CN110294775A - 一种磷酸肌酸钠的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸肌酸钠的纯化方法，包括以下步骤：1)向酶法制备磷酸肌酸钠的反应液中添加氢氧化钠，将反应液的pH值调节至9‑11.5，静止放置1‑6小时，弃沉淀留上清液，待用；2)将上清液通过阳离子交换树脂，收集穿液；3)将穿液通过弱阴离子交换树脂，收集穿液；4)将穿液通过强阴离子交换树脂吸附、洗脱磷酸肌酸钠；5)将磷酸肌酸钠洗脱液通过纳滤浓缩和/或减压浓缩的方式进行浓缩；6)使用乙醇沉淀磷酸肌酸钠；7)30‑50℃干燥，得成品。本发明的纯化流程用于纯化酶法生成磷酸肌酸钠的反应液，纯化收率高达90％以上；纯化出的磷酸肌酸钠纯度高，达到98.0％以上。
Description
技术领域
本发明涉及化学技术领域，特别涉及一种磷酸肌酸钠的纯化方法。
背景技术
磷酸肌酸是一种高能磷酸化合物，参与人体内能量代谢，维持ATP浓度。磷酸肌酸钠是其钠盐形式，可作为心肌保护作用的药物，应用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治疗，尤其是心脏外科手术治疗。目前，磷酸肌酸钠有化学合成法和酶促合成法(简称酶法)两种合成方法，前者反应步骤复杂、条件苛刻、环境污染严重，后者通过肌酸激酶催化底物肌酸和ATP一步反应生成磷酸肌酸钠，具有反应条件温和、成分稳定易于纯化的特点。尤其是近年来ATP再生技术的应用，使磷酸肌酸钠产量大幅提高，随之生产成本也大幅降低，因此，酶法生产有进一步取代化工合成法的趋势。
酶法生产工艺的改进，使反应液成分发生较大变化，磷酸肌酸钠生成量成倍提高，而ATP含量有可能大量减少，另外，镁离子等离子在反应液中的浓度也有所变化，原有的磷酸肌酸钠的纯化方法不再适用于新的酶法制备产物的纯化。另外，旧有的磷酸肌酸钠的纯化工艺中或者会引入钡离子等成分，对环境造成污染；或者大量使用乙醇，生产成本过大且存在安全隐患。
因此，酶法生产工艺的进步需要开发新的纯化工艺。
发明内容
本发明提供了一种磷酸肌酸钠的纯化方法，通过该方法对酶法制备磷酸肌酸钠的反应液进行提纯，产品纯度高，收率高，生产成本低，且节能环保。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种磷酸肌酸钠的纯化方法，包括以下步骤：
1)向酶法制备磷酸肌酸钠的反应液中添加氢氧化钠，将反应液的pH值调节9-11.5，静止放置1-6小时，弃沉淀留上清液，待用；
2)将上清液通过阳离子交换树脂，收集穿液；
3)将穿液通过弱阴离子交换树脂，收集穿液；
4)将穿液通过强阴离子交换树脂吸附、洗脱磷酸肌酸钠；
5)将磷酸肌酸钠洗脱液通过纳滤浓缩和/或减压浓缩的方式进行浓缩；
6)使用乙醇沉淀磷酸肌酸钠；
7)30-50℃干燥，得成品。
优选地，上述技术方案中，步骤1)还包括处理上清液：
11)将步骤1)的上清液通过离心和/或过滤的方式去除上清液中的不溶物沉淀；
12)将步骤11)去除沉淀后的上清液进行超滤，去除大分子物质。优选地，超滤膜截留分子量5-100kDa。
优选地，上述技术方案中，所述方法还包括：使用活性炭去除内毒素，所述活性炭使用浓度为0.01-0.5％。
优选地，上述技术方案中，所述步骤1)的反应液为酶法制备磷酸肌酸钠反应结束后的料液，所述反应液中包含：磷酸肌酸钠、肌酸、ATP、ADP及AMP的一种或几种组合、镁离子、和/或锰离子，以及肌酸激酶。
优选地，上述技术方案中，所述反应液中还包括ATP再生酶。
优选地，上述技术方案中，所述反应液中还包括锌离子、钾离子、钙离子、铵离子、氯离子、磷酸根、硫酸根及醋酸根中的一种或多种组合。
优选地，上述技术方案中，所述步骤5)中纳滤膜的截留分子量为200-300，磷酸肌酸钠浓缩后的浓度为200-500mM。
优选地，上述技术方案中，所述6)中乙醇的浓度为70-90％，温度范围-15℃-15℃。
优选地，上述技术方案中，所述步骤2)中使用的阳离子交换树脂含氨基膦酸基团，优选LX-160、D860和LSC-500，上样流速2-6BV/h；步骤3)中使用的弱阴离子交换树脂含伯胺基、仲胺基或叔胺基基团，优选D315、D351和D354，上样流速2-6BV/h；步骤4)中使用的强阴离子交换树脂含季胺基基团，优选711、717、D201、D202、D293、D296、LX-67和LX-958，上样流速1-3BV/h。
优选地，上述技术方案中，所述步骤4)的洗脱过程包括：
41)纯水洗脱，洗脱流速1-6BV/h；
42)20-80mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速1-6BV/h；
