CN105132489A

CN105132489A - 磷酸肌酸钠的制备方法

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Publication number: CN105132489A
Application number: CN201510679067.7A
Authority: CN
Inventors: 陈真文; 廖凤霞; 程永刚; 李玉林; 彭力; 周玲; 杨红涛; 毛先兵
Original assignee: XINAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: XINAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-10-16
Also published as: CN105132489B

Abstract

本发明公开了磷酸肌酸钠的制备方法，具体为将肌酸激酶固定在载体树脂上，得固定化肌酸激酶；然后以肌酸：ATP的摩尔比为2:1～10:1、温度为5～40℃、pH为7～11，镁离子摩尔浓度为0.5～5倍ATP摩尔浓度，在固定化肌酸激酶催化下反应至磷酸肌酸钠浓度恒定，收集反应液；然后将反应液用体积分数为40～70％的乙醇预处理，再将预处理后的磷酸肌酸钠母液上样，先洗脱肌酸，接着洗脱磷酸肌酸钠，收集洗脱液，结晶，干燥，得磷酸肌酸钠；利用本发明方法制得磷酸肌酸钠的纯度高，达到99.8％，不含硫酸根和钡离子，安全性好，符合药用标准。

Description

磷酸肌酸钠的制备方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及磷酸肌酸钠的制备方法。

背景技术

磷酸肌酸是人体内的活性物质。该物质现以磷酸肌酸钠四水合物的形式用于临床，主要用于治疗心学管疾病和代谢性疾病。该药市场巨大，前景广阔，用药人群广泛。截止到目前，磷酸肌酸钠原料有生物提取法、化学合成法、游离酶合成法，而国内目前尚未见固定化肌酸激酶合成磷酸肌酸钠产品的报道。生物提取法具有收率低，质量控制难度大等缺点。化学合成法的缺点在于反应过程激烈、反应条件不容易控制；制剂中会带入毒性大硫酸盐和钡盐，降低产品安全性；合成过程中产生大量的三废对环境造成了极大的污染,而对于三废的处理亦给企业造成了极大的技术负担和经济负担。游离酶合成法酶法优点在于反应套件温和，容易控制；完全模拟了人体内磷酸肌酸的合成过程，避免了化学合成过程中带来的各种有害中间体的残留,因此产品安全性更高；同时该法可操作性强，无污染，符合人们对现代药物合成的高效环保的需求,值得广泛推广应用。但游离酶合成法的缺点在于：酶只能一次性反应，使用效率低；酶反应完成后仍留在反应液中，不仅增加了纯化难度，而且更溶易残留在制剂中，降低用药安全性。而固定化酶即具有游离酶合成的优点，又能克服其缺点。但目前并无固定化酶合成磷酸肌酸钠的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供磷酸肌酸钠的制备方法，其制备方法简单，反应条件温和，并且收率高，纯度高，安全性好，对环境无污染，制得的磷酸肌酸钠符合药用要求。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

磷酸肌酸钠的制备方法，包括如下步骤：

(1)将肌酸激酶固定在载体树脂上，得固定化肌酸激酶；

(2)肌酸：ATP的摩尔比为2:1～10:1、温度为5～40℃、pH为7～11，镁离子摩尔浓度为0.5～5倍ATP摩尔浓度，在固定化肌酸激酶催化下反应至磷酸肌酸钠浓度恒定，收集反应液，记为磷酸肌酸钠母液；

(3)将磷酸肌酸钠母液用体积分数为40～70％的乙醇预处理，然后将预处理后的磷酸肌酸钠母液上样，然后用0.02～0.15M的电解质溶液作为洗脱液洗脱肌酸，再用0.2～0.8M的电解质溶液作为洗脱液洗脱磷酸肌酸钠，收集洗脱液，结晶，干燥，得磷酸肌酸钠。

优选的，所述肌酸激酶为兔肌酸激酶。

优选的，步骤(1)中，固定肌酸激酶的方法是在酶活力(IU)∶树脂(g)为40～100、温度为10-35℃、pH为8-10条件下固定0.5h以上。

更优选的，步骤(2)中，所述温度为25-35℃，所述pH为9-11，所述电解质溶液为氯化镁、氯化铵、氯化钠或氯化锌等。

优选的，步骤(3)中，所述上样的流速为1～4BV/h；所述洗脱肌酸的速度为1BV/h-4BV/h；所述洗脱磷酸肌酸钠的速度为2-4BV/h；所述结晶为在乙醇体积分数为75-90％、温度为0～25℃条件下静置2-48h结晶。

