CN116410988A

CN116410988A - 利用柑橘rub2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法

Info

Publication number: CN116410988A
Application number: CN202310477920.1A
Authority: CN
Inventors: 邹修平; 王帅; 屈荣荣; 杜美霞; 许兰珍; 龙琴; 姚利晓; 何永睿; 李强
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2043-04-28
Also published as: CN116410988B

Abstract

本发明公开了利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，涉及植物基因工程技术领域，利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径，影响植物防御相关基因的表达，从而增强柑橘对黄龙病的抗性；所述柑橘RUB2的核苷酸序列如SEQ ID No.1。通过构建柑橘RUB2植物超量表达载体，利用根癌农杆菌介导法转化柑橘上胚轴，同时利用发根农杆菌介导法转化柑橘茎段，获得超量表达柑橘RUB2转基因植株和柑橘RUB2转基因毛状根，实现了利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径增强柑橘黄龙病抗性的效果。

Description

利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法。

背景技术

柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上的检疫性病害。其病原为难培养韧皮部杆菌属(Candidatusliberibactersp)的革兰氏阴性细菌，主要包括亚洲种('CandidatusLiberibacter asiaticus',CaLas)、美洲种('CandidatusLiberibacteramericanus',CaLam)、非洲种(CandidatusLiberibacter africanus',CaLaf)。其中，亚洲种致病性最强，且分布最广泛。柑橘黄龙病主要通过枝条嫁接，柑橘木虱和菟丝子进行传播(Halbert&Manjunath,2004)。但不能通过种子或者果实感染等方式进行继代传播。在自然条件下柑橘黄龙病的主要传播途径是柑橘木虱，柑橘木虱具有传毒效率高，且终身带菌的特点，这给黄龙病的防控带来了极大的阻碍。柑橘黄龙病远距离传播的主要途径是带病接穗和苗木的调运。

柑橘黄龙病最早发生在我国广东潮汕地区，至今已有130多年的历史(王爱民等，2008)。不同国家和地区又称青果病、梢枯病、立枯病等。迄今为止该病在我国长江流域以南的11个省(自治区、直辖市)如广东、广西、福建、台湾、江西、云南等地均有发生。柑橘黄龙病的流行已经影响到世界上所有主要的柑橘种植区(Hodges和Spreen,2012年；Kumagai等人,2013年)。在美国，佛罗里达州是受柑橘黄龙病影响最严重的柑橘生产区。自2005年发现HLB以来(JM Bovéet al.,2006)，佛罗里达州的柑橘产量下降了74％(Singerman et al.,2020)。HLB在几个加勒比国家也很普遍，例如古巴、牙买加，伯利兹和墨西哥。地中海盆地和澳大利亚的其他主要柑橘种植区也在受到HLB威胁。HLB已经从巴基斯坦向西扩散到伊朗，威胁土耳其及其他地区。2004年，柑橘黄龙病在巴圣保罗州首次出现，随后蔓延到米纳斯吉拉斯州、巴拉那州和南马托格罗索州，给巴西柑橘产业造成了巨大的经济损失(Coletta-Filho et al.,2004)。

培育抗病品种是解决黄龙病危害的根本措施。然而，由于柑橘遗传背景高度杂合，再加上：(1)CaLas为难培养细菌，迄今无法人工分离培养；(2)木虱或接穗嫁接传毒方法无法控制病原菌的含量和纯度，且潜育期和发病周期长，接种成功率低；(3)病原菌在植株体内分布极不均匀，且受到其它植原体的影响。这些因素严重制约了人们对柑橘黄龙病与寄主互作分子机制的研究，也是目前黄龙病抗性育种几乎毫无进展的一个主要原因。利用植物基因工程手段挖掘抗病基因，并培育抗病品种增强柑橘对黄龙病的抗性，是最为经济，同时也是从根本上解决这一难题的最为有效的途径(刘永忠et al.，2017；Wang et al.，2017)。最近，关于利用基因工程改良柑橘黄龙病耐性的研究报告才开始出现。比如，Dutt等(2016)在易感品种甜橙中超量表达拟南芥AtNPR1，组成型激活SA信号传导，激活病程相关蛋白基因PR1和PR2的表达，赋予了转基因植株对黄龙病的耐性；Hao等在Carrizo甜橙中超量表达人工修饰的植物thionin能同时增强柑橘对黄龙病和溃疡病的耐性；Zou等(2017)在锦橙韧皮部特异表达人工合成抗菌肽基因cecropin B显著增加了柑橘对黄龙病的耐性。

