CN107753516B - 一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备方法 - Google Patents

一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备方法。本发明的尿多酸肽冻干粉组合物包括以适合的比例混合的尿多酸肽固形物和冻干支撑剂。本发明还提供了所述的尿多酸肽冻干粉组合物的制备方法。本发明的尿多酸肽冻干粉组合物脆硬度良好，在常规生产环境下可以成型，有利于后续的加工操作；并且，本发明的尿多酸肽冻干粉组合物的制备方法简单，可以在常规生产条件下进行，便于产业化生产。

Description

一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，更具体地，本发明涉及一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备方法。
背景技术
尿多酸肽(CDA-Ⅱ)是从健康人新鲜尿液中分离提纯的一组细胞分化诱导剂，其主要成分包括马尿酸、苯乙酸、吲哚乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、小分子肽和无机盐等。
目前，尿多酸肽主要被应用于癌症的治疗，多与化疗联合应用。CN99122049.8公开了一种尿多酸肽组合物及其用途，可被用于治疗以及防止癌症的复发。
尿多酸肽的制备方法在CN99122050.1和CN200910305445.X均有涉及。其中，专利CN99122050.1提及尿多酸肽组合物中间体经冷冻干燥可得干燥的尿多酸肽组合物，后续可被制备成口服胶囊，或加工成口服液或注射液。然而，CN99122050.1中的尿多酸肽组合物中间体冷冻干燥所得固形物，因其中含有丰富的无机盐，所以得到的干燥物极易吸湿，在空气中无法维持形态，造成实际生产中后期加工困难，后续无法被制成制剂，难以满足商业生产的要求。
目前为止，还没有一种制备工艺能得到低吸湿性，易于存储，脆硬度良好，适合批量生产，有利于后期加工的尿多酸肽冻干粉组合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，所述组合物包括尿多酸肽固形物和冻干支撑剂，其中尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1:2～6:1，较佳地为1:1～4:1，更佳地为1.5:1～3:1，更佳地为2:1～3:1，更佳地为2:1。
在一个优选例中，所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物中，所述的冻干支撑剂包括：乳糖，甘露醇，海藻糖，或它们的组合；较佳地，所述的冻干支撑剂选自：乳糖，甘露醇，或它们的组合；更佳地，所述的冻干支撑剂为乳糖。
在另一优选例中，所述的冻干支撑剂包括：乳糖和甘露醇；并且，组合物中乳糖:甘露醇按照质量比为1:100～100:1；例如可以是选自以下比例：1:50～50:1，1:200～20:1，1:10～10:1，1:4～4:1，1:2～3:1，1:1～2:1；或所述的冻干支撑剂包括：乳糖和海藻糖；并且，组合物中乳糖:甘露醇按照质量比为1:100～100:1，例如可以是选自以下比例：1:50～50:1，1:200～20:1，1:10～10:1，1:4～4:1，1:2～3:1，1:1～2:1。
在另一优选例中，所述的组合物还包括水，为冻干后残留在组合物中的水，所述的水的质量百分含量较佳的为小于等于6％。
在另一优选例中，所述的尿多酸肽固形物中，包括马尿酸≥70mg/g，苯乙酰谷氨酰胺≥70mg/g和多肽≥350mg/g；更佳地，包括马尿酸≥80mg/g，苯乙酰谷氨酰胺≥80mg/g和多肽≥390mg/g。
在另一优选例中，所述的尿多酸肽固形物来自于尿多酸肽原液。
在本发明的另一方面，提供一种制备低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物的方法，所述方法包括：
(a)将尿多酸肽原液和冻干支撑剂混合(尿多酸肽原液和冻干支撑剂直接混合或在水性溶剂中混合)；混合后，混合物中的尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1:2～6:1，较佳地为1:1～4:1，更佳地为1.5:1～3:1，更佳地为2:1～3:1，更佳地为2:1；并且，混合物中总固体的含量占混合物总重量的10～27％，较佳地为15～27％，更佳的为20～25％，最佳地为25％；
(b)将步骤(a)获得的混合物进行冷冻干燥，获得所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物；其中，所述的冷冻干燥包括以下步骤：
(i)将步骤(a)获得的混合物置于开口的冻干容器中，置于冻干设备中；调节温度至-30℃以下(较佳地-35℃以下，更佳地-40℃以下)，保温0.5～5小时(较佳地1～3小时，更佳地2～3小时)；抽真空；
(ii)步骤(i)的抽真空进行到气压为0.05～0.5mbar、较佳地0.1～0.3mbar、更佳地0.2～0.3mbar时，掺入气体进行升华干燥，所述气体是洁净空气或惰性气体；
(iii)对步骤(ii)的升华干燥产物调节温度至33～40℃、较佳地35～38℃、更佳地35～37℃，停止掺入气体，保温3～5小时、较佳地4～5小时；
(iv)对步骤(iii)获得的产物泄压出箱，获得所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物。
在一个优选例中，所述的冻干支撑剂包括：乳糖，甘露醇，海藻糖，或它们的组合；较佳地，所述的冻干支撑剂选自：乳糖，甘露醇，或它们的组合；更佳地，所述的冻干支撑剂为乳糖。
在另一优选例中，所述的尿多酸肽原液包含按照重量比25～35％的尿多酸肽固形物，余量为水性溶剂，如水和/或醇(较佳地该醇为乙醇)。
在另一优选例中，所述的尿多酸肽原液、冻干支撑剂按照重量比为10：3.5～10：0.675，较佳的为10：2.3～10：0.9，更佳的为10：1.75～10：0.9，更更佳的为10：1.35～10：1.75，最佳的为10：1.75。
在另一优选例中，步骤(i)中，对后箱制冷至温度达到-30℃以下、较佳地-35℃以下、更佳地-40℃以下、进一步更佳地-45℃以下时，对箱体抽真空；较佳地，所述的冻干容器中，混合物的高度满足混合物底部水分可以溢出；较佳地，混合物的高度为0.2～1.0厘米，更佳地为0.3～0.8厘米，进一步更佳地为0.6～0.8厘米；较佳地，所述的开口的冻干容器为托盘，较佳地为不锈钢托盘；更佳地，所述的开口的冻干容器中放于冻干设备的搁板上。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述的升华干燥包括：第一阶段，将冻干设备的隔板温度升至-8～-4℃、更佳地-6～-5℃，加热时间1～3小时、更佳地2～3小时，保温4～7小时、更佳地4～6小时；第二阶段，将冻干设备的隔板温度升至-2～1℃、更佳地-2～0℃，加热时间4～7分钟、更佳地4～6分钟，保温5～7小时、更佳地5～6小时；第三阶段，将冻干设备的隔板温度升至4～6℃、更佳地5～6℃，加热时间4～7分钟、更佳地4～6分钟，保温1～3小时；或
在另一优选例中，步骤(iii)中，调节温度至33～40℃(较佳地35～38℃；更佳地35～37℃)的方法是：将冻干设备的搁板温度升至36～42℃(较佳地38～40℃)，加热时间0.5～3小时(较佳地1～2小时)，使原料混合物温度达到33～40℃(较佳地35～38℃)。
在另一优选例中，所述的尿多酸肽原液的制备方法包括：
(1)将尿液酸化处理；过滤得滤液；所得滤液进行超滤除去分子量大于5～20KD(如10KD)的有机物质；收集滤液；
(2)通过树脂吸附法吸附步骤(1)获得的滤液中含有尿多酸肽活性组分的部分，去除无机盐离子和有机物；采用乙醇洗脱所述的含有尿多酸肽活性组分的部分，获得洗脱液；较佳地，所述的树脂吸附法采用XAD-7或者XAD-16硅胶树脂作为吸附剂；
(3)对步骤(2)获得的洗脱液进行除氨气处理，之后进行脱盐处理，之后再进行脱色处理；较佳地，在除氨气处理之后，重复步骤(2)，之后依次进行脱盐处理和脱色处理；较佳地，采用Ba(OH)2溶液进行除氨气处理，采用弱酸性阳离子树脂、优选地为D113进行脱盐处理，采用弱碱性阴离子树脂、优选地为D118进行脱色处理，获得经脱色的提取液；
(4)步骤(3)获得的经脱色的提取液进行病毒灭活，获得经病毒灭活的溶液；
(5)将步骤(4)获得的经病毒灭活的溶液调节pH至6.0～6.5，进行真空干燥除去部分乙醇和水分；收集浓缩液，调节pH至7.0～7.5，以孔径为1.2±0.2μm(较佳地1.2±0.1μm)的过滤装置过滤，收集滤液，即尿多酸肽原液，干燥获得尿多酸肽固形物。
在另一优选例中，步骤(1)包括：调节尿液pH值至2.0～4.0，以30～90目筛网粗滤；滤出液调节pH值至1.5～3.5(较佳地为1.6～3.2)，以15～35μm(较佳地为20～30μm)孔径的过滤装置过滤；滤出液进行超滤；超滤后的滤液再进行纳滤；用截留分子量为5～20KD(如10KD)的超滤膜超滤，收集滤液。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的尿液是新鲜尿液。
在另一优选例中，步骤(1)中，采用1.0～2.0mol/L的HCl调节尿液或滤出液的pH值。
在另一优选例中，步骤(1)中，超滤后，还包括在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜。
在另一优选例中，步骤(2)中，将吸附剂装入吸附柱中，每柱吸附剂为35～70L(佳地42L～60L)，树脂径高比为1:2～1:1.5
在另一优选例中，步骤(2)中，所述滤液每次以约15～30L/min(较佳地20～25L/min)的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中含有尿多酸肽活性组分的部分被吸附，弃去流穿液。
在另一优选例中，步骤(2)中，吸附结束后，将纯化水以15～25L/min(较佳地17～20L/min)的流速均匀放入吸附柱，共350～600L(较佳地420～500L)，弃去洗涤液。
在另一优选例中，步骤(2)中，洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部8～18cm(较佳地10～15cm)时，用80～95％的乙醇以2～8L/min(较佳地3～6L/min)的流速均匀放入吸附柱，共需乙醇80～150L(较佳地100～125L)洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液。
