CN1844367A - 一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法及其应用：在大肠杆菌中表达可溶性、带有组氨酸标签的烟草蚀刻病毒蛋白酶，经过Ni2+亲和层析一步分离纯化、制备获得带有组氨酸标签的重组烟草蚀刻病毒蛋白酶。它能够特异性地识别并切割含烟草蚀刻病毒蛋白酶切割位点的底物，具有高效、价廉的特点，能够作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
Description
一、技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
二、背景技术：
基因工程实践中经常使用融合表达进行目标蛋白质的表达、生产。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性质，融合表达能大大简化、方便产物的检测，性质研究和分离纯化。因此目前在基因工程中，从原核表达体系(如大肠杆菌)到真核表达体系(如哺乳动物细胞)都经常采用融合表达方法进行重组目标蛋白质的生产。但这同时也带来了新的问题，即融合蛋白的特异性去除问题。当重组蛋白质作为基因工程药品及其它一些用途时，目标产物必须是像天然蛋白质一样的完整产物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表达产物必须进行产物后加工：即融合蛋白在体外实施特定氨基酸序列的切割或断裂，才能获得完整的目标产物。目前最为常用的裂解方法为：1.化学法：用溴化氢断裂；2.蛋白酶法：用凝血酶，活化的X因子或肠激酶特异性裂解。由于溴化氰为剧毒化合物，而且其切割识别位点为Met，因此实用性不强。目前国际上最常用的工具蛋白酶为：凝血酶(识别位点：Leu-Val-Pro-Arg↓Gly--Ser)，因子Xa(识别位点：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓)和肠激酶(识别位点：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)，其中肠激酶和Xa切割后的产物和天然产物完全一致，而凝血酶切割后的产物比天然产物分别多二个氨基酸。烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV蛋白酶)是烟草蚀刻病毒编码的Nuclear Inclusion a(NIa)蛋白的分子量为27kD的催化亚基(Daros，et al.，1999)。TEV蛋白酶是一种新发现的位点专一性的蛋白酶，它可以识别一个七个氨基酸的序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly，其中的几个氨基酸Glu，Tyr，Gln和Gly是完成高效切割所必需的。切割发生在Gln和Gly之间，这样会使得目标蛋白的氨基端多一个Gly。TEV蛋白酶切割的最适温度是34℃；但实际上，该酶在低至4℃的温度都有较好的活性，而且使用条件广泛、在很多蛋白酶抑制剂存在的都有活性(Daros et al.，1999；Phan et al.，2002；Mohanty et al.，2003)。因此，TEV蛋白酶是生产和研究重组蛋白时去除融合蛋白标签的理想选择。
用基因工程方法生产以上这些工具蛋白酶已成为生物工程制药业及基因工程研究人员的急需。这一点对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员尤为重要，因为国内使用的这些工具蛋白酶全部来源于进口。
三、发明内容：
TEV蛋白酶由于对于其识别序列的高度特异性、在多种蛋白酶抑制剂存在情况下仍然具有酶切活性和广泛的使用条件，使其成为一种从重组蛋白中去除融合标签的理想的工具酶。很多研究者尝试用重组DNA的方法从大肠杆菌中生产TEV蛋白酶(Kapust et al.，1999；Lucast，et al.，2001；Kapust et al.，2001)。已有的报道表明，TEV蛋白酶在大肠杆菌中过量表达的可溶性是非常低的。Lucast等在大肠杆菌中过量表达带有His-tag的野生型和突变型的TEV蛋白酶，结果发现超过95％的该蛋白存在于细胞裂解后的包涵体组分中。获得高产量和有活性的蛋白酶必须经过复杂的蛋白变复性过程(Lucast et al.，2001)。Kapust等的研究也表明几乎所有的大肠杆菌表达的TEV蛋白酶都是以无活性的非可溶形式存在，可溶性的表达只有在TEV蛋白酶的N端加一个MBP蛋白的标签才能实现(Kapust et al.，1999)。
本发明专利需要解决的问题是在大肠杆菌中表达有生物活性的TEV蛋白酶，并通过其分离纯化方法，获得具有很好的切割融合蛋白的生物活性的TEV蛋白酶，达到和满足实际应用的需要，为基因工程下游过程中重组融合蛋白质的切割提供一个有效、价廉的工具酶。本发明具有重要的实用意义，尤其是对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员具有重要的实用价值。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
将TEV蛋白酶基因克隆在大肠杆菌表达质粒中，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，重组TEV蛋白酶以可溶性形式表达。可溶性的重组His6-TEV蛋白酶经过Ni2+亲和层析柱的一步纯化可以得到纯度大于95％的His6-TEV，产量达到每升培养液35mg。重组His6-TEV具有很好的、位点特异性的蛋白酶活性。
