CN101991601B - 一种尿多酸肽组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种尿多酸肽组合物的制备方法，所述尿多酸肽组合物按照如下步骤制备：(1)将新鲜人尿液酸化，过滤，滤液进行超滤；(2)将超滤后的滤液使用树脂柱柱层析并收集洗脱液；(3)将收集的洗脱液加入氢氧化钡溶液，然后脱盐、脱色处理；(4)将脱色处理得到的溶液进行病毒灭活；(5)将灭活后得到溶液调节pH到6.0～6.5后浓缩，浓缩液调节pH到7.0～8.0后进行超滤，优选为浓缩液调节pH到7.0～7.5后进行超滤，收集滤液即得。本发明所提供的制备方法简单易行，适于工业化生产；本发明方法制备的尿多酸肽纯度高，杂质含量低，患者用药更加安全；本发明方法在大幅度提高产品纯度的基础上对于收率没有明显的影响。

Description

一种尿多酸肽组合物的制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体的说，涉及一种尿多酸肽组合物的制备方法。

背景技术

尿多酸肽是从健康人尿中分离提取、纯化的一组细胞分化诱导剂。临床前实验表明，尿多酸肽对多种肿瘤具有抑制生长、诱导分化凋亡的作用。研究表明，尿多酸肽可明显改善晚期癌症患者的生活质量，在肿瘤临床治疗中具有一定的应用价值。当尿多酸肽与其它抗肿瘤药物联合给药时，能够更为显著的提高治疗效果。

目前常用的尿液提取方法主要有如下方法：

专利申请99122050.1公开了一种尿多酸肽组合物的制备方法，将新鲜尿酸化，过滤除去酸化尿中的大颗粒；超滤除去酸化尿中分子量较大的有机物质，将超滤后的酸化尿加入吸附柱内，吸附其中的有效成分；用软水洗涤未被吸附剂吸附但残留在吸附剂中的无机物及亲水性有机物用醇洗脱吸附在吸附柱上的有效成分；收集有色流出液，浓缩后，干燥得到干品；加水溶解，用碱调整pH至中性，低温静置析出浓缩过程中形成的杂质，经除热源、除病毒等工艺进一步纯化。

专利申请200410000753.9公开了一种制备方法：将新鲜人尿经酸化、过滤，树脂柱吸附，洗脱后，经低pH值乙醇病毒灭活，再减压浓缩，过滤得到尿多酸肽组合物。经过该方法处理，尿液中的大量杂质，如尿素等难以清除干净，对于人们的用药安全产生威胁。

上述专利公开了尿多酸肽的提取工艺，但随着生物技术的不断发展和对药品安全要求的不断提高，为了更进一步减少提取物中的杂质和病毒，保证有效成分能充分发挥药效，还需对尿提取物的提取工艺、灭活病毒工艺的验证等方面做进一步研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种尿多酸肽的制备方法，本方法制备的尿多酸肽有效成分含量高，杂质含量低，作为药品使用安全系数高。

一种尿多酸肽组合物的制备方法，所述尿多酸肽组合物按照如下步骤制备：

(1)将新鲜人尿液酸化，过滤，滤液进行超滤；

(2)将超滤后的滤液使用树脂柱柱层析并收集洗脱液；

(3)将收集的洗脱液加入氢氧化钡溶液，然后脱盐、脱色处理；

(4)将脱色处理得到的溶液进行病毒灭活；

(5)将灭活后得到溶液调节pH到6.0～6.5后浓缩，浓缩液调节pH到7.0～8.0后进行超滤，优选为浓缩液调节pH到7.0～7.5后进行超滤，收集滤液即得。

尿素是蛋白质分解后的产物，在尿液中含量非常高。以往的尿多酸肽制备中，仅仅采用柱层析和超滤难以完全去除其中含有的尿素，导致最终产品中尿素含量较高。本发明在使用树脂柱柱层析后加入氢氧化钡，使尿素与之发生化学反应，产生碳酸钡沉淀和氨气、水。选择氢氧化钡，是因为钡盐可以用弱酸性阳离子树脂除去。增加除尿素的反应，降低药品中的铵离子，铵离子对肝脏有损害。发生的是沉淀反应。氢氧化钡溶液优选浓度为5％，用量根据实际产量确定。可以完全去除，氨气用稀硫酸或水处理。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(1)酸化为将尿液先调节pH为2～5，经30～90目筛网过滤后再调节pH为2～3；优选为将尿液先调节pH为2～4，经50～70目筛网过滤后再调节pH为1.7。

