CN1676600A - 一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述的重组质粒是含人汗腺抗菌肽，即DCD－1L基因的质粒pET32a(+)。该基因工程菌的构建：根据DCD－1L的氨基酸组成，以引物的形式合成DCD－1L的两条DNA链，两条链之间有26bp互补，通过PCR扩增获得DCD－1L双链DNA，经酶切，插入质粒pET－32a(+)，构建成重组质粒pET－32a－DCD－1L，转化大肠杆菌，获得高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌。用所述的基因工程菌生产人汗腺抗菌肽的方法包括三个步骤：液体培养；纯化制得的人汗腺抗菌肽融合蛋白；和制备重组人汗腺抗菌肽。本发明的优点：生产重组人汗腺抗菌肽成本低；人汗腺抗菌肽的表达量高；纯化步骤简便，易于操作；得率高。

Description

一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌 及其构建方法和应用

                      技术领域

本发明涉及一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。

                      背景技术

抗生素自它产生以来，一直是人类感染性疾病和炎症的克星。但是，由于抗生素的长期和高剂量使用，许多菌株对其产生耐药性，甚至出现了能够耐受几乎所有抗生素的“超细菌”。因此，寻找一种能够替代抗生素的药物迫在眉睫。抗菌肽，又称肽抗生素，因其抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，被认为是替代抗生素的理想药物。同时，抗菌肽不仅对细菌、真菌和原虫有杀伤作用，还能作为有丝分裂原、信号分子对细胞的分裂增殖起调节作用，并且随着抗菌肽浓度的增大，它能够抗病毒和肿瘤细胞等。抗菌肽作为多功能分子，在疾病治疗上有广阔的应用前景。

人汗腺抗菌肽Dermcidin，简称DCD，是Schittek等科学家2001年从人体汗液中分离得到的、由110个氨基酸组成的小分子抗菌肽。Dermcidin-1，简称DCD-1，是由编码110个氨基酸的DCD在汗液中经蛋白酶加工成47个氨基酸的小肽，即由DCD加工前产物的63-109位的氨基酸组成，具有广谱的抗菌活性。Dermcidin-1L，即DCD-1L，是在DCD-1的3’末端加了一个亮氨酸，比DCD-1具有更强的抗菌活性。最近，发现DCD-1能杀死寄居在医疗器械上引起医院感染的慢性致病菌—表皮葡萄球菌，并发现在多种皮肤癌和乳腺癌上也有该基因的表达。综上所述，DCD-1L将来可望能成为具有广谱抗菌活性和抗肿瘤的药物。目前国外制备DCD-1L只能通过从人汗液中分离或化学合成。背景技术制备DCD-1L的缺点是，从人汗液分离DCD-1L，既费时又费力；化学合成DCD-1L技术难度大，合成成本高，纯化困难。用上述这些方法制备的产品，价格昂贵，不合中国国情，因此迫切需要研制一种高效价廉的制备DCD-1L的方法。

                      发明内容

为生产成本低的重组的人汗腺抗菌肽，首先得找到并构建一种高效表达人汗腺抗菌肽，即能生产人汗腺抗菌肽的基因工程菌。

本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述的重组质粒是含人汗腺抗菌肽，即DCD-1L基因的质粒pET32a(+)。

所述的基因工程菌的进一步特征在于，所述的重组质粒是pET32a(+)-P_T7-TrxA-6×His-DCD-1L，其中，PT7是所述质粒pET32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6×His是组氨酸纯化标签。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题。根据DCD-1L的氨基酸组成，以引物的形式合成DCD-1L的两条DNA链，两条链之间有26bp互补，通过PCR扩增获得DCD-1L双链DNA，经酶切，插入质粒pET-32a(+)，构建成重组质粒pET-32a-DCD-1L，转化大肠杆菌，获得高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌。

现结合附图详细说明本发明的技术方案。

一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤：

第一步  DCD-1L DNA序列的扩增

委托专业的生物技术公司化学合成如下碱基序列：DCD-1L a-人汗腺抗菌肽5’端85bp单链DNA序列，DCD-1L b--人汗腺抗菌肽3’端85bp单链DNA序列，P5--5’端引物，引入BamHI酶切位点和FactorXa位点，P3--3’端引物，引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA，DCD-1L a(85bp)：

5’-TCTTCTTTGTTGGAGAAGGGTTTGGACGGTGCTAAGAAGG TGTTGGTGGTTTGGGTAAG TTGGGTAAGG ACGCTGTTGA GGACT-3’

DCD-1L b(85bp)：

5’-CAAAACAGAGTCCAAAACGTCCTTAACGTCGTGAACAGCACCCTTACCAACAGACTCCAA GTCCTCAACA GCGTCCTTAC CCAAC-3’