蛋白质泛素化在真核细胞内广泛存在，可以直接影响蛋白质的活性和定位，还可以调控包括细胞周期、蛋白质翻译、信号传导、细胞凋亡、转录调控、DNA损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。

泛素(Ubiquitin,Ub)是真核生物特有的一个由76个氨基酸残基组成的小蛋白质，分子量约8.5kDa(何珊等,2009)，在酵母和人类中都是高度保守的(Haglund et al.,2005)，全长包含7个赖氨酸(Lys)位点(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)，一个位于N端的甲硫氨酸(Met)位点(M1)以及一个位于C端的甘氨酸(Gly)位点(G76)(Sun et al.,2022)。

泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶的作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰，最后泛素化的蛋白被26S蛋白酶体降解，广泛参与生物生长发育、逆境应答等过程的过程(王琴等，2021)。泛素化是由泛素激活酶E1(ubiquitin-activating enzyme)、泛素结合酶E2(ubiquitin-conjugating enzyme)以及泛素连接酶E3(ubiquitin-protein ligase)三级酶联反应组成(王瑜,2019)。首先，泛素会在E1的催化下被激活。E1酶利用ATP将泛素蛋白C末端Gly-76的羧基腺苷酰化(adenylation)，然后将其转移到催化的Cys残基上。泛素Gly-76通过α羧基和E1的催化Cys的巯基共价连接，形成高能量的硫酯键。然后，泛素会从El转移到E2的催化Cys上，同样共价连接形成高能硫酯键。最后，E3介导了泛素从E2转移到底物上的过程(Koraljka et al.,2012)。泛素可以进一步通过其C末端甘氨酸(Gly-76)连接到上一个泛素分子的赖氨酸或者甲硫氨酸残基上，形成8种不同连接形式的多聚泛素链，包括由泛素上的Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,Lys48和Lys63(谭家兴等,2019)。

蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的降解是真核生物细胞内蛋白更新的主要途径，在调节活性氧爆发、激素信号传导、基因表达和细胞程序性死亡等生物过程钟起着关键作用(Trujillo et al.,2010)。因此，UPS也是病原体操纵宿主免疫反应，促进病菌侵染的靶标途径之一(

et al.,2014)。近年的研究逐渐发现，有些致病细菌的效应子在被分泌到宿主细胞以后，可以利用宿主的泛素化系统来行使其功能，这些效应子可以在泛素化酶联反应的不同步骤上，利用不同甚至独特的生化活性，或者模仿宿主相关蛋白质活性，对泛素化进行干扰和利用，从而拮抗宿主免疫防御，促进病原菌的感染和生存(李珊,2013)。

目前未见利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径增强柑橘黄龙病抗性技术的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是目前的柑橘黄龙病抗性不足的问题，目的在于提供一种利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，解决了目前的柑橘黄龙病抗性不足的问题。

本发明通过下述技术方案实现：

利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径，影响植物防御相关基因的表达，从而增强柑橘对黄龙病的抗性；所述柑橘RUB2的核苷酸序列如SEQ ID No.1。

