JP2021511825A - 二硫化結合異性化酵素信号ペプチドを含む組み換えベクターおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
チモシンベータ4(Thymosin Beta 4;TB4)を発現するようにするプラスミドを合成するために、信号ペプチド(Signal Peptide)のDsbC−SP(Disulfide Bond Isomerase C signal peptide)のカルボキシル末端(Carboxyl terminus;C−term)側にTB4が結合されているDNA配列(Reference DNA Sequence)とpGEベクターを用いて、ベクターに前記DNA配列が挿入されたプラスミドを合成した。
前記実施例1の方法によって製作されたプラスミドを用いて、下記実験を行って、形質転換された大腸菌株を製作した。
LB培地(Luria Bertani media broth;LB Broth)を準備するために、三次純水800mLを2Lビーカー(beaker)に入れ、LB Broth 25.03gを測定して、前記2Lビーカーに入れた後、完全に溶けるまで撹拌した。次に、三次純水を追加して、最終体積が1Lになるように調整し、2Lボトルに移して入れて、121℃、30分の条件で滅菌した。
LB寒天平板(Agar Plate)を準備するために、三次純水300mLを2Lビーカーに入れ、LB寒天19.98gを前記2Lビーカーに入れた後、完全に溶けるまで撹拌した。次に、三次純水を追加して最終体積が500mLになるように調整し、2Lボトルに移して入れて、121℃、30分の条件で滅菌した。次に、高圧蒸気滅菌器(Autoclave)の温度が40〜50℃であるときに取り出して、クリーンベンチに移して、濃度が50μg/mLになるようにカナマイシン(ストック濃度50mg/mL)を500μL添加した。LB寒天溶液(Agar solution)をペトリ皿(Petri Dish)に約20mLずつ分注し、ペトリ皿のLB寒天が固まるまでクリーンベンチ内で乾燥させた後、十分に乾燥されたペトリ皿は、ラップで包んで最大1ヶ月間冷蔵保管(2〜8℃)した。
まず、前記実施例1の方法で合成されたプラスミド(DsbC−SP TB4)を用いてターゲットタンパク質発現のために形質転換された大腸菌株BL21(BL21/DsbC−SP TB4)を製作するために、User Protocol TB009(Novagen)によって形質転換を行い、前記形質転換された菌株の培養は、カナマイシンが50μg/mLで添加されたLB寒天平板にスプレッディングして、37℃に設定されたインキュベーターで一晩中(14時間)培養した。
(OD600=1.0になる体積)=(培養終了時の体積)×(培養終了時点のOD600値)
前記実施例2の方法によって製作された大腸菌株BL21の成長を確認するために、LB Broth 20mLとカナマイシンストック(50mg/ml)20μLを50mLコニカルチューブに入れた。冷凍冷蔵庫に保管されていたDsbC−SP TB4 1バイアルを取り出した後、37℃に設定された恒温水槽(Water Bath)で2〜3分間前記バイアルを解凍(Thawing)した。LB Brothおよびカナマイシンが入れられた50mL前記コニカルチューブに解凍した細胞を接種し、37℃振とう培養器で200rpmで3時間培養した。次に、培養液2.5mLをLB Broth 250mLが入れられたBaffled Erlenmeyer Flaskに接種し、接種以後から1時間ごとに培養液1mLを標本抽出(Sampling)した。前記抽出した培養液のOD600値をUV分光光度計(Spectrophotometer)で測定し、測定されたOD600値が0.8以上である場合、希釈して再測定した。
4−1.DsbC−SP TB4の発現確認
前記実施例2の方法によって製作された大腸菌株でチモシンベータ4(TB4)タンパク質の発現を確認するために、DsbC−SP TB4細胞ストックをカナマイシン(50μg/mL)が添加されたLB培地20mLに解凍した。次に、37℃、200rpmに設定された振とう培養器で3時間培養した後(1次種培養液)、前記1次種培養液をカナマイシン(50μg/mL)が添加されたLB培地20mLに1/10,000で希釈(Dilution)した後、一晩中培養した(2次種培養液)。LB 250mLに前記2次種培養液2.5mLを接種し、37℃、200rpmに設定された振とう培養器でさらに培養して、1時間ごとにOD600値を測定した。
DsbC−SP TB4細胞ストックをカナマイシン(50μg/mL)が添加されたLB培地20mLに解凍し、37℃、200rpmに設定された振とう培養器で3時間培養(1次種培養液)した。次に、前記1次種培養液をカナマイシン(50μg/mL)が添加されたLB培地20mLに1/10,000で希釈後、一晩中培養(2次種培養液)した。LB 250mLに前記2次種培養液2.5mLを接種し、37℃、200rpmに設定された振とう培養器でさらに培養して、1時間ごとにOD600値を測定した。
Claims (12)
- 二硫化結合異性化酵素信号ペプチド(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)を暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクター。
- 前記二硫化結合異性化酵素信号ペプチドは、配列番号10、12、14、および16よりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターは、チモシンベータ4(Thymosin Beta 4)を暗号化する塩基配列をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換えベクター。
- 前記チモシンベータ4は、配列番号2の塩基配列で暗号化されることを特徴とする請求項3に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターは、配列番号3で表されるEcoRI、配列番号4で表されるTacプロモーター(promoter)、配列番号5で表されるLacオペレーター(operator)、および配列番号6で表されるXhoIよりなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の組み換えベクター。
- 二硫化結合異性化酵素信号ペプチド(Disulfide Bond Isomerase signal peptide)を暗号化する塩基配列およびチモシンベータ4(Thymosin Beta 4)を暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする、組み換えベクター。
- 前記二硫化結合異性化酵素信号ペプチドは、配列番号10、12、14、および16よりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項6に記載の組み換えベクター。
- 前記チモシンベータ4は、配列番号2の塩基配列で暗号化されることを特徴とする請求項6に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターは、配列番号3で表されるEcoRI、配列番号4で表されるTacプロモーター(promoter)、配列番号5で表されるLacオペレーター(operator)、および配列番号6で表されるXhoIよりなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項6に記載の組み換えベクター。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 前記形質転換体は、大腸菌であることを特徴とする請求項10に記載の形質転換体。
- (a)請求項1〜9のいずれかに記載の組み換えベクターを製作する段階と;
(b)前記組み換えベクターで大腸菌を形質転換する段階と;
(c)前記大腸菌を培地に培養する段階と;
を含むチモシンベータ4(Thymosin Beta 4)タンパク質の生産方法であって、
前記チモシンベータ4タンパク質は、メチオニンでなくアミノ酸配列から始まることを特徴とする生産方法。
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