れた。このこと
は、Ｎ−グリコシル化による翻訳後変更を示している。
組換え緑膿菌抗原をエンドグリコシダーゼＦとともにイ
ンキュベーションするとより低分子量の鮮明なバンドが
現れ、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩがキラートキシンリーダー配
列に融合したときに分泌経路に入ったことと、２つのグ
リコシル化可能性部位のうちの少なくとも一つがグリコ
シル化されたことを示している。

【００３１】実施例６酵母由来ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの
抗体による受動的免疫組換えシュードモナス抗原を、酵母細胞抽出物の上清か
ら、エピトープＤ１に対する抗ＯｐｒＦマウスモノクロ
ーナル抗体を用いて、アンモニウム塩析出及びイムノア
フィニティークロマトグラフィーにより濃縮した。次
に、ウサギを、抗原で３回免疫し、動物から血清を採取
した。免疫前血清は緑膿菌ＯｐｒＦ又はＯｐｒＩのいず
れとも反応性を示さなかったが、免疫ウサギから得た血
清は、緑膿菌の３種の異なるＡＴＣＣ菌株から得た外膜
タンパク質ＯｐｒＦ及びＯｐｒＩと特異的に反応しただ
けでなく、試験した緑膿菌の３種の異なる臨床分離物と
も特異的に反応した。これらの血清の防御能を、ＳＣＩ
Ｄマウスにおいて、緑膿菌の致死抗原投与に対する防御
について試験した。結果は表３に示される通りであっ
た。

【００３２】

【表３】

【００３３】表３に示すように、対照抗酵母血清を注射
したマウスは、抗原投与量５×１０^１（表３、グル−プ
１）でさえ、感染に対しては防御されなかった。一方、
ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ特異的ウサギ血清を投与したマウス
は、５×１０^２ＣＦＵの緑膿菌の抗原投与に対して十分
に防御され（表３、グループ３）、５×１０^３ＣＦＵの
抗原投与後に４０％の生存が観察された。さらなる対照
として、抗原菌株緑膿菌セログループ１のＬＰＳに対し
て誘発させたウサギ血清による防御を試験した。投与量
５×１０^３以下で、ＬＰＳ特異的血清で防御された動物
の１００％が生存した（表３、グループ５）。これより
も１０倍高い抗原投与量５×１０^４では、このグループ
においては生存は観察できなかった。

【００３４】統計的解析を使用して、ＯｐｒＦ−Ｏｐｒ
Ｉ特異的血清、ＬＰＳ特異的血清及び抗酵母対照グルー
プの緑膿菌感染に対する防御のための防御投与量を比較
した。その結果、抗酵母血清と比較して、ＯｐｒＦ−Ｏ
ｐｒＩ血清の効力が８５倍増加したことが分かった（ｐ
≦０．００２、表３、グル−プ３参照）。これに対し
て、ＬＰＳ特異的血清については、効力の計算値が抗酵
母血清（ｐ≦０．００１）よりも３２５倍高かった。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１９２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＹＥＳ起源：生物名：Pseudomonas aeruginosa 株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．１８９他の情報：配列は、ＯｐｒＩ（シグナル配列を含まな
い）をコードする。配列 AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT CTG ACC GCT ACC GAA GAC 48 Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp 1 5 10 15 GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT 96 Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala 20 25 30 GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG 144 Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu 35 40 45 GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC ATG CTG GAA AAA GCC AGC CGC AAG 189 Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys 50 55 60 TAA 192

【００３６】配列番号：２配列の長さ：６３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala 20 25 30 Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu 35 40 45 Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys 50 55 60

【００３７】配列番号：３配列の長さ：４８６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＹＥＳ起源：生物名：Pseudomonas aeruginosa 株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．４８３他の情報：配列は、ＯｐｒＦのＣ末端をコードする。配列 GCT CCG GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC GTT TGC TCC GAC TCC GAC AAC 48 Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn 1 5 10 15 GAC GGC GTC TGC GAC AAC GTC GAC AAG TGC CCG GAC ACC CCG GCC AAC 96 Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn 20 25 30 GTC ACC GTT GAC GCC AAC GGC TGC CCG GCT GTC GCC GAA GTC GTA CGC 144 Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg 35 40 45 GTA CAG CTG GAC GTG AAG TTC GAC TTC GAC AAG TCC AAG GTC AAA GAG 192 Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu 50 55 60 AAC AGC TAC GCT GAC ATC AAG AAC CTG GCC GAC TTC ATG AAG CAG TAC 240 Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr 65 70 75 80 CCG TCC ACT TCC ACC ACC GTT GAA GGT CAT ACC GAC TCC GTC GGT ACC 288 Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr 85 90 95 GAC GCT TAC AAC CAG AAG CTG TCC GAG CGT CGT GCC AAC GCC GTT CGT 336 Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg 100 105 110 GAC GTA CTG GTC AAC GAG TAC GGT GTG GAA GGT GGT CGC GTG AAC GCT 384 Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala 115 120 125 GTC GGT TAC GGC GAG TCC CGC CCG GTT GCC GAC AAC GCC ACC GCT GAA 432 Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu 130 135 140 GGC CGC GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA GCC GAA GTA GAA GCC GAA GCC 480 Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala 145 150 155 160 AAG TAA 486 Lys