本发明分两阶段调节pH值，第一次调节pH2～4，是防止尿液腐败，第二次调节pH1.7，增加有效成分的吸附。本发明还优选采用盐酸调节pH值，更进一步优选采用浓度为2mol/L的盐酸。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(1)所述过滤为顺序分别使用孔径为15～30μm、4～10μm、1～3.5μm的过滤介质过滤，优选为顺序分别使用孔径为20～25μm、5～7μm、1～3μm的过滤介质过滤；所述超滤为使用截留分子量为5000～20000的超滤膜，优选为使用截留分子量为10000的超滤膜。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(3)在加入氢氧化钡溶液后，在脱盐处理前还优选进行二次吸附，所述二次吸附为将脱盐处理前的溶液用树脂柱柱层析。

本发明优选采用采用二次吸附，可以更进一步提高产品的纯度。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，所述树脂柱的吸附剂为大孔树脂吸附剂，优选为HP3、XAD-16、XAD-7中的一种或几种的任意组合；吸附剂体积同尿液体积比为1∶8～1∶15，优选为1∶11.9；树脂柱内吸附剂填料直径与高度比为1∶1.5～1∶3，优选为1∶2。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，所述的柱层析可以参考现有技术任何类似的柱层析操作，本领域技术人员通常能够知晓这种柱层析操作。然而本发明所述柱层析可以优选为将预处理得到的尿液加入树脂柱中进行吸附，加入速度为每分钟加入尿液总体积的1/30～1/20，弃去液体，然后将纯化水加入入树脂柱中洗涤，纯化水加入速度为每分钟加入纯化水总体积的1/30～1/20，纯化水用量同尿液体积比为1∶0.8～1∶1.2，待纯化水液面距吸附剂顶部10～15cm时，加入醇溶液洗脱，加入速度为每分钟加入醇溶液总量的3/125～9/125，醇溶液用量同尿液体积比为1∶3～1∶5；更优选为尿液加入速度为每分钟加入尿液总体积的1/25，纯化水加入速度为纯化水总体积的1/25，纯化水用量同尿液体积比为1∶1，醇溶液加入速度为每分钟加入醇溶液总量的6/125，醇溶液用量同尿液体积比为1∶4；所述醇溶液优选为甲醇或乙醇溶液，更优选为乙醇溶液；醇溶液浓度为80～100％，优选为90～95％。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(3)所述氢氧化钡加入量为使得溶液中氢氧化钡浓度为80～120mg/L，优选为100mg/L。

也就是说加入氢氧化钡使得在除尿素后溶液中氢氧化钡浓度为80～120mg/L，优选为100mg/L。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(3)所述脱盐处理为采用阳离子树脂，优选为D113型阳离子树脂；所述脱色处理为采用阴离子树脂，优选用D118型阴离子树脂。

这里所述的阳离子树脂脱盐可以为现有技术任何的阳离子树脂脱盐操作，所述的阴离子树脂脱色也可以为现有技术任何的阴离子树脂脱色，即本领域技术人员均知晓上述的操作，无需再付出创造性劳动。譬如优选可以采用的是树脂重量用量为尿液体积的1/12～1/20，流速为每分钟尿液总量的1/20～1/30，树脂用完后用体积为尿液总量1/2～1/3的纯化水洗涤；更优选为树脂重量用量为尿液体积的1/16，流速为每分钟尿液总量的1/25，纯化水体积为尿液总量1/2.5。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(4)所述病毒灭活可以参考现有技术任何的病毒灭活操作，本发明优选为调节脱色处理得到的溶液醇浓度为73～75％，用氢氧化钠溶液调节pH在4.5～5.0，然后在20～30℃下放置6小时。

根据前面所述的尿多酸肽组合物的制备方法，步骤(5)优选所述浓缩为在温度低于40℃浓缩到固体物质总含量为150～500mg/ml，更优选为在30～40℃下浓缩到固体物质总含量为250～350mg/ml；所述超滤的过滤介质孔径为0.8～3μm，优选为1.0～1.5μm。