本发明提供了一种方便可行地生产可溶性、具有生物活性的重组TEV蛋白酶的方法，建立了与之相应的简便、经济的纯化工艺。本发明工艺生产的重组TEV蛋白酶为基因工程下游过程中重组融合蛋白质的切割提供一个有效、价廉的工具酶。本发明具有重要的实用意义，尤其是对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员具有重要的实用价值。。
同已有的重组TEV蛋白酶生产工艺相比，本发明的特色和创新之处在于：
(1)本发明在大肠杆菌中实现了His6-TEV蛋白酶可溶性的表达，表达产物具有很好的序列特异性的蛋白酶活性。
(2)本发明建立了利用Ni2+金属亲和层析一步纯化His6-TEV蛋白酶的分离纯化工艺，纯化获得的His6-TEV蛋白酶纯度大于95％，产量达到每升培养液35mg。整个生产工艺方法简便、价廉，具有很好的适用性，推广方便，适于生产。避免了以前在大肠杆菌中生产TEV蛋白酶时，由于表达产物以包涵体形式存在，必须经变复性处理才能获得生物活性的烦琐步骤。
本发明提供了一种在大肠杆菌中表达和纯化具有生物活性的TEV蛋白酶的基因工程生产方法，该生产方法简便、高产、低成本，不需要体外变复性过程即具有生物活性。生产的TEV蛋白酶具有严谨的酶切特异性。这些优点使得His6-TEV成为基因工程蛋白生产中一种高效而廉价的工具酶。
四、附图说明：
图1重组His6-TEV的表达和纯化SDS-PAGE
1.分子量标准蛋白质，分子量分别为94、66、43、31、14kDa(自上而下)；
2.非诱导的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株总蛋白；
3.IPTG诱导的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株总蛋白；
4.IPTG诱导的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株裂解上清；
5.IPTG诱导的pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)菌株裂解沉淀；
6.Ni2+亲和层析柱纯化的穿过峰；
8.50mM PBS，pH8.0，50mM咪唑的洗脱峰；
9.50mM PBS，pH8.0，250mM咪唑的洗脱峰。
图2不同剂量重组His6-TEV酶切GST-EGFP蛋白的定量分析。
不同剂量的重组His6-TEV加入到14μg GST-EGEP中，30℃反应12小时。所有的样品经12％SDS-PAGE分析，再根据软件定量分析得到数据，作出His6-TEV酶切反应的酶和底物浓度关系曲线。
图3.重组His6-TEV酶切GST-EGFP蛋白的时间曲线动力学分析。
1μg的重组His6-TEV加入到14μg GST-EGEP中，30℃反应不同时间，所有的样品经12％SDS-PAGE分析，再根据软件定量分析，作出His6-TEV酶切反应的时间曲线。
图4.重组His6-TEV酶切的酶动力学分析。
0.6μg的重组His6-TEV加入到不同剂量的GST-EGEP中，30℃反应12小时，所有的样品经12％SDS-PAGE分析，再根据软件定量分析，作出重组His6-TEV酶切底物浓度与酶切效率关系曲线。同样，采取双倒数作图法，计算Km和kcat。
图5.重组His6-TEV和肠激酶对His6-L-TNF酶切的比较。
(A)重组His6-TEV的酶切效率的SDS-PAGE分析。
1.2μgHis6-TEV加入到14μg GST-EGEP中，30℃反应不同时间(泳道1：分子量标准蛋白质，自上而下分子量分别为94、66、43、31、14kDa；泳道2-7：分别是0，0.5，1，2，4，6小时)。所有的样品通过浓度为12％的SDS-PAGE进行分析。23kDa的His6-L-TNF融合蛋白经过酶切以后产生分子量为18kDa的蛋白TNF(用实线箭头指示)。
(B)重组肠激酶的酶切效率的SDS-PAGE分析。
重组EKL酶/底物＝1/10000(W/W))酶切20μg His6-EK-TNF不同时间(泳道1-7：分别为0，0.5，1，2，3，4 and 6小时)。实线箭头指示完整的TNF蛋白质条带，虚线箭头指示非特异性酶切产生的TNF条带。
五、具体实施方式：
1.表达质粒pET28a-Hi s6-TEV和pALEX-GST-EGFP表达载体的构建：
以含有TEV蛋白酶基因的质粒为模板，通过PCR扩增得到TEV的cDNA。PCR的引物如下：primer 1：5’-tgta
catatgggagaaagcttgtttaagg-3’和primer 2：5’gata
gtcgacttaattcatgagttgag-3’。引物中加框或下划线的部分分别是酶切位点Nde I和Sal I。PCR的程序为：94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共28个循环。由此得到的DNA片段经过Nde I和Sal I的双酶切插入到E.coli表达载体中pET28a(Novagen公司)中。
pET28a-His6-TEV质粒的正确构建通过双酶切和测序得到确认。
2.His6-TEV的表达和纯化
挑取单克隆于LB培养基中，37℃250rpm振摇过夜。第二天按1∶100转接到加有卡那霉素(50μg/ml)的新鲜LB培养基中，30℃250rpm振摇3-4小时，直到OD600约0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，总诱导时间6小时后，6000rpm 5分钟收获菌体。来自1升培养基的总菌体重悬于50ml 50mM PBS，pH8.0，超声30分钟破碎细胞。12000g 20分钟离心分离超声上清。