           BamHI

P5：5’-GGCGGATCC ATCGAAGGTCGTTCTTCTTTGTTGGAGAAGG-3’

             EcoRI       Factor Xa

P3：5’-CCGGAATTC TCACAAAACAGAGTCC-3’

                        End

DCD-1L a和DCD-1L b互为模板，加入Ex Taq DNA聚合酶，进行PCR扩增，获得双链DNA，即完整的DCD-1L基因片段，以双链DNA为模板，加入引物P5和P3再进行PCR扩增，反应产物用DNA GelExtraction Kit回收，获得DCD-1L DNA片段；

第二步  构建含人汗腺抗菌肽基因序列的基因工程菌用两种限制性内切酶双酶切第一步获得的DCD-1L DNA片段，所述的两种限制性内切酶是BamHI和EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段从而，连接上述回收的小片段和大片段，得含DCD-1L DNA片段的重组质粒pET-32a-DCD-1L，将重组质粒pET-32a-DCD-1L转化到大肠杆菌DH5α，制得含人汗腺抗菌肽基因序列，即DCD-1L DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组DCD-1L基因片段；

第三步  构建高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌

从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET-32a-DCD-1L，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人汗腺抗菌肽的基因工程菌。

上述构建涉及到的质粒pET-32a(+)，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，限制性内切酶BamHI、EcoRI和Ex Taq DNA聚合酶均可从市场购得。委托合成所述得的碱基序列和测序的生物技术公司是上海博雅生物技术有限公司。

本发明要解决的另一个技术问题是提出一种高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌的应用，即提出一种用所述的基因工程菌生产人汗腺抗菌肽的方法。

本发明通过以下的技术方案解决上述技术问题。

一种用所述的基因工程菌生产人汗腺抗菌肽的方法，其特征在于，具体操作步骤：

第一步  液体培养

将上述构建好的高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～1.0时，加入终浓度为0.4～1.0mM的IPTG进行诱导表达3～5小时，生产和积累可溶性表达的人汗腺抗菌肽融合蛋白；

第二步  纯化制得的人汗腺抗菌肽融合蛋白

离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人汗腺抗菌肽的融合蛋白组分，用截留分子量为5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～8mg/mL；

第三步  制备重组人汗腺抗菌肽

用Factor Xa酶解人汗腺抗菌肽融合蛋白，23℃下裂解2～5小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到重组人汗腺抗菌肽。

本发明的优点在于：

(1)通过基因工程技术的方法生产重组人汗腺抗菌肽，比化学合成方法生产重组人汗腺抗菌肽成本低；

(2)通过基因工程技术的方法构建含人汗腺抗菌肽基因的基因工程菌，大大提高了人汗腺抗菌肽的表达量；

(3)要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人汗腺抗菌肽融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层析更易于操作；

(4)只要进行一次酶解便能得到重组人汗腺抗菌肽，纯化极为简便，得率高。

因而用本发明提供的基因工程菌生产重组人汗腺抗菌肽，产量高，纯化工艺简便，生产成本较低。

                      附图说明

图1是重组质粒pET-32a-DCD-1L的构建示意图。

图2是重组质粒pET-32a-DCD-1L的测序结果图。

图3是重组人汗腺抗菌肽的分离纯化和酶切结果图，其中1为标准蛋白质分子质量；2为携带重组人汗腺抗菌肽的融合蛋白；3为重组人汗腺抗菌肽的融合蛋白经Factor Xa酶解，4为纯化后的重组人汗腺抗菌肽。

图4是重组人汗腺抗菌肽的质谱。

结果表明用本发明技术路线所制备的重组人汗腺抗菌肽分子量的大小与其理论值一致。

图5是重组人汗腺抗菌肽抗金黄色葡萄球菌活性图。

图6是重组人汗腺抗菌肽抗大肠杆菌活性图。

图7是重组人汗腺抗菌肽的抗白色念球菌活性图。

                      具体实施方式

下面结合附图，通过实施例，进一步说明本发明。说明书和实施例中凡未注明具体条件的实验方法，按常规条件进行。

实施例1构建一种高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌

第一步  DCD-1L DNA序列的扩增

委托专业的生物技术公司化学合成如下碱基序列：DCD-1L a-人汗腺抗菌肽5’端85bp单链DNA序列，DCD-1L b--人汗腺抗菌肽3’端85bp单链DNA序列；P5--5’端引物，引入BamHI酶切位点和FactorXa位点，P3--3’端引物，引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA，DCD-1L a(85bp)：

5’-TCTTCTTTGTTGGAGAAGGGTTTGGACGGTGCTAAGAAGG TGTTGGTGGTTTGGGTAAG TTGGGTAAGG ACGCTGTTGA GGACT-3’