43)100-300mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速1-6BV/h，收集此步穿液。
本发明的原理如下：
步骤1)通过加入氢氧化钠调整了反应液的pH值，使得酶失活，使反应液中的物质更加稳定，同时沉淀部分镁离子、和/或锰离子，有利于后续纯化。生成的沉淀通过离心和/或过滤的方式去除；再将去除沉淀后的上清液进行超滤，去除大分子物质，主要为反应用酶。更易于后续纯化。
步骤2)使用阳离子交换树脂，其目的是除掉料液中的镁离子、锰离子、钙离子和锌离子等二价离子。
步骤3)使用弱阴离子交换树脂，其目的是除掉上一步下样中的磷酸根、硫酸根和醋酸根离子。
步骤4)使用强阴离子交换树脂，吸附、洗脱磷酸肌酸钠。使用20-80mM氯化钠除肌酸等杂质；使用100-300mM氯化钠洗脱磷酸肌酸钠。
步骤5)使用纳滤浓缩和/或减压浓缩的方式，浓缩上步洗脱液中含磷酸肌酸钠的部分。
步骤6)使用乙醇沉淀磷酸肌酸钠。在一些药品的纯化过程中，往往在反应开始的第一步就选择乙醇预处理。虽然乙醇是可回收的，但是在工业生产中，预处理需要使用大量的乙醇，势必导致成本的提成，同时乙醇的存储也是很大的问题。本发明将乙醇浓缩设置到最后，不仅使得乙醇的使用量大大降低，同时回收率得到了保证。
本申请获得的磷酸肌酸钠的纯度高，可满足医药领域的使用。因此，其纯化过程中可添加活性炭去除内毒素等流程，使纯化成品达到药典标准。
本发明的反应液为酶促法生产磷酸肌酸钠的料液，反应结束时的溶液中含有磷酸肌酸钠、肌酸、ATP、ADP及AMP、镁离子、和/或锰离子，以及肌酸激酶。当然，也可能含有ATP再生酶。除此之外，反应液中还可能含有锌离子、钾离子、钙离子、铵离子、氯离子、磷酸根、硫酸根及醋酸根中的一种或多种。其中，磷酸肌酸钠的浓度为30-150mM，ATP、ADP和AMP的总浓度为0.2-30mM，镁离子、和/或锰离子总浓度为20-200mM。
关于各种交换树脂的选择，本发明有严格的要求，步骤2)的阳离子交换树脂含氨基膦酸基团，优选LX-160、D860和LSC-500。步骤3)中使用的弱阴离子交换树脂含伯胺基、仲胺基或叔胺基基团，优选D315、D351和D354，此类树脂不易吸附磷酸肌酸钠，但对无机阴离子有较强吸附能力。步骤4)中使用的强阴离子交换树脂含季胺基基团，优选711、717、D201、D202、D293、D296、LX-67和LX-958，上样流速1-3BV/h。上述的各种树脂均为市面所售。
本发明采用3步树脂法，关于这3步树脂法是要严格按照本发明的顺序进行。由于产品磷酸肌酸钠在弱碱性条件下较稳定这一特殊性，整个纯化流程需在弱碱性条件下进行。如首先不使用阳离子树脂去除镁盐，则会导致在后续步骤中出现沉淀导致树脂堵塞；如接下来不使用弱阴离子交换树脂除去吸附力较强的无机阴离子，则会影响最后一步离子交换层析树脂的吸附载量、磷酸肌酸钠的纯度以及收率。步骤3)使用的阳离子树脂与步骤4)使用的弱阴离子树脂对磷酸肌酸钠的吸附量几乎为零，通过这两种树脂时磷酸肌酸钠均是流穿形式，因此添加这两步离子交换基本不影响磷酸肌酸钠在整个离子交换层析步骤的收率。
本发明的各个步骤之间是一个不可分割的整体，其中最重要的则是步骤1)、2)、3)及4)。如无步骤1)，反应液中物质成份不稳定，且镁离子等二价离子浓度高，影响后续的纯化效果；如无步骤2)-4)，无法将磷酸肌酸钠纯化至纯度98.0％以上，且收率90％以上，无法完成整个的纯化效果。
本发明的上述技术方案，具有如下有益效果：
1)此纯化流程用于纯化酶法合成的磷酸肌酸钠，纯化收率高达90％以上；
2)经过上述步骤，尤其是经过2)-4)三步离子交换层析的组合步骤，纯化出的磷酸肌酸钠纯度高，98.0％以上，检测指标可达中国药典的标准；
3)经过步骤1)调节pH值至碱性后，磷酸肌酸钠稳定，且反应液成分稳定，便于后续纯化；
4)整个纯化流程看似步骤多，实则十分简单，三步离子交换层析可以直接串联使用，生产控制简单；
5)纯化流程放大效果良好，可用于吨级反应液的纯化；
6)整个纯化流程没有添加任何重金属离子及有毒物质，除乙醇用于沉淀外没有添加任何有机溶剂，只有无机酸、碱及盐的添加，环境污染较小；
7)所添加的乙醇仅用于沉淀浓缩液中的磷酸肌酸钠，由于浓缩液中磷酸肌酸钠的浓度较高，因此乙醇使用量较少，不仅在工业生产中降低了生产成本，在工厂药品安全储存方面也减轻了压力。
附图说明
图1为本发明的磷酸肌酸钠的纯化方法的流程图。
图2为本发明实施例1待纯化料液的高效液相色谱图。
图3为本发明实施例1磷酸肌酸钠纯化后的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
