CN105349554B

CN105349554B - 香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段、编码蛋白、制备方法及用途

Info

Publication number: CN105349554B
Application number: CN201510703999.0A
Authority: CN
Inventors: 黄敏; 阮文静; 钟民涛; 张伟; 刘奔; 李星云; 王晓丽; 曹婧; 宁安红; 伦永志
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105349554A

Abstract

本发明公开一种香菇C91‑3菌株的Latcripin‑9基因片段、编码蛋白、制备方法及用途，Latcripin‑9基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示；编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的。Latcripin‑9基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91‑3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ/XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。

Description

香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段、编码蛋白、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-9基因片段、编码蛋白、制备方法及用途，所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤、清除自由基及染料废水脱色等功能。

背景技术

真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。虽然目前已有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段、编码蛋白及制备方法的相关报道，但是不同的基因片断的作用效果不尽相同，亟待开发更多的表达蛋白药效强、靶向性好、具备产业价值的香菇C91-3cDNA的基因片段。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-9基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤、清除自由基及染料废水脱色等功能。

本发明的技术解决方案是：一种香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c.PCR扩增目标基因：

以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：

上游引物EcoRⅠ：

5'-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3'

下游引物XhoⅠ：

5'-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3' ；

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化792bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。

所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min，再次4˚C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

所述c步骤的PCR反应体系50 µl：cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture 4 µl、5×PrimeSTAR Buffer 10 µl、2.5 U/µl 的PrimeSTAR HS DNAPolymerase0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段编码蛋白在制备抗肿瘤、抗氧化或抗衰老药物中的应用。

一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段编码蛋白在染料废水脱色中的应用。

本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-9基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期、抗肿瘤、清除自由基及染料废水脱色等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET-32a原核表达体系中进行高效表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备治疗肿瘤、抗氧化或抗衰老药物，增加药物种类。同时亦可应用于处理纺织工业的染料废水脱色，无二次污染、利于环保。

附图说明

图1是本发明实施例 PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2是本发明实施例所用载体 pET-32a（＋）双酶切后的电泳图。

图3是本发明实施例提取的Latcripin-9基因片段转化后的单克隆阳性菌落。

图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图5是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。

图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。

图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白对Hela细胞的生长抑制率。

图8是本发明实施例纯化后的目标蛋白对Hep-2细胞的生长抑制率。

图9是本发明实施例纯化后的目标蛋白的清除氧自由基率示意图。

图10是本发明实施例纯化后的目标蛋白对刚果红染料脱色效果示意图。

图11是本发明实施例纯化后的目标蛋白对活性艳蓝染料脱色效果示意图。

香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；

分类命名：香菇（Lentinula edodes）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏号：CGMCC No.7354。

具体实施方式

a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：

取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入1ml的Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入然后加入0.2 ml氯仿，温和振荡后，4˚C, 12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液0.5 ml并转移至另一干净的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置15 min，再次4˚C,12000 r/min离心，10min，弃上清，然后加入75%乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。

进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。

b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

反应体系：香菇菌丝体总RNA (1µg/µl) 1 µl、3’ RACE Adaptor (5 µM) 1 µl、dNTP Mixture (10 mM each) 1 µl、RNase Free dH₂O 4.5 µl；

反应条件：70℃，10 min 立即冰上放置2分钟；

然后加入下列组分：5×M-MLV Buffer 2µl、 RNase Inhibitor (40 U/µl) 0.25µl、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNA酶) (200 U/µl) 0.25 µl，体系总体积达到10µl。

反应条件： 42℃，60 min 70℃，15 min 得到反转录反应液（cDNA）。

c. PCR扩增目标基因：

上游引物EcoRⅠ：

5'-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3'

下游引物XhoⅠ：

5'-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3' ；

引物委托宝生物（大连）公司合成。

PCR反应体系50 µl： cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTPMixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg^2＋plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNAPolymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。

PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M ： DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-9目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。

d. 回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化792bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，命名为Latcripin-9基因片段。

实验：

1. Latcripin-9基因片段序列测定：

测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-9基因片段核苷酸序列如SEQID NO.1。Latcripin-9的基因片段序列长为792bp的cDNA，其含有264个密码子可读框（ORF）。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。

2. Latcripin-9基因片段的克隆表达

2.1 载体构建

2.1.1 将质粒pET-32a（＋），使用EcoRⅠ/XhoⅠ进行酶切；

反应体系（37℃过夜）：

pET-32a（＋）（100 ng/µl） 10 µl

10×K Buffer 5 µl

EcoRⅠ（10 U/µl） 1 µl

XhoⅠ（10 U/µl） 1 µl

dH₂O Up to 50 µl

取5 µl 进行1% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，M ：λ-Hind Ⅲ digest；1 ：pET-32a（＋）- EcoRⅠ/XhoⅠ；2 ：pET-32a（＋）-plasmid；表明质粒切割完全，可进行后续实验。

