具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步说明,不应理解为对本发明的限制,实施例不包括对传统方法的详细描述,如那些用于构建载体和质粒的方法,将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和筛选、分离和纯化等方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的,并且在许多出版物中都有所描述,包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd edition,Cold spring Harbor Laboratory Press.
本发明实施例中未标明来源的原、辅料均为市售。
thioredoxin-human interleukin-11(Trx/hIL-11)(上海中信国健药业有限公司)Trx-MBL-CLR:按《人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达》(《细胞与分子免疫学杂志》2007 No.23(1)Page:25-7,31蔡学敏、左大明等)中公开的方法制备得到
实施例1牛EK cDNA片段的克隆
取150mg新鲜的牛十二指肠,用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA,取0.5μl总RNA,加入3μl oligo(dT)18 primer引物,补加水至总体积10.5,混匀。室温放置10min,高速离心5min。再依次加入4.0μl 5×逆转录反应缓冲液,0.5μl RNA酶抑制剂,2.0μl 10mMdNTP,2.0μl DTT,1μl MMLV逆转录酶,混匀,置37℃反应120min。取1.5μlRT产物,加入100pmol上游引物(5’-aagcttatggggtcaaagcgaagtgt-3’)和下游引物(5’-gaattctcaatgtagaaaactttgtatcc-3’,参照CenBank中牛Enterokinase的编码序列,序列号:U09859设计引物),2.5μl 10×PCR缓冲液,2μl 2.5mMdNTP,2.5 DMSO,0.25 Taq酶,加水至终体积25μl,混匀后迅速加入5μl的石蜡油进行PCR扩增。反应条件为94℃变性4min;然后进行以下30个循环:94℃变性50s,51℃退火50s。72℃3min;最后在72℃延伸8mim。将cDNA片段电泳,然后按照试剂盒说明书进行胶分离回收。将1μl pMD18-T载体与8μl回收的PCR产物在T-4DNA连接酶的作用下16℃连接过夜,然后转化氯化钙法制备的感受态大肠杆菌DH5a。随机挑取单一白色菌落5个,37℃摇菌过夜,进行质粒提取,以HindIII和EcoRI酶切鉴定,对插入的片段进行全序列测定,筛选出正确插入者,命名为pMD18-T-EK。
实施例2 EKLm的设计及pET39b-EKL和pET39b-EKLm表达质粒的构建
为了提高肠激酶的活性,本申请的发明人参照牛肠激酶轻链与其抑制剂VD
4K-氯甲的复合物的晶体结构(Code no:1EKB,Protein Dtabase Bank),观察以VD
4K为中心5
范围内的氨基酸残基的情况,选择突变后可能增强EKL与DDDDK结合活性的残基,将其突变为R,以增强其与VD
4K中D的结合力。共设计了9个突变体,如图1所示。
以鉴定正确的pMD18-T-EK为模板,PCR再次扩增牛肠激酶轻链编码区cDNA片段,上游引物为:5-gaattcggacgacgacgacaagattgtcggaggaagtgactcc-3’,下游引物为:5’-aagctttcaatgtagaaaactttgtatcc-3’。上游引物带EcoRI酶切位点和肠激酶识别位点,下游引物带HindIII酶切位点和终止密码子。PCR扩增条件为94℃变性4min;然后进行以下30个循环:94℃变性45s,52℃退火45s。72℃延伸1min;最后在72℃延伸7mim。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行回收(方法同前),构建EKL基因。在此基础上,为提高其结合活性,做9个突 变体,突变位点如图1所示,分别定名为EKLm1、EKLm2、EKLm3、EKLm4、EKLm5、EKLm6、EKLm7、EKLm8、EKLm9,将测序正确的突变体基因分别与pET39b质粒用HindIII和EcoRI 37℃双酶切2小时。经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切产物。目的片段及载体按摩尔比4∶1混合,10μl连接体系,1μl T4 DNA连接酶,16℃水浴过夜。连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,挑选重组克隆培养,提取质粒DNA,经HindIII和EcoRI双酶切鉴定正确克隆,分别命名为pET39b-EKL和pET39b-EKLm1, pET39b-EKLm2,pET39b-EKLm3,pET39b-EKLm4,pET39b-EKLm5,pET39b-EKLm6,pET39b-EKLm7,pET39b-EKLm8,pET39b-EKLm9。
实施例3 pET39b-EKL和pET39b-EKLm的诱导表达
pET39b载体上提供的硫氧还蛋白类似物DsbA可以帮助蛋白质正常折叠,从而产生有活性的可溶蛋白。将各工程菌接入LB培养基中。放入摇床在37℃,250rpm条件下过夜培养。将过夜后的种子液加入2YT培养基中,放入摇床在37℃,250rpm条件下培养。当OD600为0.6时,加入0.1mM IPTG进行诱导,放入摇床在30℃,250rpm条件下继续培养。诱导2h后取样,离心去上清,沉淀放入冰箱,然后每过1h取样,同样离心去上清,将沉淀放入冰箱。诱导6h后收瓶,离心去上清。PAGE电泳检测诱导表达情况,以诱导4小时时目的蛋白表达量最高。根据大肠杆菌摇床表达的实验结果将活化的工程菌接入LB培养基中,放入摇床,在37℃,250rpm条件下过夜培养。将过夜后的种子液加入发酵罐中,培养温度37℃,氨水调节pH为7.4,饱和氧气体积分数保持>130%。当OD为8.0时,取样做对照,并加入0.3mM IPTG进行诱导,温度降低至30℃。诱导3h后收罐,离心去上清。
实施例4 EKL及其突变体的复性和纯化
将表达EKL及其突变体的大肠杆菌发酵液离心(8000rpm,10min,4℃)弃上清,用缓冲液(50mMTris-HCl pH8.5)以1.0g菌体:10ml缓冲液悬浮菌体。待完全溶解。然后超声(800w/30s,4-6次)破菌30min,镜检显示菌体完全破开后,离心(12000rpm,15min,4℃)弃上清,收集包涵体沉淀,用于进一步纯化。每克包涵体以8ml溶解液(8M尿素,20mMTris 100mM 2-MT PH8.0)变性溶解,脱盐去除β-MT后稀释复性(至尿素终浓度1M)16℃过夜。脱盐至酶切缓冲液(20mM Tris50mM NaCl 1mM CaCl2 PH 8.75)自切10小时。以STI(特异性胰酶抑制剂,可特异结合EK)亲和层析柱纯化EKL及其突变体。每100g包涵体可复性纯化得到约5-15mg蛋白。
实施例5 EKL及其突变体的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)的测定
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时,反应速度随底物浓度的增加而急骤加快,两者呈正比关系;当底物浓度较高时,反应 速度虽然随着底物浓度的升高而加快,但不再呈正比例加快;当底物浓度增高到一定程度时,如果继续加大底物浓度,反应速度不再增加,说明酶已被底物所饱和。
在酶的浓度不变的情况下,底物浓度对反应速度影响的作用呈现矩形双曲线。见图9。