进一步的，利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，包括以下步骤：

步骤1：获得柑橘RUB2编码序列；

步骤2：用组成型启动子35S或CaMV 35S调控步骤1获得的柑橘RUB2编码序列，构建超量表达载体；

步骤3：将步骤2得到的植物表达载体整合到柑橘基因组中；

步骤4：将通过步骤3获得的柑橘进行进一步的培养,并获得转基因植株和转基因毛状根；

步骤5：将通过步骤4获得的转基因植株和转基因毛状根进行进一步的检测筛选出超量表达柑橘RUB2的植株和毛状根；

步骤6：将通过步骤5获得的转基因植株和转基因毛状根进行柑橘黄龙病抗性评价，获得调控柑橘RUB2增强柑橘黄龙病抗性的转基因植株和转基因毛状根。

步骤7：将通过步骤5获得的转基因植株检测相关防御基因表达量、激素和活性氧含量，明确柑橘RUB2调控柑橘防御反应的机理。

进一步的，调控柑橘RUB2基因表达改良柑橘黄龙病抗性的方式为上调柑橘RUB2表达。

进一步的，调控柑橘RUB2基因表达的调控启动子为动物、植物、微生物或病毒来源的强启动子。

进一步的，用于上调柑橘RUB2表达的植物表达载体中含有强启动子控制柑橘RUB2基因表达的阅读盒，将含有强启动子调控的柑橘RUB2阅读盒的T-DNA导入柑橘中，实现上调柑橘RUB2，并获得抗性显著提高的转基因植株。

进一步的，步骤1中的柑橘RUB2编码序列包括以晚锦橙cDNA为模板克隆得到的柑橘RUB2编码序列，克隆柑橘RUB2基因片段所采用的引物为CsRUB2-f和CsRUB2-r；CsRUB2-f的核苷酸序列如SEQ ID No.2，CsRUB2-r的核苷酸序列如SEQ ID No.3。

进一步的，步骤2中将构建超量表达载体的方法包括根癌农杆菌介导法和发根农杆菌介导法。

进一步的，步骤4中的转基因植株筛选方法包括抗性筛选、GUS组织化学染色和PCR验证。

进一步的，步骤5中筛选柑橘RUB2的超量植株和毛状根的方法为定量PCR法；步骤7中检测转基因植株相关防御基因表达量方法为定量PCR法。

进一步的，步骤6中黄龙病抗性评价方法为嫁接传毒方法，利用定量PCR检测植株和毛状根中病原菌的含量，并进行长期的症状观察。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明通过构建柑橘RUB2植物超量表达载体，利用根癌农杆菌介导法转化柑橘上胚轴，同时利用发根农杆菌介导法转化柑橘茎段，获得超量表达柑橘RUB2转基因植株和柑橘RUB2转基因毛状根，实现了利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径增强柑橘黄龙病抗性的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：

图1为本发明中实施例2中的植物表达载体T-DNA结构图，其中(A)：pLGN-RUB2植物表达载体结构示意图；(B)：p2301GMN-RUB2植物表达载体结构示意图；35S：组成型强启动子；GFP:NPTII和GUS:NPTII：转基因柑橘筛选用标记基因；nos:转录终止序列；LB：T-DNA左臂；RB：T-DNA右臂；

图2为本发明中实施例5中的转基因植株PCR检测结果图；M:Marker；P，p35S:RUB2质粒；WT，野生型对照；OE-#，转基因植物；

图3为本发明中实施例5中的转基因植株表达水平分析图；*星号表示与WT对照相比有显著差异(p<0.05，t-test)；

图4为本发明中实施例5中的柑橘转基因植株症状观察效果图；

图5为本发明中实施例5中的转基因植株病原菌含量检测结果图；RUB2转基因植株的CaLas的定量分析；不同字母表示接种后细菌滴度的显著差异，P<0.05，WT：野生型；OE-#：转基因植物；

图6为本发明中实施例6中的转基因毛状根PCR检测结果图；RUB2转基因毛状根PCR检测；M：Marker；P，p35S:RUB2质粒；WT，野生型对照；OE-#，转基因毛状根；

图7为本发明中实施例6中的转基因毛状根表达水平分析图；转基因毛状根中RUB2的相对表达水平；*星号表示与WT对照相比有显著差异(p<0.05，t-test))；

图8为本发明中实施例6中的柑橘RUB2转基因毛状根表型观察；

图9为本发明中实施例6中的转基因毛状根病原菌含量检测；RUB2转基因毛状根的CaLas的定量分析；不同字母表示接种后细菌滴度的显著差异，P<0.05，WT：野生型；OE-#：转基因毛状根。

