CN1332248A - 黄牛肠激酶催化亚基基因及其基因工程生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物工程技术领域,所述黄牛肠激酶催化亚基的基因:1.该基因编码了黄牛肠激酶的催化亚基,它具有肠激酶的丝氨酸蛋白酶识别和切割特定氨基酸序列的活性;2.该基因可以通过从牛肠道组织中用基因克隆技术获得;3.该黄牛肠激酶催化亚基可以通过基因工程方法生产制备;4.它能够作为蛋白酶特异性地识别并切割含肠激酶切割位点的底物,其应用之一是作为工具蛋白酶用于重组融合蛋白质的特异性断裂,尤其适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
Description
一、技术领域
本发明属生物工程技术领域。
二、背景技术
基因工程中的融合表达，即将所要表达的目标蛋白质和一些具有特定生化性质的融合蛋白或短肽标签，如大肠杆菌硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、金黄色葡萄球菌蛋白A、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白或六组氨酸短肽等融合、构成为一个蛋白质进行表达、生产。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性质，融合表达能大大简化、方便产物的检测，性质研究和分离纯化，因此目前在基因工程中，从原核表达体系(如大肠杆菌)到真核表达体系(如哺乳动物细胞)都经常采用融合表达方法进行重组目标蛋白质的生产。但这同时也带来了新的问题，即融合蛋白的特异性去除问题。当重组蛋白质作为基因工程药品及其它一些用途时，目标产物必须是像天然蛋白质一样的完整产物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表达产物必须进行产物后加工：即融合蛋白在体外实施特定氨基酸序列的切割或断裂，才能获得完整的目标产物。目前最为常用的裂解方法为：1.化学法：用溴化氢断裂；2.蛋白酶法：用凝血酶，活化的X因子或肠激酶特异性裂解。由于溴化氰为剧毒化合物，而且其切割识别位点为Met，因此实用性不强。而用蛋白酶进行切割时，要求工具蛋白酶：1.能够识别并裂解特定的的氨基酸序列，而且要求特异性好；2.为避免杂质蛋白酶引发的不必要的裂解反应发生，需要高纯度的工具蛋白酶。目前国际上最常用的工具蛋白酶为：凝血酶(识别位点：Leu-Val-Pro-Arg↓Gly--Ser)，因子Xa(识别位点：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓)和肠激酶(识别位点：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)，其中肠激酶和Xa切割后的产物和天然产物完全一致，而凝血酶切割后的产物比天然产物分别多二个氨基酸。目前使用的这些蛋白酶都是从天然来源(动物血液或肠)分离、纯化的，得率低，纯度高，因此价格昂贵，而且全部为进口产品，因此在大规模生产运用时，无疑会大大增加成本，而且由于痕量天然杂质蛋白酶的存在，会导致产物的降解。因此用基因工程方法生产这些工具蛋白酶已成为生物工程制药业及基因工程研究人员的急需。用基因工程方法生产肠激酶不仅能极大地降低成本，而且有效去除杂质蛋白酶、提高纯度，这一点对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员尤为重要，因为国内使用的这些工具蛋白酶全部来源于进口。
在凝血酶，因子Xa，肠激酶中，凝血酶和因子Xa都需要经其它凝血反应中的蛋白酶激活(从无活性的单链形式转变为有活性的单链形式)后，才具有蛋白酶活性，而且分子量大、结构复杂，因此不利于用基因工程方法作为工具酶生产。而牛肠激酶为一异二聚体(在人则为异三聚体)的丝氨酸蛋白酶，体内主要产生部位为十二指肠，主要生理作用是将胰蛋白酶原转变为胰蛋白酶，它具有切割特异性好，裂解产物与天然产物一致(不残留任何识别序列氨基酸)，温度及PH适应范围宽，稳定性好，而且科学家们已知：其轻链(即小亚基)为催化亚基，分离的轻链即具有肠激酶的酶活性和特异性。因此用基因工程方法生产肠激酶催化亚基，成为最为可行和简便的生产工具蛋白酶的路线和方法。
三、发明内容
本发明专利的目的是克隆黄牛十二指肠肠激酶催化亚基cDNA，并在大肠杆菌中实现黄牛肠激酶催化亚基的高效表达和分离、纯化，使之达到可以实际应用的水平，为基因工程下游过程中重组融合蛋白质的切割提供一个有效、价廉的工具酶，本发明具有重要的实用意义，尤其是对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员具有重要的实用价值。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
从新鲜的小黄牛十二指肠中提取RNA，用含多聚T逆转录引物和逆转录酶，进行逆转录反应，合成cDNA。设计含兼并碱基的引物，以所合成的cDNA为模板，进行PCR反应，将所获得的编码黄牛肠激酶催化亚基的基因克隆在质粒中，进行DNA序列分析。其DNA序列及氨基酸序列如下：
ATT GTC GGA GGA AGT GAC TCC AGA GAA GGA GCC TGG CCT TGG GTC GTT