2.1.2 载体回收

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收约5.9 kbp 的DNA 片段。

2.1.3 将pET-32a（＋）载体与本发明实施例的Latcripin-9基因片段进行重组

使用In-Fusion® HD Cloning Kit，分别将本发明实施例的Latcripin-9基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下：

Latcripin-9基因片段（100 ng/µl） 2 µl

酶切后回收载体（50 ng/µl） 1µl

5xIn-Fusion HD Enzyme Premix 2 µl

dH₂O Up to 10 µl

50℃ 15 min

取上述In-Fusion 产物2.5 µl 热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37 ℃过夜培养。培养结果如图3所示，表明重组载体成功转化到宿主菌中，并获得阳性菌落。

同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37 ℃培养14小时，采用宝生物公司PlasmidMiniprep Kit V3.l 抽提质粒进行测序鉴定，结果如SEQ ID NO.1。

2.2Latcripin-9蛋白的诱导表达及鉴定

2.2.1Latcripin-9蛋白的自诱导表达

挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml 含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基中，于37 ℃下，120 r/min 振荡培养过夜，再接种于100ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的自诱导培养基中，于37 ℃下，120 r/min 振荡培养4小时。取菌液进行反复冻融破碎（4次），低温（4℃）离心5000 r/min，5min，取上清，加入50 μl PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12%SDS-PAGE电泳图如图4所示，表明重组蛋白在阳性菌株中成功表达。

2.2.2目标蛋白Western-blotting 鉴定分析

将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭120分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody，4℃孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色如图5所示，证明诱导表达的重组蛋白确实为目的蛋白。

2.3 Latcripin-9蛋白的纯化及活性鉴定

2.3.1. Latcripin-9蛋白的纯化

将上述条件诱导的菌体低温5000 r/min，10 min~20 min离心，每50~100 mg菌体（湿重）加入1~2 ml细菌裂解液。10000×g，4℃离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀（包涵体）。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10,000×g离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图6所示。图6中，1：标准蛋白，2：全菌液，3：流穿液，4-9分别为体积1 ml的洗脱液，结果表明，在2-6 ml洗脱液中成功分离得到目的蛋白。

采用现有方法对纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.3.2. Latcripin-9蛋白的除盐和复性

将纯化后的Latcripin-9蛋白进行梯度透析，将Latcripin-9蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5 L~2 L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24 h~72 h，每6~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至0。将透析袋中的溶液离心10000 rpm，4℃离心，20~30 min上清即为复性的重组蛋白。

2.3.3 Latcripin-9蛋白的抗肿瘤活性鉴定（MTT法）

将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为50 µg / mL、100 µg / mL、200µg / mL，备用。以PBS作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人宫颈癌Hela细胞株、人喉癌Hep-2细胞株进行MTT实验。用0.25~1%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×10⁴/ml。每孔加入100 ul，边缘孔用无菌PBS填充，5% CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入上述对应浓度的药物每孔100 μL，每个浓度设6个复孔，5% CO₂，37 ℃孵育48小时。并倒置显微镜下观察。然后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg / mL，即0.5% MTT），继续培养4小时。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪562 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630nm，按照下面公式计算抑瘤率（细胞生长抑制率）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/对照组平均OD值。目标蛋白的MTT实验结果说明本发明基因表达的蛋白对人宫颈癌Hela、人喉癌Hep-2细胞株均有明显地抑制作用，50 µg / mL、100 µg / mL、200µg / mL，48 h的抑瘤率见图7、图8。

2.3.4 Latcripin-9蛋白的清除自由基活性鉴定（DPPH法）

将目的蛋白作用的终浓度分别调整为22.5 µg / mL、45 µg / mL、90 µg / mL、180 µg / mL、240 µg / mL、360 µg / mL，备用；同时配制相应浓度的抗坏血酸作为阳性对照。分别将不同浓度的蛋白、阳性对照与DPPH作用，取100µL样品加入100µL质量浓度为0.2mg/mL的DPPH溶液中，对照组加入100µL无水乙醇，暗处反应30分钟，在酶联免疫检测仪517nm处测定混合物的吸光度，按照下面公式计算DPPH的清除率：

DPPH清除率=（A-B+C）/A×100%

式中 A—无水乙醇+DPPH·溶液的吸光度

B—样品溶液+ DPPH·溶液的吸光度

C—样品溶液+无水乙醇的吸光度

目的蛋白在蛋白浓度为22.5 µg / mL、45 µg / mL、90 µg / mL、180 µg / mL、240 µg / mL、360 µg / mL时的清除率见图9，说明本发明基因表达的蛋白对DPPH·自由基有明显的清除效果。