本发明还可再进一步详细为：

新鲜人尿500L经2mol/LHCl稀盐酸酸化后，经60目筛网粗滤后装入pH调节罐混匀，用2mol/LHCl调节pH值在1.7。

酸化尿液经pH调节罐泵入板框过滤机，用120～14(747″)号滤布滤去酸化尿液中粒径大于20μm的杂质，再经5μm精密过滤器滤除尿液中粒径大于5μm的杂质，并收集滤液至超滤前酸化尿储罐。

将经精密过滤器过滤后的酸化尿经孔径为1～3μm精密过滤器过滤后进入超滤机，用截留1万分子量超滤膜超滤，除去酸化尿分子量大于10000道尔顿的有机杂质。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入高位槽中，经电磁阀、流量计放入提取柱(每柱内HP3、XAD-16、XAD-7吸附剂为42L约30kg，树脂径高比为1∶2)，保持吸附剂上方液面高度以使吸附剂保持稳定静止，每次以约20L/分的速度均匀放入酸化尿500L(每柱)，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。上柱前确认酸化尿pH值为1.7～2.0。

吸附结束，将高位槽中的纯化水以20L/分的速度均匀放入提取柱(每柱)，洗涤吸附树脂上滞留的无机盐类和其他水溶性物质。水洗过程中应保持吸附剂上方液面高度以使吸附剂保持稳定静止，洗涤液弃去。(每柱)需纯化水500L。

洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％乙醇以6L/分的速度均匀放入提取柱，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液，(每柱)需95％乙醇125L。

提取结束，待乙醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将高位槽中的纯化水均匀放入提取柱(每柱)，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。(每柱)需纯化水125L。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，去除尿液中的氨气，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为80～120mg/L，优选为100mg/L。

提取溶液再重复吸附、洗脱一次；收集进一步纯化的提取液，重复的吸附、洗脱同前面所述的操作相同。

二次吸附得提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。

经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用95％乙醇或纯化水调整乙醇含量在73-75％之间，用2mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用2mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。利用真空干燥机内的负压，将调整pH值后的提取液吸入真空干燥机内，开机加热，干燥机内胆温度设定不超过40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为250～350mg/ml出料并收集浓缩液。

用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.0-7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液即为新型抗癌原料药。

新型抗癌制剂原料储存：PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

本发明所述技术方案具有如下优点：

(1)本发明所提供的制备方法简单易行，适于工业化生产。

(2)本发明方法制备的尿多酸肽纯度高，杂质含量低，患者用药更加安全。

(3)本发明方法在大幅度提高产品纯度的基础上对于收率没有明显的影响。

附图说明

图1为本发明所述尿多酸肽组合物制备方法的流程图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明作更具体的解释，但本发明并不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。

实施例1

新鲜人尿500L经2mol/LHCl稀盐酸酸化至pH为2～3后，经60目筛网粗滤后装入pH调节罐混匀，用2mol/LHCl调节pH值在1.7。酸化尿液经pH调节罐泵入板框过滤机，用120～14(747″)号滤布滤去酸化尿液中粒径大于20μm的杂质，再经5μm精密过滤器滤除尿液中粒径大于5μm的杂质，并收集滤液至超滤前酸化尿储罐。将经精密过滤器过滤后的酸化尿经孔径为1～3μm精密过滤器过滤后进入超滤机，用截留1万分子量超滤膜超滤，除去酸化尿分子量大于10000道尔顿的有机杂质。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入高位槽中，经电磁阀、流量计放入提取柱(每柱内HP3、XAD-16、XAD-7吸附剂为42L约30kg，树脂径高比为1∶2)，保持吸附剂上方液面高度以使吸附剂保持稳定静止，每次以约20L/分的速度均匀放入酸化尿500L(每柱)，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。上柱前确认酸化尿pH值为1.7～2.0。吸附结束，将高位槽中的纯化水以20L/分的速度均匀放入提取柱(每柱)，洗涤吸附树脂上滞留的无机盐类和其他水溶性物质。水洗过程中应保持吸附剂上方液面高度以使吸附剂保持稳定静止，洗涤液弃去。(每柱)需纯化水500L。洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％乙醇以6L/分的速度均匀放入提取柱，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液，(每柱)需95％乙醇125L。提取结束，待乙醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将高位槽中的纯化水均匀放入提取柱(每柱)，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。  (每柱)需纯化水125L。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，去除尿液中的氨气，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为80～120mg/L，优选为100mg/L。提取溶液再重复吸附、洗脱一次；收集进一步纯化的提取液，重复的吸附、洗脱同前面所述的操作相同。二次吸附得提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg，流速为20L/分，树脂用完后用200L纯化水洗涤。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用95％乙醇或纯化水调整乙醇含量在73-75％之间，用2mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用2mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。利用真空干燥机内的负压，将调整pH值后的提取液吸入真空干燥机内，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为250～350mg/ml出料并收集浓缩液。用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.0-7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液即为新型抗癌原料药。新型抗癌制剂原料储存：PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

