CN102533880A - 一种用于合成磷酸肌酸钠的生物工程方法 - Google Patents

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王永宏
王琳
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Abstract

本发明提供一种用于合成磷酸肌酸钠的生物工程方法，该方法包括以下步骤：用基因工程方法重组构建含有肌酸激酶的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大规模高密度培养并分离纯化，得到高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到磷酸肌酸。该方法具有底物利用率高、产物回收率高、反应条件温和、反应时间短、对环境污染小、成本低等优点，适合工业化大规模生产。

Description

一种用于合成磷酸肌酸钠的生物工程方法
技术领域
本发明涉及一种肌酸激酶的制备方法，并通过此酶在体外催化合成磷酸肌酸钠。该方法可用于磷酸肌酸钠的大规模生产制备。
背景技术
磷酸肌酸是人体自身存在的一种物质，主要存在于心肌，骨骼肌，脑等器官和组织中。它的生理作用主要有：1，它对能量物质ATP起到缓冲作用，上述器官和组织在生命活动过程中所消耗的大量ATP由它来补充，以避免ATP供应的波动；2，它是能量物质ATP分子中高能磷酸基团传递的载体，线粒体所生成ATP分子的高能磷酸基团在细胞浆中向耗能部位传递就是以胞浆中的磷酸肌酸为载体，并通过胞浆中磷酸肌酸—肌酸激酶系统来实现的。
各种药理实验证明磷酸肌酸作为细胞中的ATP这种能量物质的转移载体，可以起到改善缺血缺氧心肌的细胞代谢，抑制血小板凝聚，抑制凝血甘油的积累，稳定细胞膜的作用。能减轻再灌注引起的过氧化物损伤，改善微循环，增加主动脉及冠状动脉的血流量。
由于磷酸肌酸具有广泛的生理活性，前苏联，意大利等国家在1987年就作了大量研究，将磷酸肌酸钠作为心肌保护剂首先应用于心脏外科手术中，配制在心麻溶液中使用。结果显示用药组血流动力很快恢复，纤颤率减少，窦性心率也很快恢复，对缺血缺氧的心肌细胞膜有良好的保护作用。
磷酸肌酸钠在心肌梗塞疾病治疗中同样有着显著的效果，临床研究证明磷酸肌酸钠对于心肌梗塞患者的心室早搏次数和心动过速有明显的改善效果，可以作为心肌梗塞患者的重要资料药物。另外，磷酸肌酸钠对治疗心肌缺血、缺氧引起的心力衰竭、心肌炎、冠心病等疾病也有着很好的疗效。
果糖二磷酸是用于心绞痛、心衰、心肌梗塞的辅助治疗药物，在临床治疗中适用症较广，磷酸肌酸钠作为一种新型产品，较之果糖二磷酸钠具有许多优势：首先，磷酸肌酸钠的供能方式是直接供能，而且能够穿透细胞膜，相比较果糖二磷酸钠其效率有着显著的提高，其能值为果糖二磷酸的三倍；其次，由于磷酸肌酸钠为人体内源性物质，故在用药安全性上磷酸肌酸钠无使用禁忌和不良反应，无配伍禁忌，可以和其他药物混合使用，对于孕妇和儿童无禁忌，比果糖二磷酸钠有更广的使用范围。
目前磷酸肌酸的制备有化学合成和生物酶法合成两种方法。化学合成法以肌酸和三氯氧磷为原料采用一步成盐工艺和多步盐型转换工艺。其合成反应剧烈升温，副反应较多，工艺控制比较困难。工艺总回收率不足20％，能耗和成本较高并有大量废水排放。酶法合成具有反应条件温和，反应速度快和专一性强等优点，但由于生产用酶采用生化提取难以规模化制备、底物价格昂贵等原因一直没有得到产业化开发。
发明内容
本发明提供了一种合成磷酸肌酸钠的方法，旨在解决化学合成和生物提取酶法合成的缺陷。为了解决上述问题，本发明通过以下步骤实现：用基因工程方法重组构建含有编码肌酸激酶核苷酸序列的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大规模高密度培养，并分离纯化，得到高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到磷酸肌酸。
本项目采用重组肌酸激酶，解决了酶源保障的问题，保留了酶促合成法的优点，明显提高了反应和纯化过程的可控性。生物催化法工艺成本比化学合成法低；少量污水没有生物毒性，经简单的生物处理就可以达到排放标准。总之，生物催化法工艺在节能、降耗、减排的工业发展方向上取得显著效果，有望成为磷酸肌酸钠主流生产工艺。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
具体实施方式
实施例1
采用常规方法提取人脑样品RNA，反转录获得人脑cDNA。以权利说明6中所述引物为引物，采用PCR方法从人脑cDNA中钓取CKBB基因。具体PCR条件为
95℃，5min；
72℃，10min
产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小为1109bp，与预计一致。
用限制型内切酶NdeI和XhoI将上述CKBB基因酶切，回收后与经NdeI及XhoI酶切过的载体pET28a连接，转化大肠杆菌，筛选具有卡那霉素抗性的转化子。经质粒提取，酶切鉴定后，证明重组蛋白CKBB基因已克隆至pET28a中。
用CaCl2法将pET28a-CKBB转化BL21(DE3)，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测获得含有pET28a-CKBB的重组转化子BL21(DE3)/pET28a-CKBB。
实施例2
在实施例1中所得的重组工程菌按照2％接种量接入培养基(含有胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物10g/L，K2HPO4 3H2O 15g/L，NaH2PO4 2H2O 10g/L，1ml消泡剂。121℃灭菌20min，接种前加入卡那霉素至最终浓度50mg/L，无菌MgSO4至终浓度0.8g/L，无菌葡萄糖至终浓度2g/L，无菌微量元素浓缩液10ml/L，pH值调节至6.55)在5L发酵罐中进行补料分批高密度发酵，pH值控制在6.55±0.05，37℃培养5小时后，IPTG诱导的工作浓度为0.1mM，诱导20小时后，离心收集菌体，放入-20℃冰箱保存，备用。
实施例3
称取实施例2中所得的菌体10g，使用磷酸盐缓冲液稀释至100g/L，置于冰水浴中，使用超声细胞破碎仪，设置超声波功率30％，工作4s停6s，循环1小时，得到100ml破菌液。将其于4℃、12000rpm离心1小时，收集离心上清液。上样至已用50mM磷酸缓冲液平衡好的镍亲和层析柱(2.6/10cm)，用同样的缓冲液将层析柱平衡后，用含有20mM咪唑的缓冲液洗脱柱上的杂蛋白，最后用含有300mM咪唑的缓冲液洗脱柱上的目的蛋白，收集洗脱液，并使用20mM的磷酸盐缓冲液将其透析，冻干，得到重组肌酸激酶制剂。测定酶制剂的浓度和比活力，放入-20℃冰箱保存，备用。
实施例4
在1升反应体系中进行酶催化合成，反应液含有：30mM  ATP，90mM肌酸，30mM氯化镁，30mM甘氨酸，pH值调节至10，加入实施例3中得到的肌酸激酶50毫克，25℃反应2小时，期间用碱液调节pH值，使pH值维持在9.5-10之间。反应产率一般可达到70％以上，检测结果见说明书附图。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
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Figure ISA00000405227300021
Figure ISA00000405227300031