图10为本发明中实施例7中的转基因植株相关防御基因表达水平分析。*星号表示与WT对照相比有显著差异(p<0.05，t-test))；

图11为本发明中实施例7中的转基因植株激素水平分析。*星号表示与WT对照相比有显著差异(p<0.05，t-test))；

图12为本发明中实施例7中的转基因植株活性氧水平分析。*星号表示与WT对照相比有显著差异(p<0.05，t-test))；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

实施例1

CsRUB2基因的克隆，其中CsRUB2即柑橘RUB2，Cs为柑橘的英文缩写。

CsRUB2序列从华中农大甜橙基因组数据库CAP(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/)中获得(Xu,et al.,2013)，Gene ID Cs9g19380.1。根据基因序列设计CsRUB2基因引物(CsRUB2-f:ATGCAGATCTTTGTGAAGAC(SEQ ID No.2)和

CsRUB2-r:TTAAAGACCGCCGCCCCTCA(SEQ ID No.3))，以柑橘cDNA为模板，PCR扩增CsRUB2的编码序列CDS(图1)。回收PCR产物，连接pGEM-T easy载体并转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆进行测序确认。

实施例2

植物表达载体的构建。

以pLGN载体和p2301GMN载体为基本骨架，BamHI和SalI将CsRUB2基因从pGEM-Teasy载体上切下，连入相同酶切处理的pLGN载体和p2301GMN载体，转化大肠杆菌，经PCR和酶切验证获得pLGN-CsRUB2和p2301GMN-CsRUB2植物表达载体，由超量表达启动子35S控制CsRUB2的表达(如图1所示)。

实施例3

根癌农杆菌介导的遗传转化柑橘。

用冻融法将构建的pLGN-CsRUB2植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105。参考Bio-RADMicroPulser用户说明书，上述的表达载体通过农杆菌介导上胚轴的方法导入晚锦橙。具体方法如下：

(1)种子制备

称取4g-6g的二氯异氰尿酸钠粉末放在烧杯中，加入100ml的ddH₂O溶解，用玻璃棒搅拌均匀，给种子消毒后用手术刀剥去种子种皮，播种于MS种子培养基中，暗培养2周左右，待种子发芽后上胚轴长到10cm左右，将其置于光下1周左右使植株转绿。

(2)菌液制备以及重悬

将保存于-80℃的农杆菌融化后用涂布棒划线于LK平板，28℃倒置培养2天后，用枪头挑取4-6个单菌落，加入20ml的LK液体，放入28℃恒温摇床，220rpm，过夜培养。第二天上午以LK液体为对照调零，测菌液浓度的OD值。根据公式C1×V1＝C2×V2将菌液稀释至浓度OD＝0.1，加入LK液体至50ml。再次放入28℃恒温摇床，220rpm，摇菌约3h，直到菌液浓度OD＝0.5左右。

(3)上胚轴准备

在超净工作台上用小刀将上胚轴斜切成1.5cm左右的茎段，一次切5-8株苗子，一株苗子切成4-5个外植体，切完后尽快转入PH＝5.8的MS液体培养基中，以免伤口过度失水，影响转化效率。将锥形瓶放置摇床上缓慢震荡。

(4)转化

将重悬的菌液倒入50ml的离心管，5000rpm，10min,倒掉上清液，留下菌体。用50ml的PH＝5.4的MS液体基本培养基重悬菌体。将PH＝5.8的MS液体培养基中液体倒掉，茎段转移到重悬菌液中，将锥形瓶放置摇床上缓慢震荡10min。

(5)茎段的培养

倒掉重悬的菌液，用镊子夹出茎段放置于无菌的滤纸上，擦干茎段表面的液体，将其放置于共培养基上，间隔有序的平铺茎段，放入28℃恒温培养箱中，暗培养3天。3天后，将茎段转移到筛选培养基上，间隔有序的平铺茎段，放入28℃恒温培养箱中，暗培养一周。一周后，将茎段转移到28℃光照培养箱中，培养约3个月，直到外植体的两端长出较大的不定芽。在光照培养期间下需要每两周更换一次筛选培养基，并定期清理污染的外植体。

