CN102115484A - 一种两性霉素b降解产物、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种两性霉素B降解产物，其具有良好的抗真菌活性，以及低毒性。本发明还提供了所述降解产物的制备方法，及其在制备治疗真菌感染药物方面的应用。本发明的两性霉素B降解产物，其活性与两性霉素B相当，但其LD₅₀值是两性霉素B的2倍，活性高、毒性低；且制备方法简单、操作简便。

Description

一种两性霉素B降解产物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及具有抗真菌活性且低毒性的两性霉素B降解产物、其制备方法及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

近年来，由于抗生素、抗癌药物、激素类药物的滥用，使得深部真菌感染的发病率与病死率逐年增加，而临床可以使用的抗真菌药物种类少，选择性小，且存在毒副作用，给真菌感染疾病的治疗带来了巨大的困难。两性霉素B是许多危重深部真菌感染治疗的首选药物，目前尚无适当的替代药物，被喻为“黄金标准”。

两性霉素B(AmB)是由结节性链霉菌产生的一种七烯类广谱抗真菌抗生素，分子式为C₄₇H₇₃NO₁₇，具有如式II所示结构：

式II

AmB的抗真菌活性是在1956年被发现的，1960年两性霉素B被用于临床，用于治疗由多种深部真菌如白色念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌等引起的心脏或全身感染。对某些严重的深部真菌病如新生隐球菌脑膜炎、侵袭性曲霉病，特别是对免疫缺陷或严重粒细胞缺乏的患者的治疗以及某些地方性真菌病如球孢子菌病、组织胞浆菌病、皮炎芽生菌病等必需应用两性霉素B，其在临床抗真菌治疗中具有不可替代的重要作用。

但是，AmB的毒副作用较大，临床表现为肝肾毒性，针对其临床用药的重要地位与毒副作用之间的矛盾，近年来，不断有文献报道、专利等公开两性霉素B的新剂型，其在保持AmB抗真菌活性的前提下，能够降低AmB的毒性。

新近开发的新剂型有以下几种：(1)两性霉素B脂质体(L-AMB)，是用脂质体将两性霉素B包裹而成，通过改变药物的药代动力学特征，减少肝肾毒性。(2)两性霉素B脂质体复合物(ABLC)，商品名Abelect，是脂质体与两性霉素B交织而成，其能迅速被网状内皮细胞摄取而减少与蛋白质的结合，从而改善两性霉素B体内过程和毒理学特性，最大限度的降低毒副作用。(3)两性霉素胶样分散体(ABCD)，商品名Amphocil和Amphotec，是用胆固醇硫酸酯与等量的两性霉素B混合包裹而成。(4)两性霉素B/聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯(AMB/PEG-PBLG)纳米球，是将AmB包埋于AMB/PEG-PBLG纳米球载体内的一种缓释制剂，其可以减少低聚物的存在，从而大大降低溶血毒性。

上述新剂型虽然提高了临床疗效，减弱了药物的毒副作用，但是其都是基于药物动力学角度，通过改变药物的药代动力学特征，使药物定向在靶器官产生作用，从而降低在其他部位的毒性，虽然取得了一定的效果，但是该效果只是表面现象，而不能从根本上解决AmB的毒副作用问题；并且两性霉素B新剂型价格昂贵，在临床应用方面大大受限。

为了解决上述问题，本发明从两性霉素B降解产物的角度出发，在常用的各种降解条件下破坏两性霉素B原药，从中找到活性与两性霉素B相当或更高，而毒性比两性霉素B低的类似物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗真菌活性且低毒性的两性霉素B降解产物。

本发明的另一目的在于提供所述两性霉素B降解产物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述两性霉素B降解产物的应用。

为了实现本发明的目的，本发明的两性霉素B降解产物为具有如式I所示结构的化合物：

式I

其中，R为H或CH₃。

本发明的两性霉素B降解产物的制备方法，包括如下步骤：

1)将两性霉素B(AmB纯品)用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)溶解，在温度60℃水浴条件下降解48～96h；