在另一优选例中，步骤(3)中，加入Ba(OH)2溶液使得洗脱液中Ba(OH)2的浓度为70～130mg/L，较佳地为80～120mg/L。
在另一优选例中，步骤(3)中，弱酸性阳离子树脂和/或弱碱性阳离子树脂的用量为25～50kg(较佳地为30～41kg)，流速15～30L/min(较佳地为20～25L/min)，树脂使用完毕后用水洗涤。
在另一优选例中，所述的经脱色的提取液搅拌均匀，调整乙醇含量为按照体积70～80％(较佳地为73～75％)；调整pH值为4.2～4.8(较佳地为4.5～5.0)，搅拌均匀，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活。较佳地，用1.0～2.0mol/L NaOH溶液调节pH值。
在另一优选例中，步骤(5)中，以真空干燥机进行真空干燥，较佳地干燥机内胆温度设定为30～40℃，内胆真空在0.080～0.200MPa。
在另一优选例中，步骤(5)中，真空干燥至固总含量为250～380mg/g，较佳地250～350mg/g，更佳地270～350mg/g时，收集浓缩液。
在另一优选例中，所述的过滤装置是滤芯或滤膜。
在本发明的另一方面，提供所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物的用途，用于制备抗肿瘤药物。在另一优选例中，所述的肿瘤是实体瘤。
在本发明的另一方面，提供一种用于抗肿瘤的药盒，该药盒中包括前面任一所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物；较佳地，所述的肿瘤是实体瘤。在一个优选例中，所述的药盒中还包括：肿瘤化疗药物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
针对现有技术中存在的尿多酸肽干燥产物极易吸湿，在空气中无法成型，不易存储，不利于后期加工利用等问题，本发明人经过深入的研究，揭示了一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物及其制备工艺，该低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物制备工艺简单，制备得到的尿多酸肽冻干粉组合物吸湿性低，易于存储，可满足在常规的生产温湿度条件下批量生产，可直接用于后期口服制剂的生产，大大简化了工艺流程，节约了成本。
尿多酸肽提取自尿液中，但其加工和储存困难。在前期研究过程中，本发明人尝试过减压旋蒸、真空干燥箱干燥、热风循环烘箱等多种常规干燥形式，均存在干燥时间长，干燥物含水量高、粘稠；且在常规的温湿度环境下放置，很快就吸湿变质，不适宜作为原料或中间体，研磨成粉状或粒状，从而不能用以加工制备成口服固体制剂。经多次摸索，发明人开发了一种带辅料的尿多酸肽冻干粉组合物制备方法，由冷冻干燥法来获得尿多酸肽冻干粉组合物，其制备方法简单可控，可批量操作，所得尿多酸肽冻干粉组合物吸湿性大大降低，使得在常规的生产温湿度条件下进行生产成为可能，易于存储，便于后期加工利用。
如本文所用，所述的“尿多酸肽固形物”与“尿多酸肽总固”可互换使用，其是提取自尿液的固体物质，主要成分包括马尿酸、苯乙酸、吲哚乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、小分子肽和无机盐等。
如本文所用，所述的“尿多酸肽原液”是一种尿液的提取物。本领域已揭示过一些制备所述的尿多酸肽原液的方法，这些已揭示的方法以及本发明揭示的优选方法均可应用于本发明中来制备所述的尿多酸肽原液。所述的尿液可以是新鲜尿液。
本发明提供了一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，包括尿多酸肽固形物和冻干支撑剂，其中尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1:2～6:1，较佳地为1:1～4:1，更佳地为1.5:1～3:1，更佳地为2:1～3:1，更佳地为2:1。
本发明所述尿多酸肽固形物可以是本领域任何来源的固体的尿多酸肽，其包括但不限于下列途径：可以由本领域技术人员根据本领域已知方法或常识进行制备；优选地可采用本发明提供的方法来获得尿多酸肽原液，该原液中含有尿多酸肽固形物。较佳地，所述尿多酸肽固形物是符合国家标准或者行业标准的相关规定制备的尿多酸肽固形物。较佳的，所述的尿多酸肽固形物包括马尿酸≥70mg/g，苯乙酰谷氨酰胺≥70mg/g和多肽≥350mg/g；更佳地，所述的尿多酸肽固形物包括马尿酸≥80mg/g，苯乙酰谷氨酰胺≥80mg/g和多肽≥390mg/g。
作为一种可选择的方案，所述的尿多酸肽固形物由专利CN200910305445.X中所记载的方法获得。较佳地，所述的尿多酸肽固形物的制备方法包括以下步骤(1)～(5)：
(1)将尿液酸化处理；过滤除去大颗粒；超滤除去分子量较大的有机物质；超滤后的滤液再进行纳滤；用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液；
(2)通过吸附法吸附步骤(1)获得的滤液中含有尿多酸肽活性组分的部分，去除无机盐离子和有机物；采用醇洗脱所述的含有尿多酸肽活性组分的部分，获得洗脱液；
(3)对步骤(2)获得的洗脱液进行除氨气处理，之后进行脱盐处理，之后再进行脱色处理；较佳地，在除氨气处理之后，重复步骤(2)，之后依次进行脱盐处理和脱色处理；较佳地，采用Ba(OH)2溶液进行除氨气处理，采用弱酸性阳离子树脂进行脱盐处理，采用弱碱性阴离子树脂进行脱色处理，获得经脱色的提取液；
(4)步骤(3)获得的经脱色的提取液进行病毒灭活，获得经病毒灭活的溶液；
(5)将步骤(4)获得的经病毒灭活的溶液调节pH至6.0～6.5，进行真空干燥除去部分乙醇和水分；收集浓缩液，调节pH至7.0～7.5，以孔径为1.2±0.2μm的过滤装置过滤，收集滤液，干燥获得尿多酸肽固形物。
作为本发明的优选方式，所述的尿多酸肽固形物的制备方法包括以下步骤1)～5)：
1)尿液制备：取新鲜尿液，加入1.0～2.0mol/L HCl调节其pH至2.0～4.0，经30～90目筛网粗滤收集尿液，加入1.0～2.0mol/L HCl调节其pH至1.7～2.0，孔径为20～30μm的滤布过滤，再经超滤设备进行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液；
2)吸附提取：将步骤1)超滤所得滤液确认pH值后放入取吸附柱(每柱吸附剂为42～60升，树脂径高比为1:2～1:1.5；所述吸附剂为XAD-7或者XAD-16硅胶树脂)，所述滤液每次以约20～25L/min的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中有效成分被吸附，弃去流穿液；吸附结束后，将纯化水以17～20L/min的流速均匀放入吸附柱，共420～500L，弃去洗涤液；洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用80～95％的乙醇以3～6L/min的流速均匀放入吸附柱，共需乙醇100～125L，洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液；
3)脱氨脱盐：步骤2)中收集的洗脱液边搅拌边加入Ba(OH)2溶液，以除去尿液中的氨气，得到提取液，提取液中Ba(OH)2的浓度为80～120mg/L，较佳的为100mg/L；所述提取液再重复吸附、洗脱一次，收集进一步的纯化的提取液，重复进行的吸附、洗脱操作同步骤2)；所得纯化的提取液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理，然后再经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理；树脂用量为30～41kg，流速20～25L/min，树脂使用完毕后用200～250L纯化水洗涤；
4)病毒灭活：将步骤3)所得经脱色后的提取液搅拌均匀，在灭活罐中用90～95％的乙醇或者纯化水调整乙醇含量在73～75％之间，用1.0～2.0mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5～5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活；
5)取步骤4)获得的已进行病毒灭活的溶液用1.0～2.0mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～6.5；进行了pH值调节后的溶液置于真空干燥机中，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃；内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为270～350mg/g，出料，收集浓缩液，用1.0～2.0mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集滤液，滤液为尿多酸肽原液，所述尿多酸肽原液经干燥可得固形物即尿多酸肽固形物。
本发明所述的冻干支撑剂是不与尿多酸肽固形物的主要活性成分马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和小分子肽等发生反应的冻干支撑剂。较佳地，所述的冻干支撑剂是乳糖，甘露醇，海藻糖中的一种或多种；更佳地为乳糖或甘露醇中的一种或两种；最佳地为乳糖。本发明人经过实验比较发现，本发明所选择的冻干支撑剂有利于获得稳定性好，外观符合要求的尿多酸肽冻干粉组合物。
本发明还提供了一种制备低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物的方法，所述方法包括：(a)将尿多酸肽原液和冻干支撑剂混合；混合后，尿多酸肽原液中的尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1:2～6:1，较佳地为1:1～4:1，更佳地为1.5:1～3:1，更佳地为2:1～3:1，更佳地为2:1；和(b)将步骤(a)获得的混合物进行冷冻干燥，获得所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物。并且，(a)制备的混合物中，固形物体的含量应占混合物总重量的10～27％，较佳地为15～27％，更佳的为20～25％，从而可以获得呈色良好、表面平整、外观良好的冻干粉组合物，且具备良好的低吸湿性。