TAA CAG CCT CCT TCA CTG AGG TCT CTT CCT CGG ACC GGA ACC CAG CAA
I V G G S D S R E G A W P W V V
CCT CTG TAT TTC GAC GAT CAA CAG GTC TGC GGA GCT TCT CTG GIG AGC
CGA GAC ATA AAG CTG CTA GTT GTC OAG ACG CCT CGA AGA GAC CAC TCG
A L Y F D D Q Q V C G A S L V S
AGG GAT TGG CTG GTG TCG GCC GCC CAC TGC GTG TAC GGG AGA AAT ATG
TCC CTA ACC GAC CAC AGC CGG CGG GTG ACG CAC ATG CCC TCT TTA TAC
R D W L V S A A H C V Y G R N M
GAG CCG TCT AAG TGG AAA GCA GTG CTA GGC CTG CAT ATG GCA TCA AAT
CTC GGC AGA TTC ACC TTT CGT CAC GAT CCG GAC GTA TAC CGT AGT TTA
E P S K W K A V L G L H M A S N
CTG ACT TCT CCT CAG ATA GAA ACT AGG TTG ATT GAC CAA ATT GTC ATA
GAC TGA AGA GGA GTC TAT CTT TGA TCC AAC TAA CTG GTT TAA CAG TAT
L T S P Q I E T R L I D Q I V I
AAC CCA CAC TAC AAT AAA CGG AGA AAG AAC AAT GAC ATT GCC ATG ATG
TTG GGT GTG ATG TTA TTT GCC TCT TTC TTG TTA CTG TAA CGG TAC TAC
N P H Y N K R R K N N D I A M M
CAT CTT GAA ATG AAA GTG AAC TAC ACA GAT TAT ATA CAG CCT ATT TGT
GTA GAA CTT TAC TTT CAC TTG ATG TGT CTA ATA TAT GTC GGA TAA ACA
H L E M K V N Y T D Y I Q P I C
TTA CCA GAA GAA AAT CAA GTT TTT CCC CCA GGA AGA ATT TGT TCT ATT
AAT GGT CTT CTT TTA GTT CAA AAA GGG GGT CCT TCT TAA ACA AGA TAA
L P E E N Q V F P P G R I C S I
GCT GGC TGG GGG GCA CTT ATA TAT CAA GGT TCT ACT GCA GAC GTA CTG
CGA CCG ACC CCC CGT GAA TAT ATA GTT CCA AGA TGA CGT CTG CAT GAC
A G W G A L I Y Q G S T A D V L
CAA GAA GCT GAC GTT CCC CTT CTA TCA AAT GAG AAA TGT CAA CAA CAG
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Q E A D V P L L S N E K C Q Q Q
ATG CCA GAA TAT AAC ATT ACG GAA AAT ATG GTG TGT GGA GGC TAT GAA
TAC GGT CTT ATA TTG TAA TGC CTT TTA TAC CAC ACA CGT CCG ATA CTT
M P E Y N I T E N M V C A G Y E
GCA GGA GGG GTA GAT TCT TGT CAG GGG GAT TCA GGC GGA CCA CTC ATG
CGT CCT CCC CAT CTA AGA ACA GTC CCC CTA AGT CCG CCT GGT GAG TAC
A G G V D S C Q G D S G G P L M
TGC CAA GAA AAC AAC AGA TGG CTC CTG GCT GGC GTG ACG TCA TTT GGA
ACG GTT CTT TTG TTG TCT ACC GAG GAC CGA CCG CAC TGC AGT AAA CCT
C C E N N R W L L A G V T S F G
TAT CAA TGT GCA CTG CCT AAT CGC CCA GGG GTG TAT GCC CGG GTC CCA
ATA GTT ACA CGT GAC GGA TTA GCG GGT CCC CAC ATA CGG GCC CAG GGT
Y Q C A L P N R P G V Y A R V P
AGG TTC ACA GAG TGG ATA CAA AGT TTT CTA CAT TAG
TCC AAG TGT CTC ACC TAT GTT TCA AAA GAT GTA ATC
R F T E W I Q S F L H *