(6)阳性苗的筛选

待不定芽生长到1-2cm，用无菌的刀片切下一小片叶子，放入装有30uL的GUS染液的小离心管中，将离心管放到37℃恒温培养箱中30min，观察其是否变蓝，并做好向对应的标记。将染色结果变蓝色的转基因芽切面放在新的Cef筛选培养基中继续培养，剩下的非阳性的芽挑选出来清理掉。

(7)试管苗嫁接

当转基因芽长的较大时，将其放在超净工作台上进行嫁接，把芽嫁接到晚锦橙砧木上，放于装有滤纸桥培养基的试管中，将其置于常温的组胚室，待其芽长至5-7cm，放置温网室炼苗一周，再将其嫁接到两年生的砧木上，套袋保湿培养2周，再剪去两个角，透气培养一周，去袋后放置在温室中继续培养，直到转基因植株长大可用于后续实验。

实施例4

发根农杆菌介导的遗传转化柑橘。

用冻融法将构建的p2301GMN-CsRUB2植物表达载体质粒导入农杆菌MSU440。参考Bio-RADMicroPulser用户说明书，将上述载体通过农杆菌介导茎段的方法导入晚锦橙。具体方法如下：

(1)菌液制备和重悬

将保存于-80℃的发根农杆菌融化后用涂布棒划线于LK平板，28℃倒置培养2天后，用枪头挑取4-6个单菌落，加入30-40ml的LK液体，放入28℃恒温摇床，220rpm，过夜培养。第二天上午以LK液体为对照调零，测菌液浓度的OD值。根据公式C1×V1＝C2×V2将菌液稀释至浓度OD＝0.2，加入LK液体至200ml。再次放入28℃恒温摇床，220rpm，摇菌约3h，直到菌液浓度OD＝0.8左右。

(2)茎段制备和蛭石准备

采集温室或者田间黄龙病显症状直径约0.5cm的枝条，用清水洗净，用小刀切成长约为5cm,含有一个或者多个结节的茎段。在培养盆中放入大量蛭石，再加入适量自来水够混匀，湿度适中。

(3)真空浸染转化

将二次摇菌的菌液倒入50ml的离心管，5000rpm，10min,倒掉上清液，留下菌体。用50ml的MS液体基本培养基(不加蔗糖)重悬菌体。将茎段切口处浸泡在重悬后的液体中，真空浸染(30psi),30min。

(4)茎段的培养

将浸染后的茎段插入湿润的蛭石中，竖直放置，茎段插入蛭石中，叶片暴露在空气中。放在26℃，16h/d的恒温培养箱中培养。培养期间应频繁加水或者霍格兰营养液。一般培养30天后可看见毛状根伸出，120天左右可进行转化子鉴定和基因功能分析。

实施例5

晚锦橙中超量表达CsRUB2抑制病原菌增殖。

按照Aidlab公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书操作方法(cat.No.DN15)，提取阳性的转基因植株的DNA。设计引物(如表1.1，同时参照序列表中的SEQ ID No.4(pLGN-35S-f)，SEQ ID No.5(pLGN-CsRUB2-r)，SEQ ID No.6(P2301GMN-35S-f)，SEQ ID No.7(P2301GMN-35S-r))鉴定CsRUB2转基因植株。以超量表达融合载体质粒为阳性对照，野生型植株DNA为阴性对照。PCR筛选一共获得4株CsRUB2转基因植株，命名为OE-1、OE-2、OE-3和OE-4(如图2)。其中PCR扩增体系和反应条件分别如表1.2和表1.3。