作为本发明的一种优选方式，所述的制备低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物的方法包括步骤如下：
1)原料混合：将尿多酸肽原液、冻干支撑剂以及水混合，其中，尿多酸肽原液、冻干支撑剂质量比为10：3.5～10：0.675，加水质量为使原料混合物中最终固含量为10～27％，所述尿多酸肽原液包含25～35％的尿多酸肽固形物，余量为水，所述百分数为质量百分数；
2)将原料混合物进行冷冻干燥，包括以下步骤：a.预冻：将原料混合物置于开口冻干容器中，放于冷冻干燥装置的搁板上，容器中原料混合物的高度满足混合物底部水分可以溢出即可，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-35℃以下时，保温1～3小时；对后箱制冷，当后箱温度达到-35℃以下时，对箱体抽真空；b.升华干燥：当前箱真空抽至0.1～0.3mbar时，掺入惰性气体或洁净空气进行升华干燥；第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-8～-4℃，加热时间1～3小时，保温4～7小时；第二阶段将冻干设备的隔板温度升至-2～1℃，加热时间4～7分钟，保温5～7小时；第三阶段将冻干设备的隔板温度升至4～6℃，加热时间4～7分钟，保温1～3小时；c.解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至38～40℃，加热时间1～2小时；当原料混合物温度达到35～38℃时，停止掺入惰性气体或洁净空气，系统达到极限真空，保温3～5小时；d.泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物。
作为本发明的优选方式，上述步骤“1)原料混合”所述的原料混合中尿多酸肽原液、冻干支撑剂质量比为10：3.5～10：0.675，较佳的为10：2.3～10：0.9，更佳的为10：1.75～10：0.9，进一步更佳的为10：1.35～10：1.75，最佳的为10：1.75；所述的原料混合物中最终固含量为10～27％，较佳地为15～27％，更佳的为20～25％，所述百分数为质量百分数。
作为本发明的优选方式，上述步骤2)所述的原料混合物进行冷冻干燥包括以下步骤：a.预冻：将原料混合物置于开口冻干容器中，放于搁板上，容器中原料混合物的高度为1～0.2cm(厘米)，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-40℃以下时，保温2～3小时；对后箱制冷，当后箱温度达到-40℃以下时，对箱体抽真空；b.升华干燥：当前箱真空抽至0.2～0.3mbar时，掺入惰性气体或洁净空气进行升华干燥；第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-6～-5℃，加热时间2～3小时，保温4～6小时；二阶段将冻干设备的隔板温度升至-2～0℃，加热时间4～6分钟，保温5～6小时；第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5～6℃，加热时间4～6分钟，保温1～3小时；c.解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至39～40℃，加热时间1～2小时；当原料混合物温度达到35～37℃时，停止掺入惰性气体或洁净空气，系统达到极限真空，保温4～5小时；d.泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物。
作为本发明的更优选方式，上述步骤2)所述的原料混合物进行冷冻干燥更优选地包括以下步骤：a.预冻：将原料混合物置于开口冻干容器中，放于搁板上，容器中原料混合物的高度为1～0.2cm(厘米)，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2～3小时；对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空；b.升华干燥：当前箱真空抽至0.2～0.3mbar时，掺入惰性气体或洁净空气进行升华干燥；第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-6～-5℃，加热时间2小时，保温5小时；第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间4～6分钟，保温5～6小时；第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间4～6分钟，保温2小时；c.解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至38～40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36～37℃时，停止掺入惰性气体或洁净空气，系统达到极限真空，保温4小时；d.泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物。
作为本发明的进一步更优选方式，上述步骤2)所述的所述的原料混合物进行冷冻干燥更更优选地包括以下步骤：a.预冻：将原料混合物置于开口冻干容器中，放于搁板上，容器中原料混合物的高度为1～0.2cm(厘米)，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时；对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空；b.升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体或洁净空气进行升华干燥；第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间5分钟，保温6小时；第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时；c.解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入惰性气体或洁净空气，系统达到极限真空，保温4小时；d.泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物。
本发明所述的方法中，进行冷冻干燥中所用到的设备为本领域常规的，所述的开口冻干容器为本领域常规的，优选的开口冻干容器为西林瓶或者不锈钢托盘，所述的容器中原料混合物的高度为本领域常规的，优选的高度为0.2～1cm，更优选的高度为0.2～0.8cm，进一步更优选的高度为0.6～0.8cm，最优选的高度为0.8cm。
本发明所述的尿多酸肽冻干粉组合物，吸湿性低，脆硬度良好，在常规生产环境下可以成型，有利于后续的加工操作，成分简单，辅料量少，种类单一，减少后期制得药品因辅料引起不良反应或药效降低。本发明所述的尿多酸肽冻干粉组合物制备方法，操作简单，在常规生产条件下产品成型性好，得到的产品稳定性高，利于后期操作，便于产业化生产。
本发明所述的尿多酸肽冻干粉组合物本身可以作为抗肿瘤药物。尿多酸肽的抗肿瘤活性已经为本领域所公知，例如专利ZL99122049.8中就已报导了其抗肿瘤活性。所述的肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于：肝癌，肺癌。
此外，本发明所述的尿多酸肽冻干粉组合物还可以与其它一些肿瘤化疗药物配伍，制备增效的抗肿瘤药物。
本发明所述的尿多酸肽冻干粉组合物可以被包含在试剂盒或药盒中，以便于储存、销售，以及临床应用。
所述的试剂盒或药盒中还可以包括一种或多种肿瘤化疗药物。所述的肿瘤化疗药物可以与所述的尿多酸肽冻干粉组合物混合配伍，或者与所述的尿多酸肽冻干粉组合物位于试剂盒内不同的容器中。
所述的试剂盒或药盒中还可以包括说明所述的尿多酸肽冻干粉组合物和/或化疗药物的给药方法的使用说明书。
下面实施例将对本发明作更具体的解释，但本发明并不仅仅局限于这些实施例，反过来这些实施例也不以任何方式限制本发明。实施例中涉及到的百分含量除特殊说明外均为质量百分数。
如非另外说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售。本发明实施例中所用冻干设备为东富龙LY0-0.5型小型冻干机，采用不锈钢托盘作为容器。
实施例1、尿多酸肽原液的制备
制备方法如下(参见申请号为CN200910305445.X的发明专利)：
1)尿液制备：取新鲜尿液，加入1.5mol/L HCl调节其pH至4.0，经30目筛网粗滤收集尿液，加入2.0mol/L HCl调节其pH至1.7，孔径为25μm的滤布过滤，再经超滤设备进行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液。
2)吸附提取：将步骤1)超滤所得滤液确认PH值后放入取吸附柱(每柱吸附剂为42L，树脂径高比为1:2；所述吸附剂为XAD-16硅胶树脂)，所述滤液每次以约20L/min的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中有效成分被吸附，弃去流穿液。吸附结束后，将纯化水以20L/min的流速均匀放入吸附柱，共500L，弃去洗涤液。洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％的乙醇以6L/min的流速均匀放入吸附柱，共需95％乙醇125L，洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液。
3)脱氨脱盐：步骤2)中收集的洗脱液边搅拌边加入Ba(OH)2溶液，以除去尿液中的氨气，得到提取液，提取液中Ba(OH)2的浓度为100mg/L。所述提取液再重复吸附、洗脱一次，收集进一步的纯化的提取液，重复进行的吸附、洗脱操作同步骤2)。所得纯化的提取液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理，然后再经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg(D113、D118各用30kg)，流速20L/min，树脂使用完毕后用200L纯化水洗涤。
4)病毒灭活：将步骤3)所得经脱色后的提取液搅拌均匀，在灭活罐中用95％的乙醇或者纯化水调整乙醇含量在73～75％(v/v)之间，用1mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5～5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活。