酶法生产磷酸肌酸钠的反应液100L，主要含有2.61kg约79.8mM磷酸肌酸钠(以磷酸肌酸钠含水物，分子量327.15计算)，肌酸约50mM、硫酸镁50mM、磷酸盐180mM，还含有ATP、ADP和AMP总计2.0mM，以及反应和再生用酶。
使用HPLC检测该料液，色谱图见图2。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速1ml/min，流动相为含有0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的水溶液，pH值使用氨水调节至6.6。
使用如下步骤纯化该反应液：
(1)使用NaOH调节反应液pH值至11.5，室温放置1小时，反应液成分基本不再变化；使用管式离心机离心，收集上清，去除反应液中的沉淀，离心速度3000rpm。
(2)使用超滤设备过滤离心上清液，超滤膜截留分子量大小为20kDa，透析流速100L/h，收集透析液。
(3)使用LX-160树脂去除溶液中的镁离子。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速3BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速3BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(4)使用D354树脂去除磷酸盐、硫酸盐、ATP、ADP及AMP等。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速3BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速3BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(5)使用LX-67树脂吸附磷酸肌酸钠并洗脱。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速1BV/h。上样完毕后，首先使用纯水洗脱，洗脱流速1BV/h；然后使用40mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速1BV/h；再使用200mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速1BV/h，收集此步穿液。
(6)使用纳滤设备过滤上步收集液，纳滤膜截留分子量200-300，调节pH值至9.5，收集截留液，至浓缩液中磷酸肌酸钠含量达到250mM。
(7)加入0.2％的活性炭除内毒素，过滤收集滤液。
(8)加入乙醇至乙醇浓度80％，8℃放置4小时，期间缓慢搅拌。过滤得晶体。
(9)收集晶体后，放入干燥箱，温度控制30℃，烘干16小时，收集干粉2.45kg，纯化总体收率93.8％。
将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上。检测结果显示磷酸肌酸钠纯度达到99.0％，色谱图见图3。
实施例2
使用如下步骤纯化实施例1所述的反应液：
(1)使用NaOH调节反应液pH值至10.0，室温放置3小时，反应液成分基本不再变化；使用管式离心机离心，收集上清，去除反应液中的沉淀，离心速度3000rpm。
(2)使用超滤设备过滤离心上清液，超滤膜截留分子量大小为5kDa，透析流速80L/h，收集透析液。
(3)使用LSC-500树脂去除溶液中的镁离子。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速3BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速3BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(4)使用D351树脂去除磷酸盐、硫酸盐、ATP、ADP及AMP等。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速3BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速3BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(5)使用D201树脂吸附磷酸肌酸钠并洗脱。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速2BV/h。上样完毕后，首先使用纯水洗脱，洗脱流速2BV/h；然后使用50mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速2BV/h；再使用200mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速2BV/h，收集此步穿液。