实施例2

新鲜人尿500L经1.5mol/LHCl稀盐酸酸化至pH值为3～4，经50目筛网粗滤，用2mol/LHCl调节pH值在1.7。用孔径为25μm的滤布过滤，再经6μm精密过滤器过滤，并收集滤液用孔径为2μm精密过滤器过滤，用截留1万分子量超滤膜超滤。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入放入提取柱(每柱内XAD-16吸附剂为42L，树脂径高比为1∶2)，每次以约20L/分的速度均匀放入，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。吸附结束，将纯化水以20L/分的速度均匀放入提取柱，共500L。水洗过程中应保持吸附剂上方液面高度以使吸附剂保持稳定静止，洗涤液弃去。洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％乙醇以6L/分的速度均匀放入提取柱，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液，需95％乙醇125L。提取结束，待乙醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将150L纯化水均匀放入提取柱，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为100mg/L。提取溶液再重复吸附、洗脱一次；收集进一步纯化的提取液，重复的吸附、洗脱同前面所述的操作相同。二次吸附得提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg，流速为20L/分，树脂用完后用200L纯化水洗涤。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用95％乙醇或纯化水调整乙醇含量在73-75％之间，用1mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用1.5mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。真空干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为250～350mg/ml出料并收集浓缩液。用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.0-7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液用PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

实施例3

新鲜人尿500L经1.0mol/LHCl稀盐酸酸化至pH值为2～4，经70目筛网粗滤，用1.5mol/LHCl调节pH值在1.7。用孔径为23μm的滤布过滤，再经7μm精密过滤器过滤，并收集滤液用孔径为3μm精密过滤器过滤，用截留1万分子量超滤膜超滤。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入放入提取柱(每柱内XAD-7吸附剂为42L，树脂径高比为1∶2)，每次以约20L/分的速度均匀放入，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。吸附结束，将纯化水以20L/分的速度均匀放入提取柱，共500L。洗涤液弃去。洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部13～15cm时，将95％乙醇以6L/分的速度均匀放入提取柱，共125L，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液。提取结束，待乙醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将150L纯化水均匀放入提取柱，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为100mg/L。提取溶液再重复吸附、洗脱一次；收集进一步纯化的提取液，重复的吸附、洗脱同前面所述的操作相同。二次吸附得提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg，流速为20L/分，树脂用完后用200L纯化水洗涤。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用95％乙醇或纯化水调整乙醇含量在73-75％之间，用1mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用1.0mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。真空干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为250～350mg/ml出料并收集浓缩液。用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.0-7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液用PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

实施例4

新鲜人尿500L经2.0mol/LHCl稀盐酸酸化至pH值为3～5，经90目筛网粗滤，用1.0mol/LHCl调节pH值在2～3。用孔径为30μm的滤布过滤，再经9μm精密过滤器过滤，并收集滤液用孔径为3.5μm精密过滤器过滤，用截留0.5万分子量超滤膜超滤。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入放入提取柱(每柱内XAD-7吸附剂为60L，树脂径高比为1∶1.5)，每次以约25L/分的速度均匀放入，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。吸附结束，将纯化水以17L/分的速度均匀放入提取柱，共420L。洗涤液弃去。洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～12cm时，将80％乙醇以3L/分的速度均匀放入提取柱，共100L，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液。提取结束，待乙醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将100L纯化水均匀放入提取柱，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为80mg/L。提取溶液再重复吸附、洗脱一次；收集进一步纯化的提取液，重复的吸附、洗脱同前面所述的操作相同。二次吸附得提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为41kg，流速为25L/分，树脂用完后用250L纯化水洗涤。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用90％乙醇或纯化水调整乙醇含量在73-75％之间，用1mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用1.0mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。真空干燥机内胆温度设定不超过40℃。内胆真空在0.080～0.200MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为150～250mg/ml出料并收集浓缩液。用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.5-8.0，用孔径为0.8μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液用PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