酶促反应速度与底物浓度之间的变化关系,反映了[ES]的形成与生成产物[P]的过程。在[S]很低时,酶的活性中心没有全部与底物结合,增加[S],[ES]的形成与[P]的生成均呈正比关系增加;当[S]增高至一定浓度时,酶全部形成了[ES],此时再增加[S]也不会增加[ES],反应速度趋于恒定。
为了解释底物浓度与酶促反应速度的关系,1913年Michaelis和Menten把上图归纳为酶促反应动力学最基本的数学表达式---米氏方程Michaelis-Menten:
式中v——反应速度;
Km——米氏常数;
Vmax——酶反应最大速度;
[S]——底物浓度。
在酶学分析中,Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关,与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应,在一定条件下都有其特定的Km值,因此可用于鉴别酶。
米氏常数(Km)的意义:
1.当反应速度为最大速度一半时,米氏方程可以变换如下:
1/2Vmax=Vmax[S]/(Km+[S])
所以 Km=[S]。
因此,Km值等于酶促反应最大速度一半时的底物浓度。
2.Km值可判断酶与底物的亲和力(Km值愈大,酶与底物的亲和力愈小;反之亦然)。
3.Km值是酶的特征性常数,只与酶的结构、酶所催化的底物和酶促反应条件有关,与酶的浓度无关。酶的种类不同,Km值不同,同一种酶与不同底物作用时,Km值也不同。
测定Km、Vmax,一般用作图法求得。作图法有很多,最常用的是Linewaver-Burk作图法,该法是根据米氏方程的倒数形式,以1/v对1/[S]作图,可得到一条直线(见图)。直线在横轴上 的截距为-1/Km,纵截距为1/Vmax,可求出Km与Vmax。
见图10。
Enterokinase活性通过其荧光底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-naphthylamide(Sigma)测定。
多肽底物溶解于含有10%DMSO,70mM Tris-HCl,pH 8.0溶液中。100μL Enterokinase溶液与2.4mL底物溶液混合,室温(25℃),测定单位时间内荧光强度的变化,通过荧光强度的增强检测酶活性,激发波长337nm,检测波长420nm。Km通过Linewaver-Burk作图法计算。
为计算方便,Enterokinase酶解Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-naphthylamide,反应30秒荧光强度增加1,定义为1AU。
反应中,重组牛Enterokinase用量为50nM,底物浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4及0.8mM。结果见表1-4、图4:
表1
|
EKL |
EKLm1 |
EKLm2 |
EKLm3 |
EKLm4 |
EKLm5 |
0.05 |
0.781 |
0.528 |
0.465 |
0.926 |
0.601 |
1.279 |
0.1 |
1.412 |
0.949 |
0.827 |
1.603 |
1.075 |
2.012 |
0.2 |
2.095 |
1.523 |
1.412 |
2.186 |
1.639 |
2.537 |
0.4 |
2.667 |
2.186 |
2.019 |
2.904 |
2.341 |
3.106 |
0.8 |
3.004 |
2.724 |
2.647 |
3.271 |
2.730 |
3.452 |
表2
|
EKLm6 |
EKLm7 |
EKLm8 |
EKLm9 |
R&D |
0.05 |
2.579 |
0.712 |
0.954 |
0.525 |
0.893 |
0.1 |
3.251 |
1.140 |
1.577 |
0.983 |
1.515 |
0.2 |
3.426 |
1.685 |
2.210 |
1.684 |
2.164 |
0.4 |
3.705 |
2.374 |
2.876 |
2.379 |
2.784 |
0.8 |
3.792 |
2.793 |
3.365 |
2.780 |
3.129 |
表3
|
EKL |
EKLm1 |
EKLm2 |
EKLm3 |
EKLm4 |
EKLm5 |
回归方程 |
Y=0.0509 x+0.2403 |
Y=0.0816 x+0.2532 |
Y=0.0949 x+0.2528 |
Y=0.0412 x+0.2429 |
Y=0.0696x +0.2604 |
Y=0.0260 x+0.2556 |
横轴截距 (-1/Km) (mM-1) |
-4.7210 |
-3.1029 |
-2.6639 |
-5.8956 |
-3.7414 |
-9.8308 |
Km(mM) |
0.2118 |
0.3223 |
0.3754 |
0.1696 |
0.2673 |
0.1017 |
纵轴截距 (1/Vmax) (AU-1) |
0.2403 |
0.2532 |
0.2528 |
0.2429 |
0.2604 |
0.2556 |
Vmax
(AU) |
4.1615 |
3.9494 |
3.9557 |
4.1169 |
3.8402 |
3.9124 |
表4
|
EKLm6 |
EKLm7 |
EKLm8 |
EKLm9 |
R&D |
回归方程 |
Y=0.0065 x+0.2539 |
Y=0.0559 x+0.2973 |
Y=0.0399 x+0.2471 |
Y=0.0836 x+0.211 |
Y=0.0429x+0.251 9 |
横轴截距 (-1/Km) (mM-1) |
-39.0615 |
-5.3184 |
-6.1930 |
-2.5239 |
-5.8718 |
Km(mM) |
0.0256 |
0.1880 |
0.1615 |
0.3962 |
0.1703 |
纵轴截距 (1/Vmax) (AU-1) |
0.2539 |
0.2973 |
0.2471 |
0.211 |
0.2519 |
Vmax
(AU) |
3.9386 |
3.3636 |
4.0469 |
4.7393 |
3.9698 |
结论:
野生型EKL的Km及Vmax与R&D同类产品相似,9个突变体中,EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的Km与野生型相比均有不同程度的下降(EKLm3、EKLm5、EKLm6、EKLm7和EKLm8的氨基酸序列经过测序分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16),其中以EKLm6的Km值降低最为显著,即EKLm6具有与底物最佳的亲和力。
实施例6 pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白表达质粒的构建
由于大肠杆菌表达系统获得的肠激酶轻链包涵体产物复性困难,因此活性蛋白的得率极低。为了尽可能提高EKL活性蛋白的产量,在采用pET39b表达载体的基础上,分别选取肠激酶重链EKH的各结构域与EKL经一个10肽的柔性Linker(核苷酸序列见SEQ ID NO.11,氨基酸序列见SEQ ID NO.12)相连构成融合蛋白,通过对各融合蛋白的复性情况及活性测定筛选最优化的融合蛋白结构,具体实验方法如下。