(6)使用纳滤设备过滤上步收集液，纳滤膜截留分子量200-300，调节pH值至9.2，过滤收集截留液。再用减压浓缩的方式对纳滤截留液进行浓缩，压力为-0.08MPa，至浓缩液中磷酸肌酸钠含量达到500mM。
(7)加入0.2％的活性炭除内毒素，过滤收集滤液。
(8)加入乙醇至乙醇浓度70％，0℃放置5小时，期间缓慢搅拌。过滤得晶体。
(9)收集晶体后，放入干燥箱，温度控制30℃，烘干16小时，收集干粉2.42kg，纯化总体收率90％以上。
将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上。检测结果显示磷酸肌酸钠纯度达到98.0％以上。
实施例3
使用如下步骤纯化实施例1所述的反应液：
(1)使用NaOH调节反应液pH值至9.0，室温放置6小时，反应液成分基本不再变化；使用陶瓷膜过滤反应液，陶瓷膜孔径2.0μm，透析流速100L/h，收集透析液。
(2)使用超滤设备过滤离心上清液，超滤膜截留分子量大小为5kDa，透析流速80L/h，收集透析液。
(3)使用D860树脂去除溶液中的镁离子。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速6BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速6BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(4)使用D354树脂去除磷酸盐、硫酸盐、ATP、ADP及AMP等。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速6BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速6BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(5)使用LX-67树脂吸附磷酸肌酸钠并洗脱。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速3BV/h。上样完毕后，首先使用纯水洗脱，洗脱流速6BV/h；然后使用80mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速6BV/h；再使用300mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速6BV/h，收集此步穿液。
(6)使用纳滤设备过滤上步收集液，纳滤膜截留分子量200-300，调节pH值至9.5，收集截留液，至浓缩液中磷酸肌酸钠含量达到200mM。
(7)加入0.5％的活性炭除内毒素，过滤收集滤液。
(8)加入乙醇至乙醇浓度90％，15℃放置4小时，期间缓慢搅拌。过滤得晶体。
(9)收集晶体后，放入干燥箱，温度控制40℃，烘干12小时，收集干粉2.39kg，纯化总体收率90％以上。
将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上。检测结果显示磷酸肌酸钠纯度达到98.0％以上。
实施例4
使用如下步骤纯化实施例1所述的反应液：
(1)使用NaOH调节反应液pH值至10.0，室温放置3小时，反应液成分基本不再变化；使用板框过滤反应液，板框孔径400目，去除沉淀，收集透析液。
(2)使用超滤设备过滤透析液，超滤膜截留分子量大小为100kDa，透析流速120L/h，收集透析液。
(3)使用LSC-500树脂去除溶液中的镁离子。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速2BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速2BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(4)使用D315树脂去除磷酸盐、硫酸盐、ATP、ADP及AMP等。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速2BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速2BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(5)使用717树脂吸附磷酸肌酸钠并洗脱。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速1BV/h。上样完毕后，首先使用纯水洗脱，洗脱流速1BV/h；然后使用20mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速1BV/h；再使用100mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速1BV/h，收集此步穿液。