2)用制备液相色谱仪分离纯化，其流动相为甲醇、乙腈和水，合并得到的降解产物馏分后，去除有机溶剂，剩余水相用凝胶过滤法纯化；

3)将步骤2)制得的降解产物冷冻干燥，得到松散的两性霉素B降解产物粉末，产率8％～10％。

其中，制备液相色谱仪的色谱条件为：

色谱柱PREP-ODS C18制备柱(岛津公司，shim-pack PREP-ODS色谱柱，20mm×250mm)；

流动相以体积比甲醇∶乙腈＝43∶20为A相，水为B相，

A相与B相的体积比为85∶15；

检测波长380nm；

流速8.0mL/min。

此外，步骤2)中在采用制备液相色谱仪分离本发明的两性霉素B降解产物时，因为流动相为甲醇、乙腈和水，因此收集得到的两性霉素B降解产物中既有有机相又有水相。其中，有机相通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去，但仍会有少量有机溶剂残留，影响降解产物的后续处理。因此，本发明通过凝胶过滤法除去剩余水相中残留的少量有机溶剂，从而进一步纯化降解产物。

所述凝胶过滤法所使用的凝胶为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150和G-200等交联葡聚糖凝胶，优选的是Sephadex LH-20葡聚糖凝胶。

本发明人在常用的各种降解条件下，如酸性、碱性、氧化、加热等条件，破坏两性霉素B原药的固体粉末。但是由于两性霉素B结构复杂，因此不同条件下的降解结果不同。例如，在某些酸性、碱性条件下降解，或者在氧化降解、直接加热固体粉末降解时，只能得到初级降解产物，且上述初级降解产物不稳定，进一步产生次级降解产物，从而无法分离研究；而只有在某些特定条件下，才能得到较为单一的降解产物，因此两性霉素B降解条件的选择尤为重要。

本发明选择用DMF或DMAC溶解两性霉素B，然后在60℃温度下加速降解48～96h，从中分离纯化出较为稳定的两性霉素B降解产物，并对上述降解产物进行了初步的活性和毒性测定，结果表明，本发明的两性霉素B降解产物的抗真菌活性与两性霉素B原药相当，但毒性降低至少一半。

此外，本发明人对两性霉素B降解产物的分离纯化尝试了不同方法，如凝胶色谱法、薄层板、制备液相色谱仪等，但是由于本发明的降解产物与两性霉素B结构类似，因此凝胶色谱和薄层板等方法的分离效率低、分离效果差，最终本发明人选择了制备液相色谱仪分离纯化两性霉素B降解产物，该方法可以准确定位各化合物的色谱峰，分离纯化效果好，且使用制备色谱柱，进样量为1mL，分离效率高，重现性好。

特别地，由于降解产物属于药物杂质研究的一部分，因此本发明人将本发明的两性霉素B降解产物与两性霉素B中的杂质进行了比对，从而可以进一步对杂质进行定位和结构确证，也完善了两性霉素B的杂质谱。

一般来说，杂质谱对药品的生产及质量控制具有重大意义，一方面，如果该杂质活性好、毒性低，就具有成药的潜力；另一方面，如果杂质毒性大，就可以通过反馈到生产环节，进一步降低该杂质含量，从而降低毒性提高药效；并且，杂质谱对质量标准的建立及药品检验也具有重要的参考和指导意义。

本发明的两性霉素B降解产物在制备治疗真菌感染药物方面的应用。

本发明的优点在于，本发明的两性霉素B降解产物，其活性与两性霉素B原药活性相当，但其LD₅₀值是原药的2倍，活性高、毒性低；且制备方法简单、操作简便。

具体实施方式

以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取100.0mg两性霉素B(上海先锋药业)于50mL容量瓶中，用DMF溶解，配制成浓度为2.0mg/mL的溶液，并用超声加速溶解；然后将其放入温度60℃的水浴中加热72h，使两性霉素B加速降解，在降解过程中用高效液相色谱(HPLC)监测原药和降解产物的含量变化；降解完毕后，用制备液相色谱仪分离纯化；然后合并降解产物的馏分，去除溶剂；剩余的水相用凝胶过滤法纯化，所使用的凝胶为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶；最后冷冻干燥，制得9.0mg R＝H的两性霉素B降解产物(AmB(H))，产率9％。

其中，制备液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱PREP-ODS C18制备柱(岛津公司，shim-pack PREP-ODS色谱柱，20mm×250mm)；流动相以体积比甲醇∶乙腈＝43∶20为A相，水为B相，A相与B相的体积比为85∶15；检测波长380nm；流速8.0mL/min。