以鉴定正确的pMD18-T-EK为模板,再次PCR扩增牛肠激酶重链结构域5及以pET39b-EKLm6(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列)为模板扩增轻链编码区DNA片段,重链第5结构域上游引物为5’-gaattcggacgacgacgacaagcgtctcttcaatggcacg-3’,下游引物为5’cccaccgcctgagcctccaccgccgtagaaacattgtagcag-3’,轻链编码区上游引物为5-‘gaggctcaggcggtgggggttctattgtcggaggaagtgactc-3’,轻链下游引物为5’-aagctttcaatgtagaaaactttgtatcc-3’。重链第5结构域上游引物带有EcoRI酶切位点和肠激酶识别位点,轻链下游引物带HindIII酶切位点和终止密码子。重链第5结构域下游引物和轻链编码区上游引物重叠PCR扩增条件为94℃预变性4min;然后94℃变性45秒、55℃退火1min、72℃1min,进行30个循环;最后在72℃延伸7min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收,用overlap PCR的方法连接,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收,与pET39b质粒DNA分别用HindIII和EcoRI于37℃酶切2hr。1×TAE,0.8%琼脂糖凝胶电泳,分别回收酶切产物。处理后的插入片段及载体按摩尔比4∶1混合,10μL连接体系,1μl T4DNA连接酶,16℃水浴过夜。连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,挑选重组克隆培养,提取质粒DNA,经HindIII和EcoRI双酶切鉴定正确重组克隆,命名为pET39b/EKH5-EKLm6。用同样的方法构建牛肠激酶重链结构域1、3、4(重链各结构域引物如下:重链第1结构域上游引物为5’-gaattcggacgacgacgacaagccacctgattcaaggctgtg-3’,下游引物为5’cccaccgcctgagcctccaccgcc agctgtggcacaagttttattg-3’;重链第3结构域上游引物为5’-gaattcggacgacgacgacaagtgtggagggcctcatgacc-3’,下游引物为5’cccaccgcctgagcctccaccgcc atagccagtagtgaaatttgc-3’;重链第4结构域上游引物为5’-gaattcggacgacgacgacaagaaggaagacaattttcagtg-3’,下游引物为5’cccaccgcctgagcctccaccgcc acagtgtgcttcatctgagc-3’。轻链引物同前)与EKLm6的融合蛋白 表达质粒,分别命名为pET39b/EKH1-EKLm6、pET39b/EKH3-EKLm6、pET39b/EKH4-EKLm6。SEQID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了EKH1-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6分别显示了EKH3-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别显示了EKH4-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10分别显示了EKH5-EKLm6的核苷酸序列和氨基酸序列。
实施例7 pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白的诱导表达
方法同实施例3,分别诱导表达EKH1-EKLm6、EKH3-EKLm6、EKH4-EKLm6、EKH5-EKLm6。
实施例8 pET39b/EKH-EKLm6融合蛋白的复性和纯化
方法同实施例4,结果如表5所示,每100g EKH5-EKLm6包涵体可复性纯化得到113.8mg蛋白,其得率较EKL、EKLm6、EKH1-EKLm6、EKH3-EKLm6和EKH4-EKLm6有显著提高。
表5
重组蛋白 |
纯蛋白获得量mg/百克包涵体 |
EKL |
10.4 |
EKLm6 |
9.8 |
EKH1-EKLm6 |
7.6 |
EKH3-EKLm6 |
12.6 |
EKH4-EKLm6 |
9.5 |
EKH5-EKLm6 |
113.8 |
实施例9 EKL和EKLm蛋白在毕赤酵母中的表达
将pET39b-EKL和pET39b-EKLm(1-9)中的目的基因以BamHI和EcoRI酶切,装入同酶切的pPICZαA(Invitrogen)质粒中。连接产物转化CaCl2法制备的TOP10F感受态细胞,挑选重组克隆培养,提取质粒DNA,经BamHI和EcoRI双酶切鉴定正确重组克隆,分别命名为pPICZαA-EKL和pPICZαA-EKLm(1-9)。随后提取的质粒线性化,转化感受态酵母细胞GS115(Invitrogen公司),RDB平板初步筛选,得到阳性重组子。将活化的工程菌分别接种于YPD和BMGY培养基中,放入摇床在30℃、250rpm条件下过夜培养。将过夜培养后的种子液倒回原BMGY培养基中,旗人摇床,在30℃、250rpm条件下培养48h。补加无水甲醇诱导,至终浓度为0.5%。甲醇诱导后每隔12h取样,检查肠激酶表达情况,并补加无水甲醇,至终浓度为0.5%。诱导72h后收瓶,对所取样品进行分析。同时在全自动30L发酵罐中按装量10L的水平进行了探索性培 养和发酵。将工程菌接种于1L YPD(分2瓶装)培养基中,放入摇床在30℃、250rpm条件下培养。当‰为5.0且镜检菌种形态合格时,转入到发酵罐中。培养温度30℃,氨水调节pH5.0,饱和氧气体积分数保持不低于20%。发酵过程中依据菌体生长密度添加高压灭菌后的50%甘油。当菌体密度达OD为200~250时加入无水甲醇诱导,控制其终浓度不超过1%,此时pH值控制在3.0。诱导后每12h取样,测OD和菌体湿重,并测定活性。诱导72h后收罐,离心取上清,准备纯化。
实施例10毕赤酵母中表达的EKL和EKLm蛋白的纯化
收集上清,经milipore超滤膜超滤浓缩,将上一步获得的浓缩液用1M的NaOH调pH8.0后,经Chelating Sepharose Fast Flow柱纯化。先用缓冲液(25mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.3M NaCl)冲洗平衡柱子,将pH8.0的浓缩液上样,流速为4cm/min,收集穿透液。上样后用平衡液冲洗至基线,用洗脱A液(25mMTris-HCl pH8.0,50mmol/L咪唑)洗脱蛋白,收集洗脱峰1,再用洗脱B液(25mMTris-HCl pH8.0,200mmol/L咪唑)洗脱蛋白,收集洗脱峰2,SDS-PAGE检测,结果见表6。
表6
重组蛋白 |
纯蛋白获得量mg/L发酵液 |
EKL |
3.7 |
EKLm1 |
2.5 |
EKLm2 |
4.9 |
EKLm3 |
2.1 |
EKLm4 |
3.4 |
EKLm5 |
4.2 |
EKLm6 |
10.3 |
EKLm7 |
3.8 |
EKLm8 |
4.5 |
EKLm9 |
3.9 |
实施例11 pET39b/EKLm6,pET39b/EKH-EKLm6,pPICZαA-EKLm6的活性测定材料:
分析缓冲液:50mM Tris,pH 7.5;
重组牛Enterokinase:本发明制备;
底物:thiobenzyl benzyloxycarbonyl-L-lysinate(Z-Lys-SBzl)(Bachem Catalog#M-1300);5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)(Sigma Catalog#D-8130);
96孔酶标板(Costar,Catalog#92592);
酶标仪(SpectraMax Plus,Molecular Devices);
重组牛肠激酶4139-SE,R&D公司产品
方法:
用分析缓冲液将重组牛Enterokinase稀释至0.04μg/mL;
用含有200μM DTNB的分析缓冲液将Z-Lys-SBzl稀释至200μM;