5)取步骤4)获得的已进行病毒灭活的溶液用1.5mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～6.5。进行了pH值调节后的溶液置于真空干燥机中，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至尿多酸肽固总含量为270mg/g，出料，收集浓缩液，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集滤液，经测定得到固含量为27％(w/w)的尿多酸肽原液a可用于尿多酸肽冻干粉组合物的制备。
实施例2、尿多酸肽原液的制备
1)尿液制备：取新鲜尿液，加入2.0mol/L HCl调节其pH至2.0，经60目筛网粗滤收集尿液，加入2.0mol/L HCl调节其pH至1.7，孔径为20μm的滤布过滤，再经超滤设备进行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液。
2)吸附提取：将步骤1)超滤所得滤液确认pH值后放入取吸附柱(每柱吸附剂为42L，树脂径高比为1:2；所述吸附剂为XAD-16硅胶树脂)，所述滤液每次以约20L/min的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中有效成分被吸附，弃去流穿液。吸附结束后，将纯化水以20L/min的流速均匀放入吸附柱，共500L，弃去洗涤液。洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％的乙醇以6L/min的流速均匀放入吸附柱，共需95％乙醇125L，洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液。
3)脱氨脱盐：步骤2)中收集的洗脱液边搅拌边加入Ba(OH)2溶液，以除去尿液中的氨气，得到提取液，提取液中Ba(OH)2的浓度为100mg/L。所述提取液再重复吸附、洗脱一次，收集进一步的纯化的提取液，重复进行的吸附、洗脱操作同步骤2)。所得纯化的提取液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理，然后再经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg(D113、D118各用30kg)，流速20L/min，树脂使用完毕后用200L纯化水洗涤。
4)病毒灭活：将步骤3)所得经脱色后的提取液搅拌均匀，在灭活罐中用95％的乙醇或者纯化水调整乙醇含量在73～75％之间，用2mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5～5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活。
5)取步骤4)获得的已进行病毒灭活的溶液用2.0mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～6.5。进行了pH值调节后的溶液置于真空干燥机中，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为270mg/g，出料，收集浓缩液，用2.0mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集滤液，经测定得到固含量为27％(w/w)的尿多酸肽原液b可用于尿多酸肽冻干粉组合物的制备。
实施例3、尿多酸肽原液的制备
1)尿液制备：取新鲜尿液，加入1.0mol/L HCl调节其pH至4.0，经70目筛网粗滤收集尿液，加入1.5mol/L HCl调节其pH至1.7，孔径为23μm的滤布过滤，再经超滤设备进行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液。
2)吸附提取：将步骤1)超滤所得滤液确认pH值后放入取吸附柱(每柱吸附剂为42L，树脂径高比为1:2；所述吸附剂为XAD-7硅胶树脂)，所述滤液每次以约20L/min的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中有效成分被吸附，弃去流穿液。吸附结束后，将纯化水以20L/min的流速均匀放入吸附柱，共500L，弃去洗涤液。洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％的乙醇以6L/min的流速均匀放入吸附柱，共需95％乙醇125L，洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液。
3)脱氨脱盐：步骤2)中收集的洗脱液边搅拌边加入Ba(OH)2溶液，以除去尿液中的氨气，得到提取液，提取液中Ba(OH)2的浓度为80mg/L。所述提取液再重复吸附、洗脱一次，收集进一步的纯化的提取液，重复进行的吸附、洗脱操作同步骤2)。所得纯化的提取液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理，然后再经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg(D113、D118各用30kg)，流速20L/min，树脂使用完毕后用200L纯化水洗涤。
4)病毒灭活：将步骤3)所得经脱色后的提取液搅拌均匀，在灭活罐中用95％的乙醇或者纯化水调整乙醇含量在73～75％之间，用1.0mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5～5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活。
5)取步骤4)获得的已进行病毒灭活的溶液用1.0mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～6.5。进行了pH值调节后的溶液置于真空干燥机中，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至固总含量为270mg/g，出料，收集浓缩液，用2.0mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集滤液，经测定得到固含量为27％(w/w)的尿多酸肽原液c可用于尿多酸肽冻干粉组合物的制备。
实施例4、尿多酸肽原液的制备
制备方法如下：
1)尿液制备：取新鲜尿液，加入2.0mol/L HCl调节其pH至4.0，经90目筛网粗滤收集尿液，加入1.0mol/L HCl调节其pH至3.0，孔径为30μm的滤布过滤，再经超滤设备进行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液。
2)吸附提取：将步骤1)超滤所得滤液确认pH值后放入取吸附柱(每柱吸附剂为60L，树脂径高比为1:1.5；所述吸附剂为XAD-7硅胶树脂)，所述滤液每次以约25L/min的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中有效成分被吸附，弃去流穿液。吸附结束后，将纯化水以17L/min的流速均匀放入吸附柱，共420L，弃去洗涤液。洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～12cm时，用80％的乙醇以3L/min的流速均匀放入吸附柱，共需80％乙醇100L，洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液。
3)脱氨脱盐：步骤2)中收集的洗脱液边搅拌边加入Ba(OH)2溶液，以除去尿液中的氨气，得到提取液，提取液中Ba(OH)2的浓度为120mg/L。所述提取液再重复吸附、洗脱一次，收集进一步的纯化的提取液，重复进行的吸附、洗脱操作同步骤2)。所得纯化的提取液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理，然后再经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为41kg(D113、D118各用41kg)，流速25L/min，树脂使用完毕后用250L纯化水洗涤。
4)病毒灭活：将步骤3)所得经脱色后的提取液搅拌均匀，在灭活罐中用90％的乙醇或者纯化水调整乙醇含量在73～75％之间，用1.0mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5～5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活。
5)取步骤4)获得的已进行病毒灭活的溶液用1.0mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～6.5。进行了pH值调节后的溶液置于真空干燥机中，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.200MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至尿多酸肽固总含量为300mg/g，出料，收集浓缩液，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集滤液，经测定得到固含量为30％(w/w)的尿多酸肽原液d可用于尿多酸肽冻干粉组合物的制备。
实施例5、尿多酸肽原液的制备
制备方法如下：
1)尿液制备：取新鲜尿液，加入1.0mol/L HCl调节其pH至4.0，经70目筛网粗滤收集尿液，加入1.5mol/L HCl调节其pH至1.7，孔径为23μm的滤布过滤，再经超滤设备进行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，用截留分子量为10kD的超滤膜超滤，收集滤液。
2)吸附提取：将步骤1)超滤所得滤液确认pH值后放入取吸附柱(每柱吸附剂为42L，树脂径高比为1:2；所述吸附剂为XAD-7硅胶树脂)，所述滤液每次以约20L/min的流速均匀放入吸附柱中，使滤液中有效成分被吸附，弃去流穿液。吸附结束后，将纯化水以20L/min的流速均匀放入吸附柱，共500L，弃去洗涤液。洗涤结束后，待纯化水液面降至吸附剂顶部10～15cm时，用95％的乙醇以6L/min的流速均匀放入吸附柱，共需95％乙醇125L，洗脱吸附在树脂上的有效成分，收集洗脱液。