His6-TEV的纯化使用美国Sigma公司的Select TM HC Ni2+柱亲和介质进行。首先将介质用平衡缓冲液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)进行平衡，然后将超声上清上样。上样后再用平衡缓冲液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)洗至基线，最后用洗脱缓冲液(50mM PBS，pH8.0，250mM咪唑)进行洗脱。洗脱峰组分中的咪唑通过超滤得以去除。最后纯化得到的蛋白重溶于100mM Tris-HCl，pH 8.0，10％蔗糖(W/V)中，冻存于-70℃。
纯化过程中所有组分的蛋白浓度采用BSA为标准品作为参照、用BCA试剂盒进行定量，同时用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE进行分析。
3.His6-TEV的蛋白酶活力分析：
使用含有TEV酶切位点的GST-EGFP蛋白作为底物，对His6-TEV的酶切活力进行了分析。
酶切效率分析：为了定量分析His6-TEV的酶切效率，不同剂量(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，和0.8μg)的His6-TEV加入到含有14μg的30μl反应体系中，30℃酶切12小时。
His6-TEV酶切的时间曲线：1μg的His6-TEV加入到含有14μg融合蛋白的30μl酶切体系中，30℃分别反应不同时间(分别为0，0.5，1，2，4，6，8，12和24小时)。
His6-TEV的动力学分析：为了计算His6-TEV对于GST-EGFP的Km和kcat值，0.6μg His6-TEV加入到不同浓度的GST-EGFP(分别为1.4，5.6，11.2，16.8，22.4，28和33.6μg)中，30℃反应1小时后，计算反应掉的底物蛋白量。通过双倒数作图法计算His6-TEV对于GST-EGFP的Km和kcat值。
所有反应的缓冲液都是50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5mM EDTA，1mM DTT，反应体系30μl。所有的反应产物通过12％的SDS-PAGE进行分离和考马斯亮蓝进行染色。染色后的胶应用软件Grab-it 2.5和Gelwork(UVP)进行扫描和定量分析，再根据产生的数据进行之后的作图。
pET28a-His6-TEV/BL21(DE3)的表达菌株经过IPTG诱导后，在SDS-PAGE约30kDa的位置出现一条明显的诱导条带，这个分子量与理论上His6-TEV的分子量一致。His6-TEV的表达量占整个菌体总蛋白的40％，而40％的His6-TEV表达产物存在于表达上清中。通过Ni2+柱亲和层析的一步纯化可以得到纯度大于95％的His6-TEV，产量达到每升培养液35mg。
纯化得到的His6-TEV对于底物蛋白GST-EGFP表现出了良好的切割活性和特异性。经过30℃12小时的共同温浴，His6-TEV可以切割大约20倍自身量的GST-EGFP蛋白，而且不会产生任何的非特异切割。His6-TEV的酶动力学分析显示：在30℃下His6-TEV对于GST-EGFP的Km值为0.074mM，而kcat是0.02S-1。
His6-TEV对于含有TEV酶切位点的蛋白表现出通用的酶切活性，His6-TEV对于含有TEV酶切位点的GST-EGFP和His6-L-TNF都具有较好的酶切活性。
与现在生产上使用广泛的商业化工具酶肠激酶相比，His6-TEV对于一些目标蛋白的切割表现出更加严谨的特异性。我们将His6-TEV与肠激酶的酶切专一性进行了比较。分别使用含有TEV识别位点和EK识别位点的His6-L-TNF作为底物，我们分析了两种不同工具酶的酶切特异性。结果发现。TEV的酶切只产生一条特异的TNF条带；而EK的酶切时却产生了一条除了完整TNF以外的非特异条带。
Claims (6)
1.一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法，其特征是在大肠杆菌中表达和纯化一种可溶性、带有组氨酸标签的烟草蚀刻病毒蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法，其特征是通过PCR方法构建末端添加了组氨酸标签的烟草蚀刻病毒蛋白酶基因，将获得的基因克隆在大肠杆菌表达质粒中、表达有生物活性的、带有组氨酸标签的烟草蚀刻病毒蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法，其特征是经过Ni2+亲和层析纯化、制备获得有生物活性的、带有组氨酸标签的烟草蚀刻病毒蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法制备的烟草蚀刻病毒蛋白酶，其特征是能够特异性地识别并切割含烟草蚀刻病毒蛋白酶切割位点的底物。
5.根据权利要求1所述的一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法的应用，其特征是生产和制备烟草蚀刻病毒蛋白酶作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂。
6.根据权利要求1所述的一种烟草蚀刻病毒蛋白酶的基因工程生产方法生物工程制药及基因工程、生物化学、分子生物学研究中的应用。
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2006
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