更优选的，步骤(1)中，所述兔肌酸激酶由以下方法制备：将兔肌肉细胞完全破碎，然后搅拌提取，离心，收集上清液，记为V1；向所得V1中加入NH₄Cl，调pH至7.0～9.0，然后搅拌并加入乙醇至乙醇体积分数为55～60％，离心，再次收集上清液，记为V2；向所得V2中加入镁离子溶液，然后逐滴补加乙醇至乙醇体积分数为55～60％，加毕搅拌，离心，收集沉淀，得兔肌酸激酶。

更优选的，破碎兔肌肉的方法为将兔肌肉去结缔组织和神经组织后切块加入浓度为0.01mol/L的KCl溶液中，然后破碎。

最优选的，所述离心是在0℃-35℃、8000r/min-10000r/min条件下离心5min以上。

本发明的有益效果在于：本发明公开了磷酸肌酸钠的制备方法，该方法采用固定化酶合成方法，合成效率高，对环境效益好，并且在分析纯化过程中无需引入有毒物质，安全性好；由于采用固定化酶催化合成，酶固定化率在100～75％左右，酶收率37.4％，固定化后与游离酶相比，最适pH由9.0拓宽到9.0～11.0的范围；在pH9.0的溶液中，半衰期为265h，是游离酶的3.6倍，即提高了在水溶液中的稳定性；最适温度与游离酶一致，在25～35℃；经试验验证固定化酶可反复使用一个月，而游离酶只能使用一次，能够降低酶催化合成的成本；同时由于适宜固定化酶反应的pH范围更宽，利于实际生成的控制，且同等条件下磷酸肌酸钠的产量是游离酶的2.5倍；并且本发明制得的磷酸肌酸钠纯度高，纯度达到了99.8％，符合药用标准。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为提取的肌酸激酶与市售肌酸激酶电泳结果。

图2为pH对肌酸激酶提取的影响。

图3为不同上样速度的穿透曲线。

图4为不同速度洗脱肌酸的试验结果。

图5为不同速度洗脱磷酸肌酸钠的试验结果。

图6为自制样品和磷酸肌酸钠标准品200～400nm扫描光谱图(A：自制样品；B：磷酸肌酸钠标准品)。

图7为自制样品和磷酸肌酸钠标准品红外光谱图。

图8为色谱分析ATP系列物质色谱图。

图9为色谱分析磷酸肌酸钠色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、提取肌酸激酶

提取肌酸激酶的方法，包括如下步骤：

(1)取冷冻的兔大腿肌肉380g，去除结缔组织和神经后切成小块，然后加入1100ml浓度为0.01mol/LKCl，再用绞肉机将兔肉打碎；

(2)将打碎的兔肉用缝隙为2μm左右的胶体磨破碎5～10分钟；然后在室温(25℃)下搅拌提取30min后，再在0℃条件下，以8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，记为V1；

(3)在V1中加入研细的NH₄Cl至NH₄Cl浓度为0.1mol/L，用5mol/LNH₄OH调pH至9.0，然后于室温(25℃)下搅拌30min，加入1.5倍V1体积的95％冷乙醇，再在室温(25℃)下搅拌2.5h，接着在0℃、8000r/min条件下离心10min，弃沉淀，再次收集上清液，记为V2，取样备用；

(4)在V2中加入2mol/L的MgSO₄(pH＝8.5)至终浓度为0.03mol/L，然后逐滴补加相当于MgSO₄体积1.5倍的95％的冷乙醇，加毕搅拌30min，再在0℃、8000r/min条件下离心10min，弃上清液，收集沉淀；

(5)将步骤(4)收集的沉淀称重，取少量的沉淀用pH9.0甘氨酸缓冲液进行溶解后，记为V3，备用；剩余的沉淀-20℃保存。

将380g的冷冻的兔肌肌肉经绞肉机绞肉和胶体磨粉碎后，经过氯化钾、氯化铵、硫酸镁、乙醇提取离心后，由V1到V3逐步纯化，测定对V1到V3的体积、总活力、回收率，结果如表1所示。

表1、肌酸激酶提取试验结果

注：各步骤的回收率是该步骤的总活性除以V1的总活性而得。

由表1可知，本发明的方法肌酸激酶的回收率为9.2％。

酶纯度检测：分别取V3样品、BIOBASICINC的肌酸激酶市售品适量，进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE电泳结果如图1所示，由软件分析可知，提取样品和市售样品的目标蛋白的纯度均在70％左右。