3)脱氨脱盐：步骤2)中收集的洗脱液边搅拌边加入Ba(OH)2溶液，以除去尿液中的氨气，得到提取液，提取液中Ba(OH)2的浓度为80mg/L。所述提取液再重复吸附、洗脱一次，收集进一步的纯化的提取液，重复进行的吸附、洗脱操作同步骤2)。所得纯化的提取液经弱酸性阳离子树脂(D113)进行脱盐处理，然后再经弱碱性阴离子树脂(D118)进行脱色处理。树脂用量为30kg(D113、D118各用30kg)，流速20L/min，树脂使用完毕后用200L纯化水洗涤。
4)病毒灭活：将步骤3)所得经脱色后的提取液搅拌均匀，在灭活罐中用95％的乙醇或者纯化水调整乙醇含量在73～75％之间，用1.0mol/L NaOH溶液调节pH值在4.5～5.0，搅拌均匀后，在25±5℃温度下放置6h进行病毒灭活。
5)取步骤4)获得的已进行病毒灭活的溶液用1.0mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0～6.5。进行了pH值调节后的溶液置于真空干燥机中，开机加热，干燥机内胆温度设定30～40℃。内胆真空在0.080～0.100MPa之间，浓缩干燥除去乙醇和部分水分，浓缩至尿多酸肽固总含量为350mg/g，出料，收集浓缩液，用2.0mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～7.5，用孔径为1.2μm的滤芯(膜)过滤，收集滤液，经测定得到固含量为35％(w/w)的尿多酸肽原液e可用于尿多酸肽冻干粉组合物的制备。
实施例6、尿多酸肽原液的成分检测
1、尿多酸肽原液马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺的含量测定
试剂：甲醇、冰乙酸、NaOH、纯化水。
仪器：LC-10ATVP高效液相色谱仪。
对照品：马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺(来源于中国药品生物制品检定所)。
色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱C18(250*4.6mm，5.0μm)。
流动相：甲醇：水：冰乙酸为180：850：4.5(w/w)。
必要时可适当调节流动相中甲醇和水的比例，以使马尿酸峰的保留时间约为17min；苯乙酰谷氨酰胺峰的保留时间约为马尿酸峰的保留时间的1.2倍。
流速：1.0ml/min。
检测波长：225nm。
柱温：40℃。
进样量：10μl。
理论塔板数：以马尿酸峰计算应不低于2500。
对照品溶液的配制：称马尿酸约6mg，苯乙酰谷氨酰胺约7mg，置于同一只25ml容量瓶中，加入0.05mol/L NaOH溶液10ml，超声溶解后加纯化水稀释至刻度，摇匀，用0.45μm针头过滤器滤过后备用。
尿多酸肽溶液供试液制备：量取尿多酸肽原液适量，加水稀释成总固体量40mg/ml溶液，精密量取稀释液2ml，用纯化水稀释至25ml，摇匀后用0.45μm针头过滤器过滤后，备用。
仪器准备与进样：更换相应色谱柱及流动相，并设置高效液相色谱仪相应的检测条件进行系统平衡，待系统平衡后，取上述对照品溶液，进样20μl进行检测并记录相应的色谱图。
结果计算：
用外标法以峰面积计算供试品中两种有机酸(马尿酸及苯乙酰谷氨酰胺)的含量。
Figure BDA0001084394510000141
AX———供试品的峰面积
AR———对照品的峰面积
Cx———供试品的含量(mg/ml)
CR———对照品中该成份的浓度(mg/ml)
M———供试品的稀释倍数
2、尿多酸肽原液中多肽的含量测定
仪器用具：紫外-可见分光光度计、分析天平、恒温水浴锅、冰块；
试药与试液：氢氧化钠、碳酸钠、酒石酸钾钠、硫酸铜；
相关试剂配制以及操作步骤：
(1)碱性铜试液：
氢氧化钠：5.0g置100ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。
碳酸钠：25.0g置100ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。
酒石酸钾钠：0.5g置50ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。
硫酸铜：0.25g置30ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。
取氢氧化钠溶液10ml，碳酸钠溶液10ml，酒石酸钾钠溶液2.5ml，硫酸铜溶液1.5ml，纯化水1ml，混匀后即得。
(2)福林酚试液：取福林酚储备液1ml，用纯化水稀释至16ml。
(3)对照品溶液的制备：
取牛血清白蛋白对照品15mg置50ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，制成每1ml中含0.3mg的溶液。
(4)绘制标准曲线相关溶液的制备：
量取对照品溶液0.0ml、1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml，分别置10ml容量瓶中，依次精密加水使成10.0ml。
分别精密量取1.0ml对照品溶液，并且分别精密加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10min。再各精密加入福林酚试液4.0ml，立即混匀，置55℃恒温水浴中准确反应5min，置冷水浴中10min，然后放置至室温，测定。
(5)供试品溶液制备：
量取尿多酸肽原液适量，加水稀释成总固体量40mg/ml溶液，精密量取本品1.0ml，置250ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下的测定方法，自“精密加入碱性铜试液1.0ml”起，同发操作测定在650nm波长处的吸光度，以对照品溶液浓度与相应吸收度计算回归方程，并以回归方程计算多肽含量，并乘以稀释倍数，即得。
需要注意的是，对照品与样品必须同时加入碱性铜试液与福林酚试液，时间间隔不宜过大，否则会影响吸收度的准确度。
3、测定结果
经测定，得到尿多酸肽原液中马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和多肽含量分别占固形物(即所述的尿多酸肽总固)的质量百分比，参见表1。经过换算得到1g尿多酸肽中马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和多肽的含量，参见表2。
表1
组别 马尿酸 苯乙酰谷氨酰胺 多肽
尿多酸肽原液a 10.0％ 10.3％ 48.1％
尿多酸肽原液b 8.0％ 8.0％ 39.0％
尿多酸肽原液c 8.9％ 9.0％ 42.0％
尿多酸肽原液d 9.2％ 8.9％ 47.0％
尿多酸肽原液e 9.6％ 9.3％ 47.2％
表2
组别 马尿酸 苯乙酰谷氨酰胺 多肽
尿多酸肽原液a 100mg/g 103mg/g 481mg/g
尿多酸肽原液b 80mg/g 80mg/g 390mg/g
尿多酸肽原液c 89mg/g 90mg/g 420mg/g
尿多酸肽原液d 92mg/g 89mg/g 470mg/g
尿多酸肽原液e 96mg/g 93mg/g 472mg/g
实施例7、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液a 10g
乳糖 1.8g
纯化水 6.2g
原料混合物固含量25％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为1.5:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
检测上述原料混合物的共晶点，方法如下：
将上述原料混合物装盘置于冻干机前箱搁板上，将共晶点探头置于原料混合物中，将搁板降温，记录电阻和温度变化，当原料混合物温度降至约-9.5℃～-11.1℃时，检测到电阻突然增大，可知共晶点约在-10℃。
将上述原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于冷冻干燥装置的搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-40℃以下时，保温3小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-40℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为1cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.25mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-6℃，加热时间2小时，保温4小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间4分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至6℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至38℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到35℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温5小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物A。
实施例8、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液a 10g
乳糖 1.35g
纯化水 8.9g
原料混合后得到的原料混合物固含量20％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.8cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至-2℃，加热时间6分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间4分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到37℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物B。
实施例9、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液a 10g