实施例5

新鲜人尿500L经1.0mol/LHCl稀盐酸酸化至pH值为2～3，经30目筛网粗滤，用1.0mol/LHCl调节pH值在2～3。用孔径为15μm的滤布过滤，再经4μm精密过滤器过滤，并收集滤液用孔径为1μm精密过滤器过滤，用截留2万分子量超滤膜超滤。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入放入提取柱(每柱内XAD-7和XAD-16任意比例的吸附剂为35L，树脂径高比为1∶3)，每次以约17L/分的速度均匀放入，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。吸附结束，将纯化水以25L/分的速度均匀放入提取柱，共625L。洗涤液弃去。洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～12cm时，将98％甲醇以11L/分的速度均匀放入提取柱，共166L，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液。提取结束，待甲醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将300L纯化水均匀放入提取柱，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为120mg/L。提取溶液再重复吸附、洗脱一次；收集进一步纯化的提取液，重复的吸附、洗脱同前面所述的操作相同。二次吸附得提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为25kg，流速为17L/分，树脂用完后用170L纯化水洗涤。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用90％甲醇或纯化水调整甲醇含量在73-75％之间，用1mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用1.0mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。真空干燥机内胆温度设定不超过40℃。内胆真空在0.030～0.200MPa之间，浓缩干燥除去甲醇和部分水分，浓缩至固总含量为250～350mg/ml出料并收集浓缩液。用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.3-7.8，用孔径为3μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液用PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

实施例6

新鲜人尿500L经2.0mol/LHCl稀盐酸酸化至pH值为3～5，经40目筛网粗滤，用1.0mol/LHCl调节pH值在2～3。用孔径为18μm的滤布过滤，再经5μm精密过滤器过滤，并收集滤液用孔径为3μm精密过滤器过滤，用截留1.5万分子量超滤膜超滤。

将超滤并经PH确认后的酸化尿打入放入提取柱(每柱内HP3、XAD-7和XAD-16任意比例混合的吸附剂为50L，树脂径高比为1∶2.5)，每次以约20L/分的速度均匀放入，使酸化尿中的有效成分被吸附，流穿液弃去。吸附结束，将纯化水以25L/分的速度均匀放入提取柱，共550L。洗涤液弃去。洗涤结束，待纯化水液面降至吸附剂顶部12～15cm时，将90％乙醇以4L/分的速度均匀放入提取柱，共120L，洗脱吸附在吸附树脂上的有效成分。收集洗脱液。提取结束，待乙醇液面降至吸附剂顶部10～15cm时，将200L纯化水均匀放入提取柱，洗涤吸附树脂上滞留的提取液。

收集的洗脱液边搅拌边加入BaOH溶液，得提取溶液，提取液中氢氧化钡浓度为100mg/L。提取溶液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理。经脱盐处理处理得提取溶液经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为40kg，流速为20L/分，树脂用完后用200L纯化水洗涤。

将经过上述工序得溶液收集搅拌均匀，在灭活罐内用90％乙醇或纯化水调整乙醇含量在73-75％之间，用1mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5-5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6小时进行病毒灭活。

用1.0mol/L NaOH溶液调整已灭活提取液pH值至6.0～6.5。真空干燥机内胆温度设定不超过40℃。内胆真空在0.030～0.200MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为250～350mg/ml出料并收集浓缩液。用2mol/L NaOH调浓缩液pH值至7.3-7.8，用孔径为3μm的滤芯(膜)过滤，收集过滤液用PE塑料桶盛装，10℃以下密闭保存。

本发明还提供了如下的试验例，以进一步说明本发明所提供的技术方案。

试验例1

本发明还进行了如下试验，以检验本发明所述技术方案同其它制备方法的对比

本试验例以500L新鲜尿液为原料进行制备：

其中99122050为按照专利申请99122050方法制备的产品，200410000753为按照专利申请200410000753所述的方法制备。从上表中可看出，本发明所提供的方法所得到的尿多酸肽质量远远高于现有技术。

Claims (24)