经序列分析后的黄牛肠激酶催化亚基基因克隆在商业化表达载体pET32a的BamHI和EcoRI位点之间，转化菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，上清中的表达产物经过硫酸铵沉淀和柱层析等分离纯化，最终获得具有肠激酶生物活性的重组黄牛肠激酶催化亚基产物。该重组黄牛肠激酶催化亚基能够用作为重组融合蛋白质特异性切割的一种有效、价廉的工具酶。
本发明同已有的商业化的肠激酶不同之处在于，本发明克隆了黄牛的肠激酶催化亚基基因，通过基因工程方法生产并获得具有肠激酶生物活性的重组黄牛肠激酶催化亚基，分子量低，但保留了肠激酶的丝氨酸蛋白酶的活性；而现有的商业化的肠激酶皆为从天然牛肠道中提取获得的全酶，分离、纯化困难，得率低，价格昂贵。而且由于牛肠道中有许多性质类似的丝氨酸蛋白酶存在，因此很难免有痕量天然杂质蛋白酶的存在，这些杂质蛋白酶在长时间作用时会导致目标产物的降解，降低目标产物的收率，并增加副产物。
本发明的用途能够作为蛋白酶特异性地识别并切割含肠激酶切割位点的底物，具有高效、价廉的特点，能够作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
四、附图说明
图1.重组黄牛肠激酶催化亚基表达产物SDS-PAGE分析图谱。
1.分子量标准蛋白质；
2.未诱导的pET32/BL21(DE3)菌体总蛋白；
3.经IPTG诱导的pET32/BL21(DE3)菌体总蛋白；
4.未诱导的pET32-EK/BL21(DE3)菌体总蛋白；
5.经IPTG诱导的pET32-EK/BL21(DE3)菌体总蛋白；
6.经IPTG诱导表达的pET32-EK/BL21(DE3)裂解上清液；
7.经IPTG诱导表达的pET32-EK/BL21(DE3)裂解沉淀；
8.纯化后的重组黄牛肠激酶催化亚基。
图2.重组黄牛肠激酶催化亚基酶反应动力学分析
五、具体实施方式
1.取100毫克新鲜的小黄牛十二指肠与1毫升Trizol混合，碾磨粉碎后，室温放置5分钟，加200微升氯仿，混合振摇30秒，11000转/分钟离心15分钟，吸取水相，加0.5毫升异丙醇，室温放置10分钟，弃上清，沉淀部分用1毫升75％乙醇洗涤，7500转/分钟离心5分钟后，将RNA沉淀在空气中干燥，然后溶于30微升DEPC处理过的水中。
2.合成逆转录引物[5’taatacgactcactataggg(t)173’]，以上述RNA为模板，用AMV逆转录酶进行逆转录反应。
3.合成下述PCR引物：
引物1∶5’cgggatccacattgttgg(t/a)gg(t/a)tctgactccgag 3’；
引物2∶5’taatacgactcactataggg 3’；
引物3∶5’ggaattctaatgtagaaaactttgtatccactctgt 3’
以步骤2.中的逆转录产物为模板，以引物1和引物2为PCR引物，用高保真pfu DNA聚合酶进行第一轮PCR反应。以获得的PCR产物为模板，以引物1和引物3为PCR引物进行第二轮PCR反应，将所获得的PCR产物经BamHI和EcoRI消解，克隆在质粒pET32a的BamHI和EcoRI位点之间。获得的阳性克隆进行DNA序列分析测定。
4.获得的阳性克隆转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE(分离胶12％，浓缩胶为5％，考马斯亮蓝R250染色)(见附图1)。表达菌体经超声破碎细胞，离心分离细胞裂解上清液。裂解上清液中的表达产物经过30％硫酸铵沉淀，将沉淀溶于20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl缓冲液中，对20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl缓冲液透析后，进行DEAE-纤维素柱层析，用20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl缓冲液洗脱杂蛋白，用0.1M-0.5M NaCl线性梯度洗脱目的蛋白。收集活性峰，对20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液透析后，上Sephadex G-75层析柱，用20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液洗脱，收集活性峰，从而最终获得具有肠激酶生物活性的重组黄牛肠激酶催化亚基产物。用肠激酶小分子荧光底物进行的酶反应动力学分析测定表明：纯化获得的重组黄牛肠激酶催化亚基具有很好的肠激酶的蛋白酶活性，30-40秒内即完成小分子荧光底物的水解(见附图2)。
Claims (4)
1.一种黄牛肠激酶催化亚基的基因，其特征在于：该基因编码了黄牛肠激酶的催化亚基，该亚基具有肠激酶的丝氨酸蛋白酶识别和切割特定氨基酸序列的活性。