乳糖 1.35g
纯化水 15.58g
原料混合物固含量15％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.7cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.3mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-6℃，加热时间3小时，保温6小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间6分钟，保温5小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温3小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至39℃，加热时间1.5小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温4.5小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物C。
实施例10、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液a 10g
乳糖 2.7g
纯化水 8.9g
原料混合物固含量25％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为1:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-40℃以下时，保温3小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-40℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.8cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.25mbar时，掺入洁净空气进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-6℃，加热时间2小时，保温4小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间4分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至6℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至38℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到35℃时，停止掺入洁净空气，系统达到极限真空，保温5小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物D。
实施例11、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
尿多酸肽原液b 10g
乳糖 0.9g
纯化水 2.4g
原料混合物固含量27％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为3:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-35℃以下时，保温3小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-35℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.6cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-8℃，加热时间3小时，保温7小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至1℃，加热时间4分钟，保温5小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至4℃，加热时间5分钟，保温3小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到38℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温3小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物E。
实施例12、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液b 10g
乳糖 0.675g
纯化水 23.075g
原料混合物固含量10％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为4:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.4cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温7小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间7分钟，保温7小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物F。
实施例13、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
Figure BDA0001084394510000191
原料混合物固含量20％，尿多酸肽总固：乳糖：甘露醇质量比为4:1:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖、甘露醇和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.3cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间6分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物G。
实施例14、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
Figure BDA0001084394510000201
原料混合物固含量20％，尿多酸肽总固：乳糖：甘露醇质量比为6:2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖、甘露醇和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.9cm。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.1mbar时，掺入洁净空气进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温7小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间6分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入洁净空气，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物H。
实施例15、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
Figure BDA0001084394510000202
原料混合物固含量20％，尿多酸肽总固：乳糖：海藻糖质量比为4:1:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖、海藻糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温1小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.8cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间3小时，保温6小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间4分钟，保温5小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到37℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物I。
实施例16、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
Figure BDA0001084394510000211
原料混合物固含量20％，尿多酸肽总固：乳糖：海藻糖质量比为6:2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖、海藻糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.7cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入洁净空气进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间5分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到37℃时，停止掺入洁净空气，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物J。
实施例17、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液c 10g
甘露醇 1.35g
纯化水 8.9g
原料混合物固含量20％，尿多酸肽总固与甘露醇质量比为2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂甘露醇和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.6cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入洁净空气进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间5分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至5℃，加热时间5分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到37℃时，停止掺入洁净空气，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物K。