(6)使用纳滤设备过滤上步收集液，纳滤膜截留分子量200-300，调节pH值至9.5，过滤收集截留液。再用减压浓缩的方式对纳滤截留液进行浓缩，压力为-0.08MPa，至浓缩液中磷酸肌酸钠含量达到500mM。
(7)加入0.01％的活性炭除内毒素，过滤收集滤液。
(8)加入乙醇至乙醇浓度80％，-15℃放置1小时，期间缓慢搅拌。过滤得晶体。
(9)收集晶体后，放入干燥箱，温度控制50℃，烘干10小时，收集干粉2.37kg，纯化总体收率90％以上。
将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上。检测结果显示磷酸肌酸钠纯度达到98.0％以上。
实施例5
使用如下步骤纯化实施例1所述的反应液：
步骤(1)-(6)与实施例1相同。
(7)不加入活性炭，直接加入乙醇至乙醇浓度80％，8℃放置4小时，期间缓慢搅拌。过滤得晶体。
(8)收集晶体后，放入干燥箱，温度控制30℃，烘干16小时，收集干粉2.47kg，纯化总体收率90％以上，基本同实施例1。
实施例6
使用如下步骤纯化实施例1所述的反应液：
(1)使用NaOH调节反应液pH值至9.0，室温放置6小时，反应液成分基本不再变化。
(2)使用D840树脂去除溶液中的镁离子。将上步料液直通过离子交换柱，上样流速1BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速1BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(3)使用D354树脂去除磷酸盐、硫酸盐、ATP、ADP及AMP等。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速6BV/h；上样完毕后使用纯水顶洗，顶洗流速6BV/h，收集上样及顶洗穿液。
(4)使用LX-67树脂吸附磷酸肌酸钠并洗脱。将上步收集液通过离子交换柱，上样流速3BV/h。上样完毕后，首先使用纯水洗脱，洗脱流速3BV/h；然后使用80mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速3BV/h；再使用300mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速3BV/h，收集此步穿液。
(5)使用纳滤设备过滤上步收集液，纳滤膜截留分子量200-300，调节pH值至9.5，过滤收集截留液，至浓缩液中磷酸肌酸钠含量达到200mM。
(6)加入0.5％的活性炭除内毒素，过滤收集滤液。
(7)加入乙醇至乙醇浓度90％，15℃放置4小时，期间缓慢搅拌。过滤得晶体。
(8)收集晶体后，放入干燥箱，温度控制40℃，烘干12小时，收集干粉2.37kg，纯化总体收率90％。
将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上。检测结果显示磷酸肌酸钠纯度达到98.0％以上。
实施例7
挑选可吸附并洗脱磷酸肌酸钠的阴离子交换树脂，如下表的所示，以下树脂对磷酸肌酸钠的吸附载量较大，且肌酸与磷酸肌酸钠分离效果较佳。
表1.阴离子树脂对比
实施例8
更换需纯化的反应液，此反应液为酶法生产磷酸肌酸钠的反应液100L，主要含有5.0kg约150mM磷酸肌酸钠(以磷酸肌酸钠含水物，分子量327.15计算)，肌酸约100mM、醋酸镁200mM、磷酸盐320mM，还含有ATP、ADP和AMP总计30mM，以及酶。
使用实施例1所述方法纯化该反应液，最终得干粉4.62kg，纯化总体收率90％以上。将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上，磷酸肌酸钠纯度达到98.0％以上。
实施例9
更换需纯化的反应液，此反应液也为酶法生产磷酸肌酸钠的反应液100L，主要含有1.0kg约30mM磷酸肌酸钠(以磷酸肌酸钠含水物，分子量327.15计算)，肌酸约30mM、氯化镁10mM、氯化锰10mM、磷酸盐20mM，还含有ATP、ADP和AMP总计0.2mM，以及酶。
使用实施例2所述方法纯化该反应液，最终得干粉0.91kg，纯化总体收率高于90％。将干粉溶于水，使用HPLC检测，检测条件同上。检测结果显示磷酸肌酸钠纯度达到98.0％以上。