实施例2、温度对肌酸激酶提取的影响

温度对肌酸激酶的影响表现在两方面：其一是随温度的升高，肌酸激酶在盐溶液或水溶液中的溶解度增加；其二是随温度的升高，酶变性失活从而使比活力降低。

考虑到在实际生产中特别是大量提取酶时，为降低技术难度与生产成本，提取工艺应尽可能的简单易行。根据上述理论，研究了温度对肌酸激酶提取的影响情况。

设计A、B、C三组试验，A组试验在步骤(1)胶体磨破碎，步骤(3)(4)体积分数为95％的乙醇提取为室温(25℃)，其他步骤均为0℃；B组试验在离心时控制在35℃以下，其他全控制在室温(25℃)；C组离心时未控制温度，其他同A组，然后测定肌酸激酶总活性，结果为：

A、B组试验结果非常接近，其原因是两组的提取温度控制在0～35℃(室温)范围内，在该条件下酶比活力与蛋白量的乘积基本一致；C组活性非常小，通过分析发现，C组由于未控制离心机的温度，导致在高速离心时温度会超过40℃，甚至更高，在此高温下离心，会致酶失活严重从而导致总酶活低，因此应将提取温度应尽量控制在0～35℃内。

实施例3、pH对肌酸激酶提取的影响

酶(蛋白质)是等电点的两性物质，若溶液的pH与等电点吻合，则酶易在该种情况下沉淀出来。因此在进行酶的提取时，溶液pH值的选择应在偏离等电点两侧的范围内；一般来说，等电点偏酸的物质用偏碱性的提取液，而偏碱性的物质用偏酸性的提取液提取。按照实施例1的方法，分别在pH为6、7、8、9和10条件下提取，然后检测肌酸激酶活性，将结果如图2所示。由图2可知，提取液pH在9时每毫升酶液的活力最高，在7～9的范围内维持较高的活性。

实施例4、固定化兔肌酸激酶

固定化兔肌酸激酶，具体步骤如下：

(1)树脂活化

a、称取100g树脂，加入400ml0.1M的pH8.0为磷酸盐缓冲液中，搅拌15分钟后，用磷酸或氢氧化钠调节pH7.8-8.2，1h后过滤抽干，回收树脂；

b、将步骤a回收的树脂加入400ml质量分数为2％的戊二醛缓冲液中，然后在25℃、搅拌1h，过滤，用去离子水洗涤，得活化树脂。

(2)固定化

将步骤(1)活化的树脂按肌酸激酶活力(IU)∶树脂(g)＝40、温度为25℃、pH为9.0，条件下固定0.5，得固定化兔肌酸激酶。

(3)固定化收率16.3％。

实施例5、酶活力/树脂比对固定化的影响

将固定化的温度设为25℃、酶液pH9.0、固定化时间5h,酶活力(IU)/树脂(g)比在40～150的范围内变动。其结果如表2所示。

表2、酶活力/树脂比对固定化的影响

实施例6、温度对固定化的影响

将酶活力/树脂比设定为70、酶液pH9.0、固定化时间3h，固定化温度在5℃～45℃的范围内变动，然后测定固定化兔肌酸激酶的活性，结果如表3所示。

表3、温度对固定化的影响

实施例7、时间对固定化的影响

将酶活力/树脂比设定为70、酶液pH9.0、固定化温度设定在25℃，固定化时间在0.5～5h范围内变动，然后测定固定化兔肌酸激酶的活性，结果如表4所示。

表4、时间对固定化的影响

实施例8、pH对固定化的影响

由于适合游离肌酸激酶反应生成磷酸肌酸的pH在9左右，因此将pH对固定化影响的试验范围设定在8～10左右，将酶活力/树脂比设定为70、固定化温度设定在25℃、固定化时间在2h，然后测定固定化兔肌酸激酶的活性，结果如表5所示。

表5、pH对固定化的影响

实施例9、磷酸肌酸钠的合成

固定反应温度在25℃、镁离子浓度为1.5倍ATP摩尔浓度、研究不同的肌酸和ATP的投料比对产率的影响，结果如表6所示。

表6、肌酸和ATP不同投料比检测结果

实施例10、不同反应温度对收率的影响

固定镁离子浓度为1.5倍ATP摩尔浓度、投料摩尔比为6:1、研究不同的反应温度对收率的影响，结果如表7所示。

表7、不同反应温度对收率的影响

实施例11、不同镁离子浓度对收率的影响

固定投料摩尔比为6:1、反应温度25℃，研究对收率的影响，结果如表8所示。

表8、不同镁离子浓度对收率的影响

实施例12、磷酸肌酸钠母液预处理

肌酸、磷酸肌酸钠、ADP、ATP均微溶于乙醇，在不同浓度的乙醇溶液中，各物质的溶解度不一样，因此取3份磷酸肌酸钠母液适量，每份溶液加入无水乙醇，使乙醇的体积分数分别为40％、50％、70％，溶液产生沉淀，检测上清液各成分的含量，结果如表9所示。