实施例18、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液d 10g
甘露醇 1.5g
纯化水 6.5g
原料混合物固含量25％，尿多酸肽总固与甘露醇质量比为2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂甘露醇和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.8cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入洁净空气进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至-1℃，加热时间5分钟，保温7小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至4℃，加热时间7分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入洁净空气，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物L。
实施例19、尿多酸肽冻干粉组合物的制备
原料配方：
尿多酸肽原液e 10g
海藻糖 1.75g
纯化水 9.25g
原料混合物固含量25％，尿多酸肽总固与海藻糖质量比为2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂海藻糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将原料混合物进行冷冻干燥，步骤如下：
1)预冻：将原料混合物置于不锈钢托盘中，放于搁板上，对搁板制冷，当原料混合物温度达到-45℃以下时，保温2小时。对后箱制冷，当后箱温度达到-45℃以下时，对箱体抽真空。本实施例不锈钢托盘中加样液面高度为0.7cm。
2)升华干燥：当前箱真空抽至0.2mbar时，掺入惰性气体进行升华干燥。
第一阶段将冻干设备的隔板温度升至-5℃，加热时间2小时，保温5小时；
第二阶段将冻干设备的隔板温度升至0℃，加热时间5分钟，保温6小时；
第三阶段将冻干设备的隔板温度升至4℃，加热时间6分钟，保温2小时。
3)解析干燥：将冻干设备的隔板温度升至40℃，加热时间1小时；当原料混合物温度达到36℃时，停止掺入惰性气体，系统达到极限真空，保温4小时。
4)泄压出箱：获得尿多酸肽冻干粉组合物M。
实施例20、尿多酸肽冻干粉组合物质量检测
1、尿多酸肽冻干粉组合物中马尿酸和苯乙酰谷氨酰胺含量的测定
测定方法同实施例6尿多酸肽原液马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺的含量测定方法，不同点在于尿多酸肽溶液供试液制备按照下述步骤进行。
取尿多酸肽冻干粉组合物6.2g置于100ml容量瓶，加水稀释至刻度，移稀释液2ml，用纯化水稀释至25ml，摇匀后用0.45μm针头过滤器滤过后，备用。
2、尿多酸肽冻干粉组合物中多肽含量的测定
测定方法同实施例6尿多酸肽原液多肽的含量测定方法，不同点在于尿多酸肽溶液供试溶液制备按照下述步骤进行。
取尿多酸肽冻干粉组合物6.2g置100ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。移1.0ml置250ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度。
3、尿多酸肽冻干粉组合物成分测定结果
取尿多酸肽冻干粉组合物A-M用研钵碾压均很脆，很容易研磨成粉，然后按照上述方法测定冻干粉中马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和多肽的含量，同时对尿多酸肽冻干粉组合物A-M的水分进行了测定。尿多酸肽冻干粉组合物A-M水分、马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺和多肽含量测定结果如表3所示。
表3
Figure BDA0001084394510000231
Figure BDA0001084394510000241
经测定尿多酸肽冻干粉组合物A-M的水分均在4～6％范围内，马尿酸的含量在4.9％以上，苯乙酰谷氨酰胺的含量在5.0％以上，多肽的含量在25.9％以上，上述百分数为质量百分数。所以，尿多酸肽冻干粉组合物A-M中的有效成分得到了很好地保留，本发明冻干工艺保证了所制备的尿多酸肽冻干粉组合物主要成分的稳定性，有利于后期的加工和产业化生产。
实施例21、尿多酸肽冻干粉组合物外观
泄压出箱时，观察尿多酸肽冻干粉组合物A-M的外观，如表4所示。
表4
Figure BDA0001084394510000242
由表4可知，存在冻干支撑剂乳糖、甘露醇或海藻糖中的一种或多种的时候，尿多酸肽冻干粉组合物冻干成型性较好，尤其是在保证原料混合物中的固含量为10～27％(w/w)时，成型效果较好，尤其以固含量(此处固含量是指原料混合物中的固含量)为20～25％(w/w)时效果最好，所述百分比为质量百分比。这是发明人多次实验的结果，为了兼顾尿多酸肽冻干粉组合物后期加工制造的需求，发明人重点针对冻干支撑剂乳糖和甘露醇进行了实验，因为这二者既可以作为冻干支撑剂同时也是口服固体制剂赋形剂中用量最大的常用填充剂，从而在口服固体制剂的尺寸必须满足一定限度的情况下，有利于提高后续口服固体制剂的载药量。冻干支撑剂的量，发明人选择了尿多酸肽总固和冻干支撑剂的质量比为4:1～1:1的配比，在这样的配比之下，得到的尿多酸肽冻干粉组合物最终成分为尿多酸肽和冻干支撑剂，二者质量比为4:1～1:1，具有较为平整的外观，同时将冻干支撑剂的量控制在最小范围内，避免了因过多辅料添加而影响主要活性成分的作用效果。
实施例22、尿多酸肽冻干粉组合物吸湿性检测
本发明人分别测定了尿多酸肽冻干粉组合物A-M在室温条件下，湿度为43％RH和59％RH时的吸湿性。尿多酸肽冻干粉组合物A-M在43％RH条件下吸湿性测定结果见表5；尿多酸肽冻干粉组合物A-M在59％RH条件下吸湿性测定结果如表6。
表5
Figure BDA0001084394510000251
Figure BDA0001084394510000261
表6
Figure BDA0001084394510000262
Figure BDA0001084394510000271
从表5和6中可以看出，加冻干支撑剂冻干后得到的尿多酸肽冻干粉组合物吸湿性大大降低，在0～4h内无论冻干支撑剂的种类和用量均能维持较好的形态。随着时间的推移，加入甘露醇的处方吸湿后会有局部液化的情况出现，而加入乳糖和海藻糖的处方虽然有一定程度的吸湿造成的增重，但是在8h仍能维持颗粒状，这就为后续加工创造了条件。由上述两个表格可以看出，冻干支撑剂的用量对吸湿性影响不大，而冻干支撑剂的种类则起了决定性作用。生产上，由于海藻糖价格较贵，使用受到局限，所以以乳糖和甘露醇为佳，尤其是乳糖为最佳。
对比实施例1、原液冷冻干燥
原料配方1：
尿多酸肽原液a 10g
原料混合物固含量 27％。
原料配方2：
尿多酸肽原液a 10g
纯化水 3.45g
原料混合物固含量 20％。
原料配方3：
尿多酸肽原液b 10g
纯化水 7.93g
原料混合物固含量 15％。
原料配方4：
尿多酸肽原液b 10g
纯化水 16.9g
原料混合物固含量 10％。
上述四组原料混合物固含量为尿多酸肽总固与尿多酸肽原液的质量比。
将上述四组原料混合物分别进行冷冻干燥：冷冻干燥工艺同实施例7，获得尿多酸肽冻干粉组合物1～4。
表7
组合物 尿多酸肽原液 固含量(％) 冻干品外观
1 10g 27 深棕色，完全坍塌，表面有多个鼓泡
2 10g 20 深棕色，完全塌陷，且遍布小孔
3 10g 15 深棕色，完全塌陷，且遍布小孔
4 10g 10 深棕色，完全塌陷，且遍布小孔
与实施例8、9、11和12对比可知，在尿多酸肽原液中添加了冻干支撑剂乳糖的条件下，原料混合物固含量分别为20％、15％、27％和10％时，在常规生产条件下均能冻干成型。本实施例中的尿多酸肽原液冻干产物外观如表7。而由表7可知，仅存在尿多酸肽原液，无论固含量为多少，在常规生产条件下均无法冻干成型，更无法进行后续的加工制备。所以，冻干支撑剂对于本发明尿多酸肽冻干粉组合物制备是必不可少的。
对比实施例2、原料混合物固含量不同的配方冻干
原料配方5：
尿多酸肽原液a 10g
乳糖 0.9g
纯化水 1.1g
原料混合物固含量30％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为3:1。
原料配方6：
尿多酸肽原液a 10g
乳糖 1.35g
原料混合物固含量35％，尿多酸肽总固与乳糖质量比为2:1。
原料混合物固含量为冻干支撑剂乳糖和尿多酸肽总固的质量占原料混合物总质量的百分比。
将上述两组原料混合物分别进行冷冻干燥：冷冻干燥工艺同实施例7，获得尿多酸肽冻干粉组合物5和6。
表8
Figure BDA0001084394510000281
Figure BDA0001084394510000291
由实施例8、9和11可知，当原料混合物固含量分别为20％、15％和27％均不超过30％时，原料混合物可经冷冻干燥得到成型的尿多酸肽冻干粉组合物。本实施例中的原料混合物固含量不同的配方冻干产物外观如表8。由表8可知，当原料混合物固含量超过30％时，即使存在冻干支撑剂也很难得到表面平整的成型的尿多酸肽冻干粉组合物。由此可知，原料混合物固含量多少对于尿多酸肽冻干粉组合物的制备至关重要。
对比实施例3、尿多酸肽冻干粉组合物1～4吸湿性研究
取对比实施例1制备而得的尿多酸肽冻干粉组合物1～4在室温条件下，湿度为43％RH和59％RH时进行吸湿性实验，尿多酸肽原液冻干产物吸湿性结果如表9所示。
表9
组合物 0h外观 4h外观 8h外观 24h外观
1 深棕色粉末 糊状 糊状 稠膏
2 深棕色粉末 糊状 糊状 稠膏
3 深棕色粉末 糊状 糊状 稠膏
4 深棕色粉末 糊状 糊状 稠膏