实施例10
将实施例1中纯化样品进一步按照中国药典2015版标准检测，检测结果见下表：
表2.磷酸肌酸钠检测报告
对比例1
使用如下步骤纯化实施例1所述反应液：
步骤(1)-(2)同实施例3。
(3)直接使用LX-67树脂吸附磷酸肌酸钠并洗脱。将上步收集液直接通过离子交换柱，上样流速3BV/h，料液上样至约0.3BV时，镁盐形成沉淀造成离子交换柱堵塞。将上样流速改为0.3BV/h，缓慢上样，上样至1.0BV时，磷酸肌酸钠直接穿出。最后上样流速改为0.3BV/h，只上样0.5BV停止上样，使用纯水洗脱，洗脱流速1BV/h；然后使用80mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速1BV/h；再使用300mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速1BV/h，收集此步穿液。
后续步骤同实施例3。收集出的干粉纯度82.3％。
在本发明的磷酸肌酸钠的纯化方法中，虽然三种离子交换树脂中，最后一步用到的强阴离子交换树脂起到了直接分离磷酸肌酸钠的作用，但是没有本发明所述前两种离子交换树脂的作用，达不到本发明纯化方法所述的纯化效果。所以，本发明的纯化方法使用的三步树脂分离法是一个整体，不可分割。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向酶法制备磷酸肌酸钠反应液中添加氢氧化钠，将反应液的pH值调节至9-11.5，静止放置1-6小时，弃沉淀留上清液，待用；
2)将上清液通过阳离子交换树脂，收集穿液；
3)将穿液通过弱阴离子交换树脂，收集穿液；
4)将穿液通过强阴离子交换树脂吸附、洗脱磷酸肌酸钠；
5)将磷酸肌酸钠洗脱液通过纳滤浓缩和/或减压浓缩的方式进行浓缩；
6)使用乙醇沉淀磷酸肌酸钠；
7)30-50℃干燥，得成品。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)还包括处理上清液：
11)将步骤1)的上清液通过离心和/或过滤的方式去除上清液中的不溶物沉淀；
12)将步骤11)去除沉淀后的上清液进行超滤，去除大分子物质。
3.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括：使用活性炭去除内毒素，所述活性炭使用浓度为0.01-0.5％。
4.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)的反应液为酶法制备磷酸肌酸钠反应结束后的料液，所述反应液中包含：磷酸肌酸钠、肌酸、ATP、ADP及AMP的一种或几种组合、镁离子、和/或锰离子，以及肌酸激酶。
5.根据权利要求4所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述反应液中还包括锌离子、钾离子、钙离子、铵离子、氯离子、磷酸根、硫酸根及醋酸根中的一种或多种组合，和/或ATP再生酶。
6.根据权利要求2所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述步骤12)中超滤膜截留分子量5-100kDa。
7.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，
步骤2)中使用的阳离子交换树脂含氨基膦酸基团，优选LX-160、D860和LSC-500，上样流速2-6BV/h；
步骤3)中使用的弱阴离子交换树脂含伯胺基、仲胺基或叔胺基基团，优选D315、D351和D354，上样流速2-6BV/h；
步骤4)中使用的强阴离子交换树脂含季胺基基团，优选711、717、D201、D202、D293、D296、LX-67和LX-958，上样流速1-3BV/h。
8.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)的洗脱过程包括：
41)纯水洗脱，洗脱流速1-6BV/h；
42)20-80mM NaCl洗脱，除掉肌酸等杂质，洗脱流速1-6BV/h；
43)100-300mM NaCl洗脱磷酸肌酸钠，洗脱流速1-6BV/h，收集此步穿液。
9.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述步骤5)中纳滤膜的截留分子量为200-300，磷酸肌酸钠浓缩后的浓度为200-500mM。
10.根据权利要求1所述的一种磷酸肌酸钠的纯化方法，其特征在于，所述6)中乙醇的浓度为70-90％，温度范围-15℃-15℃。
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