96孔板中加入重组牛Enterokinase稀释液,50μL/孔,空白对照孔加入分析缓冲液,50μL/孔;
每孔加入50μL Z-Lys-SBzl/DTNB混合液开始反应;
以动力学模式读取A405nm,共5分钟;
计算重组牛Enterokinase特异活性:
96孔板中酶及底物终浓度(量)
重组牛Enterokinase:2ng
重组牛肠激酶4139-SE:2ng
DTNB:100μM
底物:Z-Lys-SBz:100μM
A405/min=(V酶max-V空白max)(mOD/min)/校正因子cm/1000
活性(nmole/min/μg)={[A405/min(按上式计算得到)×体积(0.0001L)]/[消光系数(13260M-1cm-1)×酶量(μg)]}×109
结果见表7:
表7
|
EKL
(E.coli) |
EKLm6
(E.coli) |
EKH5-EKLm6
(E.coli) |
EKLm6
(yeast) |
重组牛肠 激酶
4139-SE |
V酶max |
14 |
119 |
102 |
241 |
13 |
V空白max |
2 |
7 |
6 |
8 |
2 |
V酶max-V空白max |
12 |
112 |
96 |
233 |
11 |
活性 |
45.2 |
422.3 |
362.0 |
878.6 |
41.5 |
结论:
野生型EKL活性与R&D同类产品相似,而大肠肝菌表达的EKLm6、EKH5-EKLm6活性较野生型提高了10倍左右,酵母表达的EKLm6活性是大肠杆菌表达的相同蛋白的2倍。
实施例12:反应温度对酶切thioredoxin融合蛋白thioredoxin-human interleukin-11(Trx/hIL-11)的影响实验
含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白thioredoxin-human interleukin-11(Trx/hIL-11)(以下均称Trx/hIL-11)以20μg与2ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mM CaCl2,及0.1%Tween 20,反应体积20μL,酶切温度分别为10℃、20℃及30℃,反应20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。
SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在20℃具有最佳的酶切活力(见图5)
实施例13:反应时间对酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hIL-11的影响实验
含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白thioredoxin-human interleukin-11(Trx/hIL-11)以20μg与2ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mM CaCl2,及0.1%Tween 20,反应体积20μL,反应温度为20℃,反应时间分别为5hr、10hr、20hr及40hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。
SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在20℃酶切Trx/hIL-11,20hr可酶切完全(见图6)。
实施例14:酶切thioredoxin融合蛋白Trx/hIL-11的最适比例
含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白thioredoxin-human interleukin-11(Trx/hIL-11)以20μg与0,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64及1.28ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mM CaCl2,及0.1%Tween 20,反应体积20μL,反应条件20℃×20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。
SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在20℃酶切Trx/hIL-11,反应20hr,在酶∶底物=1∶20000(m∶m)(质量比以下同)即可酶切完全(见图7)。
实施例15:EKH5-EKLm6的稳定性检测
EKH5-EKLm6模拟在实际保存过程中可能遭遇的不利条件,而后检测其酶切Trx/hIL-11的能力,以20μg与1.28ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mM CaCl2,及 0.1%Tween 20,反应体积20μL,反应条件20℃×20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。拟保存条件下留样考察:-20℃,保存6个月;
反复冻融:-20℃及37℃反复3次;
高温:37℃放置1、3、5、7、10天。
SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在上述保存条件下,对酶切活性没有显著影响(见图8)。
实验例16反应温度对酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影响实验
含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20μg与2ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mM CaCl2及0.1%Tween 20,反应体积20μL,酶切温度分别为10℃、20℃及30℃,反应20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。结果见图11SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在20℃具有最佳的酶切活力。
实施例17反应时间对酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的影响实验
含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20μg与2ngEKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl (pH 8.0),1mM CaCl2,及0.1%Tween 20,反应体积20μL,反应温度为20℃,反应时间分别为5hr、10hr、20hr及40hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。结果见图12
SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在20℃酶切Trx-MBL-CLR,20hr可酶切完全。
实施例18酶切thioredoxin融合蛋白Trx-MBL-CLR的最适比例实验
含有enteropeptidase酶切位点(DDDDK)的融合蛋白Trx-MBL-CLR以20μg与0,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64及1.28ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mMCaCl2,及0.1%Tween 20,反应体积20μL,反应条件20℃×20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。结果见图13