由表9可知，在没有乳糖、甘露醇等冻干支撑剂存在的情况下，尿多酸肽冻干粉组合物在4h之内即吸湿呈糊状，无法进行后续操作。而实施例22表明尿多酸肽冻干粉组合物A-M在室温条件下，湿度为43％RH和59％RH时，吸湿性大大降低，在一定时间内能维持较好的形态。所以，添加了冻干支撑剂的尿多酸肽冻干粉组合物较仅包含尿多酸肽总固的尿多酸肽冻干粉吸湿性大大降低，更利于在常规生产环境下存放。
实施例23、尿多酸肽冻干粉组合物的抗肿瘤效应
细胞培养：HepG2人肝癌细胞株用含10％胎牛血清、青霉素100U/L、链霉素100mg/L的DMEM培养液(又称为DMEM完全培养液)培养。血清、双抗以及培养液均购自GIBCO。在37℃，5％CO2条件下培养，隔天换液，2～3天传代一次。细胞用0.25％胰酶消化液消化，用对数期细胞进行实验。检测尿多酸肽冻干粉组合物对人肝癌细胞株HepG2的生长抑制作用，计算IC50值。
取尿多酸肽冻干粉组合物A、D、E、G、K、M，用纯化水溶解至40mg/ml，称作母液。过滤除菌后，按照1:5、1:10、1:20、1:40、1:80的梯度用培养液稀释好，上述比例为母液与稀释液的体积比。
取对数生长期细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，实验组按照每孔3×103个细胞的密度接种，每孔液体体积为100μL；空白对照组加入无菌水200μL。正常培养条件下培养24小时。
加液方案：(1)空白对照组已经加入无菌水200μL，无需再变动；(2)细胞对照组加入培养液200μL；(3)实验组分别加入尿多酸肽冻干粉组合物A、D、E、G、K、M各比例的稀释液，每组每个比例做三个重复。正常培养条件下培养72小时。
固定：甩掉孔内的培养液，每孔加入200μL PBS液清洗1～2次，再加入10％的三氯乙酸(固定液)100μL，4℃放置3小时。
染色：甩掉孔内固定液每孔加入200μL纯化水，反复清洗5次，在吸水纸上拍干，然后每孔加入70μL 0.4％SRB染色液(磺酰罗丹明B，购自sigma)，静置15分钟后，吸去孔内的染色液，每孔加入200μL 1％的醋酸，反复清洗5次，在吸水纸上拍干，放入培养箱干燥2小时后，每孔加入20mM Tris·Base溶液100μL，用振荡器振摇96孔板，使细胞均匀分散开来。
检测：取掉96孔板上盖，用酶标仪于550nm处测OD值。
计算：
Figure BDA0001084394510000301
以相应的细胞存活率(Y)对供试品测定液各稀释度K的对数值(X)进行线性回归，回归方程为：
Y＝aX+b 相关系数r＝A
查“相关系数的显著性水平表”得R(f)0.01＝B1或(R(f)0.05＝B2)
若A>B1则有非常显著意义(或A>B2则有显著意义)
当Y＝50时，IC50＝antilgX＝K
经计算，得到尿多酸肽冻干粉组合物A、D、E、G、K、M的IC50值分别为：1mg/mL、1.22mg/mL、9.5mg/mL、1.15mg/mL、1.19mg/mL、1.23mg/mL。
由上述结果分析，尿多酸肽冻干粉组合物对HepG2人肝癌细胞株有显著的抑制作用。所以，尿多酸肽冻干粉组合物具有抗肝癌的作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，所述组合物包括尿多酸肽固形物和冻干支撑剂，其中尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1:1～4:1；所述的冻干支撑剂选自乳糖、甘露醇、海藻糖或它们的组合；该组合物制备时原料混合物中的固含量为20～25％(w/w)；所述的尿多酸肽固形物由尿多酸肽原液干燥获得；所述的尿多酸肽原液的制备方法包括：(1)将尿液酸化处理，调节尿液pH值至2.0～4.0；30～90目筛过滤得滤液，调节pH值至1.5～3.5；以15～35μm孔径过滤装置过滤，所得滤液进行超滤和纳滤除去分子量大于5～20KD的有机物质；收集滤液；(2)通过树脂吸附法吸附步骤(1)获得的滤液中含有尿多酸肽活性组分的部分，去除无机盐离子和有机物，吸附剂为XAD-7或者XAD-16硅胶树脂；采用乙醇洗脱所述的含有尿多酸肽活性组分的部分，获得洗脱液；(3)采用Ba(OH)2溶液对步骤(2)获得的洗脱液进行除氨气处理，之后采用弱酸性阳离子树脂D113进行脱盐处理，之后再采用弱碱性阴离子树脂D118进行脱色处理；(4)步骤(3)获得的经脱色的提取液以73～75％乙醇进行病毒灭活，调节pH值4.5～5.0、温度25±5℃，放置6小时，获得经病毒灭活的溶液；(5)将步骤(4)获得的经病毒灭活的溶液调节pH至6.0～6.5，干燥机内胆温度设定30～40℃、真空在0.080～0.100MPa，进行真空干燥除去部分乙醇和水分，浓缩至固含量为270～350mg/g；收集浓缩液，调节pH至7.0～7.5，以孔径为1.2±0.2μm的过滤装置过滤，收集滤液，即尿多酸肽原液，干燥获得尿多酸肽固形物。
2.如权利要求1所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1.5:1～3:1。
3.如权利要求1所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为2:1～3:1。
4.如权利要求1所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，所述的冻干支撑剂选自：乳糖，甘露醇或它们的组合。
5.如权利要求4所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，所述的冻干支撑剂为乳糖。
6.如权利要求1～5任一所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，所述的尿多酸肽固形物中，包括马尿酸≥70mg/g，苯乙酰谷氨酰胺≥70mg/g和多肽≥350mg/g。
7.如权利要求6所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物，其特征在于，包括马尿酸≥80mg/g，苯乙酰谷氨酰胺≥80mg/g和多肽≥390mg/g。
8.一种制备低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将尿多酸肽原液和冻干支撑剂混合；混合后，混合物中的尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1:1～4:1；所述的冻干支撑剂选自乳糖、甘露醇、海藻糖或它们的组合；并且，混合物中总固体的含量占混合物总重量的20％～25％；所述的尿多酸肽原液的制备方法包括：(1)将尿液酸化处理，调节尿液pH值至2.0～4.0；30～90目筛过滤得滤液，调节pH值至1.5～3.5；以15～35μm孔径过滤装置过滤，所得滤液进行超滤和纳滤除去分子量大于5～20KD的有机物质；收集滤液；(2)通过树脂吸附法吸附步骤(1)获得的滤液中含有尿多酸肽活性组分的部分，去除无机盐离子和有机物，吸附剂为XAD-7或者XAD-16硅胶树脂；采用乙醇洗脱所述的含有尿多酸肽活性组分的部分，获得洗脱液；(3)采用Ba(OH)2溶液对步骤(2)获得的洗脱液进行除氨气处理，之后采用弱酸性阳离子树脂D113进行脱盐处理，之后再采用弱碱性阴离子树脂D118进行脱色处理；(4)步骤(3)获得的经脱色的提取液以73～75％乙醇进行病毒灭活，调节pH值4.5～5.0、温度25±5℃，放置6小时，获得经病毒灭活的溶液；(5)将步骤(4)获得的经病毒灭活的溶液调节pH至6.0～6.5，干燥机内胆温度设定30～40℃、真空在0.080～0.100MPa，进行真空干燥除去部分乙醇和水分，浓缩至固含量为270～350mg/g；收集浓缩液，调节pH至7.0～7.5，以孔径为1.2±0.2μm的过滤装置过滤，收集滤液，即尿多酸肽原液，干燥获得尿多酸肽固形物；
(b)将步骤(a)获得的混合物进行冷冻干燥，获得所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物；其中，所述的冷冻干燥包括以下步骤：
(i)将步骤(a)获得的混合物置于开口的冻干容器中，置于冻干设备中；调节温度至-30℃以下，保温0.5～5小时；抽真空；
(ii)步骤(i)的抽真空进行到气压为0.05～0.5mbar时，掺入气体进行升华干燥，所述气体是洁净空气或惰性气体；
(iii)对步骤(ii)的升华干燥产物调节温度至33～40℃，停止掺入气体，保温3～5小时；和
(iv)对步骤(iii)获得的产物泄压出箱，获得所述的低吸湿的尿多酸肽冻干粉组合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，(a)中，尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为1.5:1～3:1。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，(a)中，尿多酸肽固形物:冻干支撑剂按照质量比为2:1～3:1。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的冻干支撑剂选自：乳糖，甘露醇，或它们的组合。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的尿多酸肽原液包含按照重量比25～35％的尿多酸肽固形物，余量为水性溶剂，所述的水性溶剂选自水和/或醇。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，对后箱制冷至温度达到-30℃以下时，对箱体抽真空；或
步骤(ii)中，所述的升华干燥包括：第一阶段，将冻干设备的隔板温度升至-8～-4℃，加热时间1～3小时，保温4～7小时；第二阶段，将冻干设备的隔板温度升至-2～1℃，加热时间4～7分钟，保温5～7小时；第三阶段，将冻干设备的隔板温度升至4～6℃，加热时间4～7分钟，保温1～3小时；或
步骤(iii)中，调节温度至33～40℃的方法是：将冻干设备的搁板温度升至36～42℃，加热时间0.5～3小时，使原料混合物温度达到33～40℃。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述的冻干容器中，混合物的高度满足混合物底部水分可以溢出，混合物的高度为0.2～1.0厘米。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，混合物的高度为0.3～0.8厘米；所述的开口的冻干容器为托盘。
16.如权利要求8所述的方法，其特征在于，(3)中，在除氨气处理之后，重复步骤(2)，之后依次进行脱盐处理和脱色处理。
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