【００３８】配列番号：４配列の長さ：１６１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn 20 25 30 Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg 35 40 45 Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu 50 55 60 Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr 65 70 75 80 Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr 85 90 95 Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg 100 105 110 Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala 115 120 125 Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu 130 135 140 Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala 145 150 155 160 Lys

【００３９】配列番号：５配列の長さ：６４５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＹＥＳ起源：生物名：Pseudomonas aeruginosa 株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．６４２他の情報：配列は、ＯｐｒＦのＣ末端およびＯｐｒＩ
（シグナル配列を含まない）をコードする。配列 GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC GTT TGC TCC GAC TCC GAC AAC GAC GGC 48 Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly 1 5 10 15 GTC TGC GAC AAC GTC GAC AAG TGC CCG GAC ACC CCG GCC AAC GTC ACC 96 Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn Val Thr 20 25 30 GTT GAC GCC AAC GGC TGC CCG GCT GTC GCC GAA GTC GTA CGC GTA CAG 144 Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln 35 40 45 CTG GAC GTG AAG TTC GAC TTC GAC AAG TCC AAG GTC AAA GAG AAC AGC 192 Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser 50 55 60 TAC GCT GAC ATC AAG AAC CTG GCC GAC TTC ATG AAG CAG TAC CCG TCC 240 Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr Pro Ser 65 70 75 80 ACT TCC ACC ACC GTT GAA GGT CAT ACC GAC TCC GTC GGT ACC GAC GCT 288 Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr Asp Ala 85 90 95 TAC AAC CAG AAG CTG TCC GAG CGT CGT GCC AAC GCC GTT CGT GAC GTA 336 Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg Asp Val 100 105 110 CTG GTC AAC GAG TAC GGT GTG GAA GGT GGT CGC GTG AAC GCT GTC GGT 384 Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala Val Gly 115 120 125 TAC GGC GAG TCC CGC CCG GTT GCC GAC AAC GCC ACC GCT GAA GGC CGC 432 Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg 130 135 140 GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT 480 Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala 145 150 155 160 CGT CTG ACC GCT ACC GAA GAC GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT 528 Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala 165 170 175 GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG AAA 576 Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys 180 185 190 GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC ATG CTG 624 Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu 195 200 205 GAA AAA GCC AGC CGC AAG TAA 645 Glu Lys Ala Ser Arg Lys 210

【００４０】配列番号：６配列の長さ：２１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly 1 5 10 15 Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn Val Thr 20 25 30 Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln 35 40 45 Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser 50 55 60 Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr Pro Ser 65 70 75 80 Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr Asp Ala 85 90 95 Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg Asp Val 100 105 110 Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala Val Gly 115 120 125 Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg 130 135 140 Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala 145 150 155 160 Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala 165 170 175 Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys 180 185 190 Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu 195 200 205 Glu Lys Ala Ser Arg Lys 210