DCD-1L b(85bp)：

5’-CAAAACAGAGTCCAAAACGTCCTTAACGTCGTGAACAGCACCCTTACCAACAGACTCCAA GTCCTCAACA GCGTCCTTAC CCAAC-3’

           BamHI

P5：5’-GGCGGATCC ATCGAAGGTCGTTCTTCTTTGTTGGAGAAGG-3’

              EcoRI      Factor Xa

P3：5’-CCGGAATTC TCACAAAACAGAGTCC-3’

                        End

DCD-1L a和DCD-1L b互为模板，加入Ex Taq DNA聚合酶，按下列条件进行PCR扩增：94℃，3min；45℃，2min；72℃，10min，获得双链DNA，即完整的DCD-1L基因片段。以双链DNA为模板，加入引物P5和P3进行PCR扩增。PCR反应体系中包含：2μl模板，即双链DCD-1L基因，1.5μl 10X Taq buffer，3μl Ex Taq DNA聚合酶，4μl dNTP，引物P5和P3各2μl，3.5μl无菌水。PCR扩增条件为：94℃30s，58℃30s，72℃45s，循环28次后72℃延伸5min。反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收。

第二步  构建含人汗腺抗菌肽基因序列的基因工程菌

用两种限制性内切酶双酶切第一步获得的DCD-1L DNA片段，所述的两种限制性内切酶是BamHI和EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到含有DCD-1L DNA片段的重组质粒pET-32a-DCD-1L。将重组质粒pET-32a-DCD-1L转化到大肠杆菌DH5α，制得含人汗腺抗菌肽基因序列，即DCD-1L DNA序列的基因工程菌。

第三步  构建高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌

从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET-32a-DCD-1L，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人汗腺抗菌肽的基因工程菌。

实施例2一种高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人汗腺抗菌肽。下述的亲和层析介质为NTA-0树脂，购自Novagen公司，下述的Factor Xa，购自NEB公司。

第一步  液体培养

将实施例1中构建好的基因工程菌接种于20mL含100mg/mL Amp的LB培养基中，37℃，210rpm，培养至OD600＝0.6-1.0。5000rpm，4℃，离心5min，收集沉淀的菌体，4℃保存过夜。第二天用20mL含100mg/mL Amp的LB培养基重悬菌体，4％体积接种于400mL含100mg/mL Amp的LB培养基。培养至OD600nm＝0.4～1.0。加终浓度为0.4～1.0mM IPTG诱导表达3～5h。将摇瓶置于冰上冰浴5min后，6000rpm，4℃，离心5-10min收集菌体。加100mL NTA-0 Buffer重悬菌体，同时加入终浓度为1mM的PMSF。超声波破碎菌体，离心收集上清。见附图3的1。

第二步  纯化制得人汗腺抗菌肽融合蛋白

上清用亲和层析柱SNBC 3S NTA Resin分离纯化得融合蛋白TrxA-DCD-1L。用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer平衡NTA-Resin。将样品加到NTA-Resin中，分别用2倍NTA体积的NTA-0，NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，5倍NTA体积的NTA-1000 Buffer洗脱，分别收集穿透部分和各个组分的洗脱液，用于SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况。经SDS-PAGE分析含有融合蛋白TrxA-DCD-1L组分的洗脱液用分子筛Sephadex G-25 Coarse脱盐，然后用5K超滤管浓缩。见附图3的2。蛋白浓度用Lowry法测定。

第三步  制备人汗腺抗菌肽

融合蛋白TrxA-DCD-1L用Factor Xa蛋白酶酶切.每毫克融合蛋白加1.5个单位的蛋白酶，37℃，酶切1小时。见附图3的3。酶切产物用亲和层析柱SNBC 3S NTA Resin分离.收集穿透峰和NTA-0的洗脱峰.合并这两种组分，用10K的超滤管将31KD的蛋白酶去除，再用1～5K的超滤管对DCD-1L脱盐和浓缩。见附图3的4。MALDI-TOF/TOF-MS测定重组DCD-1L的分子量。结果见附图4。等电聚焦测定重组DCD-1L的等电点。蛋白浓度用Lowry法测定。

实施例3人汗腺抗菌肽抗金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003作用

将金黄色葡萄球CMCC(B)26003接种于20mLLB培养基中，培养至OD600nm＝0.4～0.5。收集菌体，用10mM PBS(pH7.4)洗2次后，用10mM pH6.5，100mM NaCl的PBS将菌稀释到2×106/mL.在不同浓度的重组DCD-1L里加入100μL菌液，37℃，作用4小时，稀释10～50倍，取100μL加入10mL软琼脂中，混匀，铺在LB平板上。37℃，培养过夜。等菌落长出后，数菌落个数。重组DCD-1L抗菌活性用公式：(存活的菌落数/对照组的菌落数)×100。结果见附图5。