表1.1引物序列

表1.2PCR扩增体系

表1.3反应条件

按照EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab,cat.No.RN09)提取CsRUB2转基因植株的总RNA。cDNA的合成按照试剂盒BIO-RAD iScriptTM cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD,cat.No.170-8891)说明书进行。用试剂盒Real-time PCR(BIO-RAD iQTM SYBR GreenSupermix,cat.No.170-8882AP)定量分析CsRUB2基因的表达。试验重复3次，数据用Bio-RadCFX Manager 2.0软件进行统计分析。采用2^-ΔΔCt法计算转基因植株中CsRUB2的相对表达量。结果显示CsRUB2转基因植株的基因表达量都高于野生型植株，其中OE-1的表达水平最高，约为对照的15倍(如图3)。其中引物序列如表2.1，同时参照序列表中的SEQ ID No.8(RT-CsRUB2-f)，SEQ ID No.9(RT-CsRUB2-r)，SEQ ID No.10(GAPDH-f)，SEQ ID No.11(GAPDH-r)。反转录体系如表2.2，反转录程序如表2.3，qPCR反应体系如表2.4，qPCR程序如表2.5。

表2.1引物序列

表2.2反转录体系

表2.3反转录程序

表2.4qPCR反应体系

表2.5qPCR程序

采用嫁接法对转基因植株进行传毒(Cifuentes-Arenas et al.,2019)，选取感染黄龙病晚锦橙枝条为接穗，转基因植株为砧木，将带有黄龙病的带芽枝段嫁接到转基因植株上，套袋将其放于温室中，定期浇水，用于后期转基因植株的不同时期的病原菌检测。将健康转基因植株和感染黄龙病的转基因植株放在26℃的温室中，浇水和施肥。定期对转基因植株进行表型观察并拍照记录。传毒五个月后，转基因植株和野生型的叶片中没有出现HLB症状(如黄化或斑驳黄色)(如图4)。

根据Zou(2017)的方法，利用qPCR来检测转基因植株的病原菌含量。从给转基因植株传毒开始，在第1、3和5月时检测CsRUB2转基因植株病原菌含量。每个株系取3片叶子提取DNA，稀释到10ng/uL，利用引物HLBasf，HLBasr和探针HLBp进行检测。利用下述公式：Numberof CaLas cells/ug of citrus DNA＝10^y/m，y＝-0.3264x+12.715，R2＝0.9995计算CaLas菌的相对含量(Log10)。以野生型植株作为对照，检测CsRUB2转基因植株的抗性水平。每个处理设置3个生物学重复和3个技术学重复，qPCR的体系和反应程序同上。结果表明超量表达CsRUB2抑制了转基因植株中CaLas增殖(如图5)。其中引物序列如表3.1，同时参照序列表中的SEQ ID No.12(HLBasf)，SEQ ID No.13(HLBasr)，SEQ ID No.14(HLBp)。qPCR反应体系如表3.2，qPCR反应程序如表3.3。

表3.1引物序列

表3.2qPCR反应体系

表3.3qPCR反应程序

实施例6

晚锦橙毛状根中超量表达CsRUB2抑制病原菌增殖。

CsRUB2转基因毛状根鉴定方法同上。一共获得了18株CsRUB2转基因毛状根(如图6)。因其毛状根大小、形状不一，保证足够材料用于提取DNA和RNA，故随机选取3个CsRUB2转基因毛状根混合为一组，共分为6组，命名为OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5和OE-6。其中引物序列如表4.1，同时参照序列表中的SEQ ID No.15(P2301GMN-35S-f)，SEQ IDNo.16(P2301GMN-35S-r)。

表4.1引物序列

CsRUB2转基因毛状根中基因表达量CsRUB2计算方法同上。结果显示CsRUB2转基因毛状根的基因表达量都高于对照，其中OE-6的表达水平最高，约为对照的23倍(如图7)

CsRUB2转基因毛状根传毒方法同上。四个月后对转基因毛状根进行表型观察。转基因毛状根与对照毛状根表型无明显差别。毛状根整体呈白色或黄色，长度在1cm-10cm之间(如图8)。

转基因毛状根病原菌含量检测方法同上。CsRUB2转基因毛状根中的病原菌含量均显著低于对照，表明CsRUB2超量表达抑制CaLas增殖。(如图9)

实施例7

晚锦橙中超量表达CsRUB2增强柑橘防御反应

通过RT-qPCR检测2个系统获得抗性SAR相关基因在CsRUB2转基因植株中的转录水平，包括WRKY45和Ciclev10033908m。检测3个植物免疫系统“ETI和PTI”相关基因在CsRUB2转基因植株中的转录水平，包括GST1、WRKY29和PR5。