表9、母液预处理试验结果

实施例13、上样流速

分别以1BV/h、2BV/h、4BV/h、8BV/h的上样速度进行上样，监测流出液中的磷酸肌酸钠浓度，绘制穿透曲线，结果如图3所示。

实施例14、洗脱剂浓度

取上样后的树脂200g分为4份，用0.05M、0.2M、0.4M、0.8M的氯化镁作为洗脱剂(500ml)进行洗脱；分析各浓度下的洗脱液中的成分及含量，结果表10所示。

表10、不同浓度的洗脱剂洗脱结果

本实施例中，也可以以氯化铵、氯化钠或氯化锌等电解质为洗脱液，同样可以获得上述效果。

实施例15、洗脱流速选择

根据洗脱剂浓度的选择结果，拟定采取如下的洗脱程序：先用0.05M溶液进行洗脱，监测肌酸的含量，当流出液无肌酸时再用0.4M溶液进行洗脱并监测磷酸肌酸的浓度。分别以1BV/h、2BV/h、4BV/h、8BV/h的流速进行洗脱，其结果如图4和5所示。

实施例16、乙醇浓度的选择

分别取4份20ml经树脂纯化后的溶液，含磷酸肌酸钠浓度为16mg/ml，各加入适量的无水乙醇，使其浓度为60％、75％、80％、90％，20℃静置48h，然后检测磷酸肌酸钠的收率和纯度，结果如表11所示。

表11、不同乙醇浓度对结晶的影响

实施例17、结晶温度的选择

分别取4份含磷酸肌酸钠浓度为16mg/ml的溶液20ml，加入4倍量的用无水乙醇，于-20℃、0℃、15℃、25℃静置2h，然后检测磷酸肌酸钠的收率和纯度，结果如表12所示。

表12、不同温度对结晶的影响

实施例18、磷酸肌酸钠定性

分别取纯化的磷酸肌酸钠和磷酸肌酸钠标准品配制成浓度为0.4mg/ml的溶液，然后在200-400nm扫描，结果如图6所示。红外光谱扫描结果如图7所示。

实施例19、有关物质分析

ATP、ADP检测：

将纯化的磷酸肌酸钠用十八烷基键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g、磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，调pH到7.0，加入1.61g四丁基溴化铵，加水定容到1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；检测波长259nm。供试品配制成含磷酸肌酸钠的浓度为3.0mg/ml的溶液，备用；然后取20μl进样，记录色谱图，如图8所示。ADP、ATP在限度范围内。

有关物质检测：

用十八烷基键合硅胶为填充剂；0.2％的磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的溶液为流动相；检测波长210nm，结果如图9所示。有关物质在限度内。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将肌酸激酶固定在载体树脂上，得固定化肌酸激酶；

2.根据权利要求1所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：所述肌酸激酶为兔肌酸激酶。

3.根据权利要求1所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，固定肌酸激酶的方法是在酶活力(IU)∶树脂(g)为40～100、温度为10-35℃、pH为8-10条件下固定0.5h以上。

4.根据权利要求1所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述温度为25-35℃，所述pH为9-11。

5.根据权利要求1所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(2)，所述电解质溶液为氯化镁、氯化铵、氯化钠或氯化锌。

6.根据权利要求1所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述上样的流速为1～4BV/h；所述洗脱肌酸的速度为1BV/h-4BV/h；所述洗脱磷酸肌酸钠的速度为2-4BV/h；所述结晶为在乙醇体积分数为75-90％、温度为0～25℃条件下静置2-48h结晶。

7.根据权利要求2所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述兔肌酸激酶由以下方法制备：将兔肌肉细胞完全破碎，然后搅拌提取，离心，收集上清液，记为V1；向所得V1中加入NH₄Cl，调pH至7.0～9.0，然后搅拌并加入乙醇至乙醇体积分数为55～60％，离心，再次收集上清液，记为V2；向所得V2中加入镁离子溶液，然后逐滴补加乙醇至乙醇体积分数为55～60％，加毕搅拌，离心，收集沉淀，得兔肌酸激酶。

8.根据权利要求7所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：破碎兔肌肉的方法为将兔肌肉去结缔组织和神经组织后切块加入浓度为0.01mol/L的KCl溶液中，然后破碎。

9.根据权利要求7所述磷酸肌酸钠的制备方法，其特征在于：所述离心是在0℃-35℃、8000r/min-10000r/min条件下离心5min以上。