【００４１】配列番号：７配列の長さ：６８１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＹＥＳ起源：生物名：Pseudomonas aeruginosa 株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１．．６７８他の情報：配列は、ＯｐｒＩ（シグナル配列を含まな
い）およびＯｐｒＦのＣ末端をコードする。配列 AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT CTG ACC GCT ACC GAA GAC 48 Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp 1 5 10 15 GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT 96 Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala 20 25 30 GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG 144 Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu 35 40 45 GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC ATG CTG GAA AAA GCC AGC CGC AAG GAG 192 Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Glu 50 55 60 CTC GCT CCG GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC GTT TGC TCC GAC TCC GAC 240 Leu Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp 65 70 75 80 AAC GAC GGC GTC TGC GAC AAC GTC GAC AAG TGC CCG GAC ACC CCG GCC 288 Asn Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala 85 90 95 Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val 100 105 110 CGC GTA CAG CTG GAC GTG AAG TTC GAC TTC GAC AAG TCC AAG GTC AAA 384 Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys 115 120 125 GAG AAC AGC TAC GCT GAC ATC AAG AAC CTG GCC GAC TTC ATG AAG CAG 432 Glu Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln 130 135 140 TAC CCG TCC ACT TCC ACC ACC GTT GAA GGT CAT ACC GAC TCC GTC GGT 480 Tyr Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly 145 150 155 160 ACC GAC GCT TAC AAC CAG AAG CTG TCC GAG CGT CGT GCC AAC GCC GTT 528 Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val 165 170 175 CGT GAC GTA CTG GTC AAC GAG TAC GGT GTG GAA GGT GGT CGC GTG AAC 576 Arg Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn 180 185 190 GCT GTC GGT TAC GGC GAG TCC CGC CCG GTT GCC GAC AAC GCC ACC GCT 624 Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala 195 200 205 GAA GGC CGC GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA GCC GAA GTA GAA GCC GAA 672 Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu 210 215 220 GCC AAG TAA 681 Ala Lys 225

【００４２】配列番号：８配列の長さ：２２６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala 20 25 30 Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu 35 40 45 Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Glu 50 55 60 Leu Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp 65 70 75 80 Asn Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala 85 90 95 Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val 100 105 110 Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys 115 120 125 Glu Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln 130 135 140 Tyr Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly 145 150 155 160 Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val 165 170 175 Arg Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala 195 200 205 Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu 210 215 220 Ala Lys 225

【図面の簡単な説明】

【図１】緑膿菌の外膜タンパク質の構築組換え融合タン
パク質の概略を示した図である。大腸菌Ｋ１２における
発現では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコ
ードするベクターｐＧＥＸ−２ａを使用した。

【図２】表記のＧＳＴ結合組換え外膜タンパク質ワクチ
ン又はＧＳＴ単独で免疫したマウスの血清における緑膿
菌に対する抗体価の測定を示した図である。ＥＬＩＳＡ
測定は、音波処理緑膿菌セログループ１２を塗布したプ
レートを用いて実施した。

【図３】ＯｐｒＦのＢ細胞エピトープを表す表１に示す
合成ペプチドＤ１〜Ｄ５に対するＥＬＩＳＡによる抗体
測定の結果を示した図である。マウスを、表記の組換え
融合タンパク質又はＧＳＴ単独で４回免疫した。

【図４】ＢＡＬＢ／ｃマウスを表記ワクチン又はＧＳＴ
単独で免疫後、緑膿菌セログループ１の５、５０、５０
０又は５０００コロニー形成単位を腹腔内抗原投与した
後の生存率を示した図である。棒グラフは、抗原投与１
回当たりの生存率（ｎ＝１６〜１７）を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｄ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 39/104 ＡＤＺ 33/577 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 39/104 ＡＤＺ 9162−4ＢＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ミヒャエル、ブレッカードイツ連邦共和国マールブルク、パッペルウェーク、30 (72)発明者ベルント、ウルリッヒ、フォン、シュペヒトドイツ連邦共和国バーリンゲン／カイゼルシュツール、イム、シュパイヒェル、33 (72)発明者ホルスト、ドムデイドイツ連邦共和国ノイリート、ファザネンウェーク、６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク
質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端と融合してい
る緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタ
ンパク質であって、前記カルボキシ末端部が配列番号４
のアミノ酸配列の１〜１６１番の配列を含んでなるハイ
ブリッドタンパク質。
【請求項２】前記カルボキシ末端部の配列が配列番号４
のアミノ酸配列の１〜１５３番の配列である請求項１に
記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項３】アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク
質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端に融合してい
る緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタ
ンパク質であって、前記カルボキシ末端部がＳＥＥ１、
ＳＥＥ２、ＳＥＥ３及びＳＥＥ４からなる群から選択さ
れた少なくとも一種の表面露出Ｂ細胞エピトープを含ん
でなるハイブリッドタンパク質。
【請求項４】請求項１〜３いずれか一項に記載のハイブ
リッドタンパク質を含んでなるワクチン。
【請求項５】請求項１〜３いずれか一項に記載のハイブ
リッドタンパク質に対するモノクロ−ナル又はポリクロ
−ナル抗体。
【請求項６】請求項５に記載の抗体を含んでなるワクチ
ン。
【請求項７】請求項１〜３いずれか一項に記載のハイブ
リッドタンパク質をコードしている核酸。
【請求項８】請求項７に記載の核酸の発現を原核細胞又
は真核細胞中で生じさせることを含んでなる請求項１〜
３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質の製造
法。