实施例4人汗腺抗菌肽抗大肠杆菌CMCC(B)44102作用

将大肠杆菌CMCC(B)44102接种于20mLLB培养基中，培养至OD600nm＝0.4～0.5。收集菌体，用10mM pH7.4的PBS洗2次后，用10mM pH6.5，100mM NaCl的PBS将菌稀释到2×106/mL.在不同浓度的重组DCD-1L里加入100μL菌液，37℃，作用4小时，稀释10～50倍，取100μL加10mL软琼脂中，混匀，铺在LB平板上。37℃，培养过夜。等菌落长出后，数菌落个数。重组DCD-1L抗菌活性用公式：(存活的菌落数/对照组的菌落数)×100。结果见附图6。

实施例5人汗腺抗菌肽抗白色念球菌CMCC(B)9800作用

将白色念球菌CMCC(B)9800接种于20mL高氏一号培养基中，培养至OD450nm＝0.4～0.6。收集菌体，用10mM pH7.4的PBS洗2次后，用10mM PBS(pH6.5，100mM NaCl)将菌稀释到2×106/mL.在不同浓度的重组DCD-1L里加入100μL菌液，37℃，作用4小时，稀释10-50倍，取100μL加入10mL软琼脂中，混匀，铺在LB平板上。37℃，培养过夜。等菌落长出后，数菌落个数。重组DCD-1L抗菌活性用公式：(存活的菌落数/对照组的菌落数)×100。结果见附图7。

Claims (4)

1.一种高效表达重组人汗腺抗菌肽的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，所述的重组质粒是含人汗腺抗菌肽，即DCD-1L基因的质粒pET32a(+)。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的重组质粒是pET32a(+)-P_T7-TrxA-6×His-DCD-1L，其中，PT7是所述质粒pET32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6×His是组氨酸纯化标签。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤：

第一步  DCD-1L DNA序列的扩增

委托专业的生物技术公司化学合成如下碱基序列：DCD-1L a-人汗腺抗菌肽5’端85bp单链DNA序列，DCD-1L b--人汗腺抗菌肽3’端85bp单链DNA序列，P5--5’端引物，引入BamHI酶切位点和FactorXa位点，P3--3’端引物，引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA，DCD-1L a(85bp)：

5’-TCTTCTTTGTTGGAGAAGGGTTTGGACGGTGCTAAGAAGG    TGTTGGTGG

        TTTGGGTAAG TTGGGTAAGG ACGCTGTTGA GGACT-3’

DCD-1L b(85bp)：

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        CAGACTCCAA GTCCTCAACA GCGTCCTTAC CCAAC-3’

            BamHI

P5：5’-GGCGGATCC ATCGAAGGTCGTTCTTCTTTGTTGGAGAAGG-3’

              EcoRI      Factor Xa

P3：5’-CCGGAATTC TCACAAAACAGAGTCC-3’

                      End

DCD-1L a和DCD-1L b互为模板，加入Ex Taq DNA聚合酶，进行PCR扩增，获得双链DNA，即完整的DCD-1L基因片段，以双链DNA为模板，加入引物P5和P3再进行PCR扩增，反应产物用DNA GelExtraction Kit回收，获得DCD-1L DNA片段；

第二步  构建含人汗腺抗菌肽基因序列的基因工程菌用两种限制性内切酶双酶切第一步获得的DCD-1L DNA片段，所述的两种限制性内切酶是BamHI和EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段从而，连接上述回收的小片段和大片段，得含DCD-1L DNA片段的重组质粒pET-32a-DCD-1L，将重组质粒pET-32a-DCD-1L转化到大肠杆菌DH5α，制得含人汗腺抗菌肽基因序列，即DCD-1L DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组DCD-1L基因片段；

第三步  构建高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌

从第二步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET-32a-DCD-1L，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达的人汗腺抗菌肽的基因工程菌。

4.一种用权利要求1或2所述的基因工程菌生产人汗腺抗菌肽的方法，其特征在于，具体操作步骤：

第一步  液体培养

将上述构建好的高效表达人汗腺抗菌肽的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～1.0时，加入终浓度为0.4～1.0mM的IPTG进行诱导表达3～5小时，生产和积累可溶性表达的人汗腺抗菌肽融合蛋白；

第二步  纯化制得的人汗腺抗菌肽融合蛋白

离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人汗腺抗菌肽的融合蛋白组分，用截留分子量为5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～8mg/mL；

第三步  制备重组人汗腺抗菌肽

用Factor Xa酶解人汗腺抗菌肽融合蛋白，23℃下裂解2～5小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到重组人汗腺抗菌肽。

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