SDS-PAGE结果显示,EKH5-EKLm6在20℃酶切Trx-MBL-CLR,反应20hr,在酶∶底物=1∶20000(m∶m)即可酶切完全。
实施例19 EKH5-EKLm6的稳定性检测
EKH5-EKLm6模拟在实际保存过程中可能遭遇的不利条件,而后检测其酶切Trx-MBL-CLR的能力,以20μg与1.28ng EKH5-EKLm6反应,反应体系为0.1M Tris-HCl(pH 8.0),1mM CaCl2,及0.1%Tween 20,反应体积20μL,反应条件20℃×20hr。反应产物利用SDS-PAGE进行检测。拟保存条件下留样考察:-20℃,保存6个月;
反复冻融:-20℃及37℃反复3次;
高温:37℃放置1、3、5、7、10天。
SDS-PAGE结果见图14,结果显示,EKH5-EKLm6在上述保存条件下,对酶切活性没有显著影响。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>上海张江生物技术有限公司
<120>重组牛肠激酶轻链突变体
<130>CN0111370.3
<150>200710040551.0
<151>2007-05-11
<150>200710040552.5
<151>2007-05-11
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<170>PatentIn version 3.4
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<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>轻链突变体核苷酸序列
<400>1
attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60
gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120
cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180
atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240
aacccacact acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300
aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360
cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac ttatatatca aggttctact 420
gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480
atgccagaac gtaacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctatgaagc aggaggggta 540
gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600
ctggctggcg tgacgtcatt tggacgtcaa tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660
gcccgggtcc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacat 705
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<223>轻链突变体氨基酸序列
<400>2
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
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Met Pro Glu Arg Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Arg Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
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<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH1-EKLm6核苷酸序列
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ccacctgatt caaggctgtg tgctgatgct ctaaagtgca tagcaattga tttattttgt 60
gatggagaat taaactgtcc agatggctct gatgaagaca ataaaacttg tgccacagct 120
ggcggtggag gctcaggcgg tgggggttct attgtcggag gaagtgactc cagagaagga 180
gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg 240
gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg 300
tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat atggcatcaa atctgacttc tcctcagata 360
gaaactaggt tgattgacca aattgtcata aacccacact acaataaacg gagaaagaac 420
aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg aaagtgaact acacagatta tatacagcct 480
atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc 540
tggggggcac ttatatatca aggttctact gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc 600
cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag atgccagaac gtaacattac ggaaaatatg 660
gtgtgtgcag gctatgaagc aggaggggta gattcttgtc agggggattc aggcggacca 720
ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc ctggctggcg tgacgtcatt tggacgtcaa 780
tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat gcccgggtcc caaggttcac agagtggata 840
caaagttttc tacat 855
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<213>Unknown
<220>
<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH1-EKLm6氨基酸序列
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Pro Pro Asp Ser Arg Leu Cys Ala Asp Ala Leu Lys Cys Ile Ala Ile