2.3.4 Latcripin-9蛋白的染料脱色能力实验

将目的蛋白的浓度调整为100µg / mL、200µg / mL、400µg / mL、800µg / mL，备用。配制20mg/mL的刚果红染液和1mg/mL的活性艳蓝（KN-R），备用。刚果红染料的反应体系中加入染液200µL、pH4.5的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液200µL、目的蛋白100µL，活性艳蓝的反应体系为染液10µL、pH4.5的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液100µL、目的蛋白800µL，用等量100℃灭活的目的蛋白作对照，30℃反应8h，分别在酶联免疫检测仪501nm、592nm处测定混合物的吸光度，按下面的公式计算蛋白的脱色率：脱色率=（A₀-A₁）/A₀×100%，式中A₀为对照组吸光值，A₁为实验组吸光值。结果表明目的蛋白对刚果红染料和活性艳蓝染料均有一定的脱色能力。在蛋白浓度为100µg / mL、200µg / mL、400µg / mL、800µg / mL时，对刚果红染料和活性艳蓝染料的脱色率分别见图10、图11。

序列表

<110> 大连医科大学

<120>香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段、编码蛋白、制备方法及用途

<160> 4

<210> 1

<211> 792

<212> DNA

<213>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）

<400> 1

1 GTCTTTCTAC TTGCATCAGA TACTATCGAC AATGTGAACG CTACGCTATC GCAAGTCCAG

61 AACATCTTGA ATGGTTCGAT TACGGAGGCT TATAGTCTTC AAGGTCAGGC TAGACCGGGA

121 GATGAACAAG GCCATGAACA TTTCGGATTC ATGGACGGGA TAAGTAATCC AGCAGTCACT

181 GGATTTTCCA CCCCATTACC AGGTCAACAG GTCCTTGATC CAGGACTCTT CCTTCTTGGT

241 GAATCAGGCG ATCTAGTATC CCGCCCTTCG TGGGCCAAAG ATGGCTCGTT CCTGGCCTTC

301 CGTCAGTTAC AGCAACGTGT ACCAGAGTTC AACGCGTTCT TGGTTGATAA TGCACTTTCG

361 AATCCGAACT TGACGGCTGA CCAAAATGCT GAACTGTTGG GCGCGAGGAT GATGGGTCGA

421 TGGAAGAGTG GAGCCCCAGT CGACCTAGCT CCCACCGTGG ACGATCCTGT ACTGGCGGCT

481 GATCCACAAC AAAACAACAA CTTCAATTAC ACGCACCCTG GATTCGACGA GGCTACTGAC

541 CAGACACATT GTCCATTCTC AGCTCATGTC CGCAAGACGA ATCCTCGGTC CGATCTCAAT

601 CCTGAAGATA CCGCGAACCA TATCATTCGT GCAGGGATCC CGTACGGGCC TGAGGTTACC

661 GACGCTGAGA ACGCCTCGAA CGTTTCTAGT ACAGATCCTA GCCTTGAACG TGGCTTAGCT

721 TTTGTTGCCT ACCAATCCGA TATCAACAAT GGTTTCGCCT TCCTCCAACA GAACTGGGCG

781 AATAACGCAA AC 792

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）表达产物

<400> 2

1 VFLLASDTID NVNATLSQVQ

21 NILNGSITEA YSLQGQARPG

41 DEQGHEHFGF MDGISNPAVT

61 GFSTPLPGQQ VLDPGLFLLG

81 ESGDLVSRPS WAKDGSFLAF

101 RQLQQRVPEF NAFLVDNALS

121 NPNLTADQNA ELLGARMMGR

141 WKSGAPVDLA PTVDDPVLAA

161 DPQQNNNFNY THPGFDEATD

181 QTHCPFSAHV RKTNPRSDLN

201 PEDTANHIIR AGIPYGPEVT

221 DAENASNVSS TDPSLERGLA

241 FVAYQSDINN GFAFLQQNWA

261 NNAN 264

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG 35

Claims

1.一种香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；

b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；

c.PCR扩增目标基因：

上游引物EcoRⅠ：

5'-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3'

下游引物XhoⅠ：

5'-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3' ；

d.回收纯化DNA片段：

将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化792bpMarker附近的明

显条带，切胶回收DNA片段。

4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C,12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min，再次4˚C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。

5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50 µl： cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture 4 µl、5×PrimeSTAR Buffer 10 µl、2.5 U/µl 的PrimeSTAR HS DNAPolymerase0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。

6.一种如权利要求2所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段编码蛋白在制备抗宫颈癌、抗喉癌、抗氧化或抗衰老药物中的应用。

7.一种如权利要求2所述香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段编码蛋白在染料废水脱色中的应用。