其DNA序列和氨基酸序列如下：ATT GTC GGA GGA AGT GAC TCC AGA GAA GGA GCC TGG CCT TGG GTC GTTTAA CAG CCT CCT TCA CTG AGG TCT CTT CCT CGG ACC GGA ACC CAG CAAI V G G S D S R E G A W P W V VGCT CTG TAT TTC GAC GAT CAA CAG GTC TGC GGA GCT TCT CTG GTG AGCCGA GAC ATA AAG CTG CTA GTT GTC CAG ACG CCT CGA AGA GAC CAC TCGA L Y F D D Q Q V C G A S L V SAGG GAT TGG CTG GTG TCG GCC GCC CAC TGC GTG TAC GGG AGA AAT ATGTCC CTA ACC GAC CAC AGC CGG CGG GTG ACG CAC ATG CCC TCT TTA TACR D W L V S A A H C V Y G R N MGAG CCG TCT AAG TGG AAA GCA GTG CTA GGC CTG CAT ATG GCA TCA AATCTC GGC AGA TTC ACC TTT CGT CAC GAT CCG GAC GTA TAC CGT AGT TTAE P S K W K A V L G L H M A S NCTG ACT TCT CCT CAG ATA GAA ACT AGG TTG ATT GAC CAA ATT GTC ATAGAC TGA AGA GGA GTC TAT CTT TGA TCC AAC TAA CTG GTT TAA CAG TATL T S P Q I E T R L I D Q I V IAAC CCA CAC TAC AAT AAA CGG AGA AAG AAC AAT GAC ATT GCC ATG ATGTTG GGT GTG ATG TTA TTT GCC TCT TTC TGG TTA CTG TAA CGG TAC TACN P H Y N K R R K N N D I A M MCAT CTT GAA ATG AAA GTG AAC TAC ACA GAT TAT ATA CAG CCT ATT TGTGTA GAA CTT TAC TTT CAC TTG ATG TGT CTA ATA TAT GTC GGA TAA ACAH L E M K V N Y T D Y I Q P I CTTA CCA GAA GAA AAT CAA GTT TTT CCC CCA GGA AGA ATT TGT TCT ATTAAT GGT CTT CTT TTA GTT CAA AAA GGG GGT CCT TCT TAA ACA AGA TAAL P E E N Q V F P P G R I C S IGCT GGC TGG GGG GCA CTT ATA TAT CAA GGT TCT ACT GCA GAC GTA CTGCGA CCG ACC CCC CGT GAA TAT ATA GTT CCA AGA TGA CGT CTG CAT GACA G W G A L I Y Q G S T A D V LCAA GAA GCT GAC GTT CCC CTT CTA TCA AAT GAG AAA TGT CAA CAA CAGGTT CTT CGA CTG CAA GGG GAA GAT AGT TTA CTC TTT ACA GTT GTT GTCQ E A D V P L L S N E K C Q Q QATG CCA GAA TAT AAC ATT ACG GAA AAT ATG GTG TGT GCA GGC TAT GAATAC GGT CTT ATA TTG TAA TGC CTT TTA TAC CAC ACA CGT CCG ATA CTTM P E Y N I T E N M V C A G Y EGCA GGA GGG GTA GAT TCT TGT CAG GGG GAT TCA GGC GGA CCA CTC ATGCGT CCT CCC CAT CTA AGA ACA GTC CCC CTA AGT CCG CCT GGT GAG TACA G G V D S C Q G D S G G P L MTGC CAA GAA AAC AAC AGA TGG CTC CTG GCT GGC GTG ACG TCA TTT GGAACG GTT CTT TTG TTG TCT ACC GAG GAC CGA CCG CAC TGC AGT AAA CCTC Q E N N R W L L A G V T S F G ATA GTT ACA CGT GAG GGA TTA GCG GGT CCC CAC ATA CGG GCC CAG GGTY Q C A L P N R P G V Y A R V PAGG TTC ACA GAG TGG ATA CAA AGT TTT CTA CAT TAGTCC AAG TGT CTC ACC TAT GTT TCA AAA GAT GTA ATCR F T E W I Q S F L H *
2.一种黄牛肠激酶催化亚基的基因克隆方法，其特征在于：该黄牛肠激酶催化亚基的基因可以通过从牛肠道组织中提取RNA，逆转录为cDNA，再通过PCR反应，克隆获得。
3.一种黄牛肠激酶催化亚基的基因工程生产方法，其特征是克隆获得的黄牛肠激酶催化亚基基因，可以通过重组DNA技术即基因工程方法构建表达质粒、经表达、纯化，制各获得重组黄牛肠激酶催化亚基。
4.一种重组黄牛肠激酶催化亚基，其特征是重组黄牛肠激酶催化亚基能够作为蛋白酶特异性地识别并切割含肠激酶切割位点的底物，具有高效、价廉的特点。可以作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
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