1 5 10 15
Asp Leu Phe Cys Asp Gly Glu Leu Asn Cys Pro Asp Gly Ser Asp Glu
20 25 30
Asp Asn Lys Thr Cys Ala Thr Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp
50 55 60
Val Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu
65 70 75 80
Val Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg
85 90 95
Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala
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Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile
115 120 125
Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala
130 135 140
Met Met His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro
145 150 155 160
Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys
165 170 175
Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp
180 185 190
Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln
195 200 205
Gln Gln Met Pro Glu Arg Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly
210 215 220
Tyr Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
225 230 235 240
Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser
245 250 255
Phe Gly Arg Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg
260 265 270
Val Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
275 280 285
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<213>Unknown
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<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH3-EKLm6基因序列
<400>5
tgtggagggc ctcatgacct gtgggagcca aatacaacat tcacgtctat aaacttccca 60
aacagctacc ctaatcaggc tttctgtatt tggaatttaa atgcacaaaa gggaaaaaat 120
attcagctcc actttcaaga atttgacctg gaaaatattg cagatgtagt tgaaatcaga 180
gatggtgaag gagatgattc cttgttctta gctgtgtaca caggccctgg tccagtaaac 240
gatgtgttct caaccaccaa ccgaatgact gtgcttttta tcactgataa tatgctggca 300
aaacagggat ttaaagcaaa tttcactact ggctatggcg gtggaggctc aggcggtggg 360
ggttctattg tcggaggaag tgactccaga gaaggagcct ggccttgggt cgttgctctg 420
tatttcgacg atcaacaggt ctgcggagct tctctggtga gcagggattg gctggtgtcg 480
gccgcccact gcgtgtacgg gagaaatatg gagccgtcta agtggaaagc agtgctaggc 540
ctgcatatgg catcaaatct gacttctcct cagatagaaa ctaggttgat tgaccaaatt 600
gtcataaacc cacactacaa taaacggaga aagaacaatg acattgccat gatgcatctt 660
gaaatgaaag tgaactacac agattatata cagcctattt gtttaccaga agaaaatcaa 720
gtttttcccc caggaagaat ttgttctatt gctggctggg gggcacttat atatcaaggt 780
tctactgcag acgtactgca agaagctgac gttccccttc tatcaaatga gaaatgtcaa 840
caacagatgc cagaacgtaa cattacggaa aatatggtgt gtgcaggcta tgaagcagga 900
ggggtagatt cttgtcaggg ggattcaggc ggaccactca tgtgccaaga aaacaacaga 960
tggctcctgg ctggcgtgac gtcatttgga cgtcaatgtg cactgcctaa tcgcccaggg 1020
gtgtatgccc gggtcccaag gttcacagag tggatacaaa gttttctaca t 1071
<210>6
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<212>PRT
<213>Unknown
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<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH3-EKLm6氨基酸序列
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Cys Gly Gly Pro His Asp Leu Trp Glu Pro Asn Thr Thr Phe Thr Ser
1 5 10 15
Ile Asn Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Asn Gln Ala Phe Cys Ile Trp Asn
20 25 30
Leu Asn Ala Gln Lys Gly Lys Asn Ile Gln Leu His Phe Gln Glu Phe
35 40 45
Asp Leu Glu Asn Ile Ala Asp Val Val Glu Ile Arg Asp Gly Glu Gly
50 55 60
Asp Asp Ser Leu Phe Leu Ala Val Tyr Thr Gly Pro Gly Pro Val Asn
65 70 75 80
Asp Val Phe Ser Thr Thr Asn Arg Met Thr Val Leu Phe Ile Thr Asp
85 90 95