Claims (11)

1.一种用于合成磷酸肌酸钠的生物工程方法，其特征在于：
用基因工程方法重组构建含有编码肌酸激酶核苷酸序列的大肠杆菌工程菌株；
利用该工程菌株进行大规模高密度培养，并分离纯化，得到高纯度、高活性的肌酸激酶；
利用肌酸激酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到磷酸肌酸钠。
2.根据权利要求1所述的生物工程方法，其特征在于：
所述大肠杆菌工程菌株是含有编码肌酸激酶核苷酸序列的工程菌株，该肌酸激酶的核苷酸序列来源于人，该工程菌株已于2010年12月8日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC4427。
3.根据权利要求1所述的生物工程方法，其特征在于：
所述大肠杆菌工程菌株中包含一种含有肌酸激酶基因序列的原核表达载体pET28a-CKBB。
4.根据权利要求3所述的生物工程方法，其特征在于：
所述的该原核表达载体pET28a-CKBB中含有编码人源肌酸激酶蛋白的一段基因序列(SEQ1)。
5.根据权利要求4中所述的生物工程方法，其特征在于：
所述基因序列(SEQ1)，其序列信息见说明书。
6.一对引物(primer1 and primer2)，用于扩增权利要求5中所述基因序列。
7.根据权利要求1所述的生物工程方法，其特征在于：
所述的高活性的肌酸激酶，是通过权利要求书1和2中所述的工程菌株在改良的培养基中进行大规模高密度培养，并分离和纯化得到高活性高纯度的肌酸激酶。
8.根据权利要求7所述的生物工程方法，其特征在于：
所述的改良的培养基包括：胰蛋白胨5-15g/L，酵母抽提物5-15g/L，K2HPO43H2O 10-30g/L，NaH2PO4 2H2O 5-20g/L，消泡剂0.05％-0.2％，并在接种前加入卡那霉素至最终浓度20-100mg/L，无菌MgSO4至终浓度0.5-1.5g/L，无菌葡萄糖至终浓度2-10g/L，pH值调节至6.0-7.0。
9.根据权利要求7所述的生物工程方法，其特征在于所述高密度培养的方法包括以下步骤：
在发酵罐中进行补料分批高密度发酵，将pH值控制在6.0-7.0、温度控制在25℃-37℃、用于菌体富集的培养时间控制在2-8小时、IPTG诱导的工作浓度控制在0.05-1mM，并将诱导时间控制在10-30小时。
10.根据权利要求1所述的生物工程方法，其特征在于所述酶法催化合成的方法包括以下步骤：
以肌酸、三磷酸腺苷(ATP)为原料，添加镁离子和肌酸激酶，以甘氨酸和氢氧化钠缓冲对作为缓冲体系，在一定pH值、温度和时间范围内进行反应。
11.根据权利要求10所述的生物工程方法，其特征在于所述酶法催化合成的方法包括以下步骤：
反应液中ATP浓度控制在10-50mM，肌酸浓度控制在ATP浓度的2-5倍，氯化镁浓度控制在10-50mM，甘氨酸浓度控制在10-50mM，肌酸激酶的加入量控制在10-200mg/L，pH值控制在8.5-10.5，反应温度控制在20℃-50℃，反应时间控制在1-5小时。
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