表1为两性霉素B原药与两性霉素B降解产物的MS数据。

表1两性霉素B原药与两性霉素B降解产物的MS

表2为本发明的两性霉素B降解产物与两性霉素B的¹H NMR和¹³C NMR。

表2为本发明的两性霉素B降解产物与两性霉素B的¹H NMR和¹³C NMR

本发明通过对两性霉素B(AmB纯品)用N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)进行溶解，并在60℃温度下加速降解，也可从中分离纯化出R为CH₃的两性霉素B降解产物。

以下通过实验测定本发明的两性霉素B降解产物的活性及毒性。

实验例1

本试验例的目的在于通过微生物效价管碟法测定本发明的两性霉素B降解产物的活性。

根据药典规定的二剂量法测定两性霉素B降解液混合液(实施例1中经制备液相色谱仪分离前的AmB(H)与两性霉素B的混合液)的效价。其中，缓冲液为用吐温80改进后的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾缓冲盐溶液，pH＝7.0，吐温80含量为总重量的1％；培养基为中国药典抗生素微生物检定法规定的培养基IV，底层加菌层；试验菌为啤酒酵母菌。具体实验条件如表3所示。两性霉素B降解液混合液和两性霉素B原药测定结果如表4所示。

表3微生物效价管碟法测定的实验条件

表4两性霉素B降解液混合液和两性霉素B原药的效价值

微生物效价法测定降解液的估计效价(含有68％两性霉素B+32％降解产物)	微生物效价法测定降解液中折合出来的对应两性霉素B原药浓度的估计效价(68％浓度的两性霉素B纯品)
		1085U/mg	759.5U/mg

由表4可以推算出，单位百分比的两性霉素B和降解产物所对应的效价单位相当，存在的微小差异是由微生物效价测定法的系统误差以及两种物质的分子量差别造成的。

由此结果表明，本发明两性霉素B降解产物与两性霉素B原药活性相当。

实验例2通过斑马鱼胚胎动物模型测定两性霉素B降解产物的毒性

选用TU系斑马鱼半包期的健康胚胎作为试验对象，每30只胚胎为一组，每次试验设置系统对照组，野生型对照组，不同浓度的给药组。其中，系统对照组采用含0.1％(重量百分数)DMF的人工海水培养斑马鱼胚胎，野生型对照组采用人工海水培养，给药组采用经人工海水稀释后的药液培养，药液中DMF的含量低于总重量的0.1％。

给药后在25℃恒温条件下培养72h，并分别在第24小时、第48小时以及第72小时，观察胚胎的存活状况以及形态特征。以第72小时观察到的累计死亡个数计算死亡率，以死亡率在一半左右的浓度作为半数致死量。

同步测定两性霉素B、两性霉素B降解液混合液(实施例1中经制备液相色谱仪分离前的AmB(H)与两性霉素B的混合液)的毒性，由于混合液中绝大部分为两性霉素B(占67重量％)以及AmB(H)(占32重量％)，所以通过比较两性霉素B及混合液的LD₅₀值即可确定两性霉素B与AmB(H)的毒性大小。试验从高浓度向低浓度调整，直至找到半数致死量为止。结果如表5所示。

表5两性霉素B降解液混合液及两性霉素B的LD₅₀值

结果表明，本发明的两性霉素B降解产物的毒性与两性霉素B相比，至少降低一半。

同样，本发明的R为CH₃的两性霉素B降解产物也具有同R＝H的两性霉素B降解产物相近的活性和低毒性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种两性霉素B降解产物，其特征在于，其为具有式I所示结构的化合物：

式I

其中，R为H或CH₃。

2.制备权利要求1所述的降解产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将两性霉素B用N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二甲基乙酰胺溶解在温度60℃条件下降解48～96h；

2)用制备液相色谱仪分离纯化，其流动相为甲醇、乙腈和水，合并得到的降解产物馏分后，去除有机溶剂，剩余的水相用凝胶过滤法纯化；

3)将步骤2)制得的降解产物冷冻干燥。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中制备液相色谱仪的色谱条件为：

色谱柱  PREP-ODS C18制备柱；

流动相  以体积比甲醇∶乙腈＝43∶20为A相，水为B相，

        A相与B相的体积比为85∶15；

检测波长380nm；

流速    8.0mL/min。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述凝胶过滤法所使用的凝胶为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150或G-200交联葡聚糖凝胶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶过滤法所使用的凝胶为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶。

6.权利要求1所述的两性霉素B降解产物在制备治疗真菌感染药物方面的应用。