Asn Met Leu Ala Lys Gln Gly Phe Lys Ala Asn Phe Thr Thr Gly Tyr
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp
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Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser
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Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys
165 170 175
Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile
180 185 190
Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys
195 200 205
Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Met Lys Val
210 215 220
Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln
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Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu
245 250 255
Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro
260 265 270
Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met Pro Glu Arg Asn Ile
275 280 285
Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser
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Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg
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Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Arg Gln Cys Ala Leu Pro
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Gln Ser Phe Leu His
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<213>Unknown
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<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH4-EKLm6基因序列
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aaggaagaca attttcagtg caaggatggg gagtgtattc cgctggtgaa tctctgtgac 60
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gtgtcggccg cccactgcgt gtacgggaga aatatggagc cgtctaagtg gaaagcagtg 300
ctaggcctgc atatggcatc aaatctgact tctcctcaga tagaaactag gttgattgac 360
caaattgtca taaacccaca ctacaataaa cggagaaaga acaatgacat tgccatgatg 420
catcttgaaa tgaaagtgaa ctacacagat tatatacagc ctatttgttt accagaagaa 480
aatcaagttt ttcccccagg aagaatttgt tctattgctg gctggggggc acttatatat 540
caaggttcta ctgcagacgt actgcaagaa gctgacgttc cccttctatc aaatgagaaa 600
tgtcaacaac agatgccaga acgtaacatt acggaaaata tggtgtgtgc aggctatgaa 660
gcaggagggg tagattcttg tcagggggat tcaggcggac cactcatgtg ccaagaaaac 720
aacagatggc tcctggctgg cgtgacgtca tttggacgtc aatgtgcact gcctaatcgc 780
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<212>PRT
<213>Unknown
<220>
<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH4-EKLm6氨基酸序列
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Lys Glu Asp Asn Phe Gln Cys Lys Asp Gly Glu Cys Ile Pro Leu Val
1 5 10 15
Asn Leu Cys Asp Gly Phe Pro His Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Ala
20 25 30
His Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Gly Gly
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Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu Tyr Phe
50 55 60
Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp Trp Leu
65 70 75 80
Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro Ser Lys
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Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn Leu Thr Ser Pro
100 105 110
Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn Pro His Tyr
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Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Met
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Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu
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Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly
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Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu Ala Asp
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Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met Pro Glu Arg
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Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly Gly Val
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<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH5-EKLm6基因序列
<400>9
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tggcatgtag cctgtgccga gaactggaca acccagatct cagatgatgt gtgtcagctg 120
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tctattgtcg gaggaagtga ctccagagaa ggagcctggc cttgggtcgt tgctctgtat 360
ttcgacgatc aacaggtctg cggagcttct ctggtgagca gggattggct ggtgtcggcc 420
gcccactgcg tgtacgggag aaatatggag ccgtctaagt ggaaagcagt gctaggcctg 480
catatggcat caaatctgac ttctcctcag atagaaacta ggttgattga ccaaattgtc 540
ataaacccac actacaataa acggagaaag aacaatgaca ttgccatgat gcatcttgaa 600
atgaaagtga actacacaga ttatatacag cctatttgtt taccagaaga aaatcaagtt 660
tttcccccag gaagaatttg ttctattgct ggctgggggg cacttatata tcaaggttct 720
actgcagacg tactgcaaga agctgacgtt ccccttctat caaatgagaa atgtcaacaa 780
cagatgccag aacgtaacat tacggaaaat atggtgtgtg caggctatga agcaggaggg 840
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<223>重组牛肠激酶重链结构域-轻链突变体融合蛋白EKH5-EKLm6氨基酸序列
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Arg Leu Phe Asn Gly Thr Thr Asp Ser Ser Gly Leu Val Gln Phe Arg
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Ile Gln Ser Ile Trp His Val Ala Cys Ala Glu Asn Trp Thr Thr Gln
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Ile Ser Asp Asp Val Cys Gln Leu Leu Gly Leu Gly Thr Gly Asn Ser
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Ser Val Pro Thr Phe Ser Thr Gly Gly Gly Pro Tyr Val Asn Leu Asn
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Glu Asp Ser Leu Ile Leu Leu Gln Cys Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala
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Trp Pro Trp Val Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly
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130 135 140
Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu
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His Met Ala Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile
165 170 175
Asp Gln Ile Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn
180 185 190
Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr
195 200 205
Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly
210 215 220
Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser
225 230 235 240
Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu
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Lys Cys Gln Gln Gln Met Pro Glu Arg Asn Ile Thr Glu Asn Met Val
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Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
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Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly
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<223>牛肠激酶轻链突变体EKLm3氨基酸序列
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<223>牛肠激酶轻链突变体EKLm5氨基酸序列
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<223>牛肠激酶轻链突变体EKLm7氨基酸序列
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<223>牛肠激酶轻链突变体EKLm8氨基酸序列
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