在超量表达CsRUB2转基因植株中，SAR的marker基因的表达水平基本都显著高于野生型对照(图10)。在超量表达CsRUB2转基因植株中，“ETI和PTI”的marker基因的表达水平基本都显著高于野生型对照(图10)。

水杨酸SA、水杨酸甲酯MeSA正向调控植物对细菌病抗性、茉莉酸JA负调控植物对细菌病抗性。以WT为对照，分析了OE-1和OE-4转基因植株SA、MeSA和JA的含量变化。其中引物序列如表5.1所示，同时参照SEQ ID No.17(RT-CsWRKY45-F)，SEQ ID No.18(RT-CsWRKY45-R)，SEQ ID No.19(RT-Ciclev10033908m-F)，SEQ ID No.20(RT-Ciclev10033908m-R)，SEQ ID No.21(RT-GST1-F)，SEQ ID No.22(RT-GST1-R)，SEQ IDNo.23(RT-WRKY29-F)，SEQ ID No.24(RT-WRKY29-R)，SEQ ID No.25(RT-PR5-F)，SEQ IDNo.26(RT-PR5-R)。

在CsRub2转基因植株中，SA含量均显著高于野生型对照，而JA和MeSA含量均显著低于野生型对照(图11)。结果表明，超量表达CsRub2促进SA水平上升，降低JA和MeSA含量。

检测了转基因植株中H₂O₂的含量变化。在CsRub2转基因植株中，H₂O₂含量均显著高于野生型对照(图12)。结果表明，在柑橘晚锦橙中超量表达CsRub2促进H₂O₂积累。

综述，在柑橘晚锦橙中超量表达CsRub2显著提升了柑橘防御信号分子SA和H₂O₂的水平，进而促进柑橘SAR、“ETI和PTI”防御反应，增强植株的抗性。

表5.1引物序列

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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Claims

1.利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径，影响植物防御相关基因的表达，从而增强柑橘对黄龙病的抗性；所述柑橘RUB2的核苷酸序列如SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获得柑橘RUB2编码序列；

步骤3：将步骤2得到的植物表达载体整合到柑橘基因组中；

3.根据权利要求1或2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，调控柑橘RUB2基因表达改良柑橘黄龙病抗性的方式为上调柑橘RUB2表达。

4.根据权利要求1或2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，调控柑橘RUB2基因表达的调控启动子为动物、植物、微生物或病毒来源的强启动子。

5.根据权利要求1或2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，用于上调柑橘RUB2表达的植物表达载体中含有强启动子控制柑橘RUB2基因表达的阅读盒，将含有强启动子调控的柑橘RUB2阅读盒的T-DNA导入柑橘中，实现上调柑橘RUB2，并获得抗性显著提高的转基因植株。

6.根据权利要求2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，步骤1中的柑橘RUB2编码序列包括以晚锦橙cDNA为模板克隆得到的柑橘RUB2编码序列，克隆柑橘RUB2基因片段所采用的引物为CsRUB2-f和CsRUB2-r；CsRUB2-f的核苷酸序列如SEQ ID No.2，CsRUB2-r的核苷酸序列如SEQ ID No.3。

7.根据权利要求2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，步骤2中将构建超量表达载体的方法包括根癌农杆菌介导法和发根农杆菌介导法。

8.根据权利要求2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，步骤4中的转基因植株筛选方法包括抗性筛选、GUS组织化学染色和PCR验证。

9.根据权利要求2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，步骤5中筛选柑橘RUB2的超量植株和毛状根的方法为定量PCR法；步骤7中检测转基因植株相关防御基因表达量方法为定量PCR法。

10.根据权利要求2所述的利用柑橘RUB2调控柑橘泛素化途径改良柑橘黄龙病抗性的方法，其特征在于，步骤6中黄龙病抗性评价方法为嫁接传毒方法，利用定量PCR检测植株和毛状根中病原菌的含量，并进行长期的症状观察。