1.一种尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述尿多酸肽组合物按照如下步骤制备：

（1）将新鲜人尿液酸化，过滤，滤液进行超滤；

（2）将超滤后的滤液使用树脂柱柱层析并收集洗脱液；

（3）将收集的洗脱液加入氢氧化钡溶液，然后脱盐、脱色处理；所述脱盐处理采用阳离子树脂，所述脱色处理采用阴离子树脂；

（4）将脱色处理得到的溶液进行病毒灭活；

（5）将灭活后得到溶液调节pH到6.0～6.5后浓缩，浓缩液调节pH到7.0～8.0后进行超滤，收集滤液即得。

2.根据权利要求1所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）酸化为将尿液先调节pH为2～5，经30～90目筛网过滤后再调节pH为2～3。

3.根据权利要求2所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）酸化为将尿液先调节pH为2～4，经50～70目筛网过滤后再调节pH为1.7。

4.根据权利要求1所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述过滤为顺序分别使用孔径为15～30μm、4～10μm、1～3.5μm的过滤介质过滤；所述超滤为使用截留分子量为5000～20000的超滤膜。

5.根据权利要求4所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述过滤为顺序分别使用孔径为20～25μm、5～7μm、1～3μm的过滤介质过滤。

6.根据权利要求4所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述超滤为使用截留分子量为10000的超滤膜。

7.根据权利要求1所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）在加入氢氧化钡溶液后，在脱盐处理前还进行二次吸附，所述二次吸附为将脱盐处理前的溶液用树脂柱柱层析。

8.根据权利要求1或7所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述树脂柱的吸附剂为大孔树脂吸附剂；吸附剂体积同尿液体积比为1：8～1：15；树脂柱内吸附剂填料直径与高度比为1：1.5～1：3。

9.根据权利要求8所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述树脂柱的吸附剂为大孔树脂吸附剂HP3、XAD-16、XAD-7中的一种或几种的任意组合。

10.根据权利要求8所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：吸附剂体积同尿液体积比为1：11.9。

11.根据权利要求8所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：树脂柱内吸附剂填料直径与高度比为1：2。

12.根据权利要求1或7所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述柱层析为将预处理得到的尿液加入树脂柱中进行吸附，加入速度为每分钟加入尿液总体积的1/30～1/20，弃去液体，然后将纯化水加入入树脂柱中洗涤，纯化水加入速度为每分钟加入纯化水总体积的1/30～1/20，纯化水用量同尿液体积比为1：0.8～1：1.2，待纯化水液面距吸附剂顶部10～15cm时，加入醇溶液洗脱，加入速度为每分钟加入醇溶液总量的3/125～9/125，醇溶液用量同尿液体积比为1：3～1：5；醇溶液浓度为80～100％。

13.根据权利要求12所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：尿液加入速度为每分钟加入尿液总体积的1/25，纯化水加入速度为纯化水总体积的1/25，纯化水用量同尿液体积比为1：1，醇溶液加入速度为每分钟加入醇溶液总量的6/125，醇溶液用量同尿液体积比为1：4。

14.根据权利要求12所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述醇溶液为甲醇或乙醇溶液。

15.根据权利要求14所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：所述醇溶液为乙醇溶液。

16.根据权利要求12所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：醇溶液浓度为90～95％。

17.根据权利要求1或7所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述氢氧化钡加入量为使得溶液中氢氧化钡浓度为80～120mg/L。

18.根据权利要求17所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述氢氧化钡加入量为使得溶液中氢氧化钡浓度为100mg/L。

19.根据权利要求1或7所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述脱盐处理为采用D113型阳离子树脂；所述脱色处理为采用D118型阴离子树脂。

20.根据权利要求1所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述病毒灭活为调节脱色处理得到的溶液醇浓度为73～75％，用氢氧化钠溶液调节pH在4.5～5.0，然后在20～30℃下放置6小时。

21.根据权利要求1或7所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述浓缩为在温度低于40℃浓缩到固体物质总含量为150～500mg/ml；所述超滤的过滤介质孔径为0.8～3μm。

22.根据权利要求21所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述浓缩为在30～40℃下浓缩到固体物质总含量为250～350mg/ml；所述超滤的过滤介质孔径为0.8～3μm。

23.根据权利要求21所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述超滤的过滤介质孔径为1.0～1.5μm。

24.根据权利要求1所述的尿多酸肽组合物的制备方法，其特征在于：步骤（5）浓缩液调节pH到7.0～7.5后进行超滤。

Images