CN114315921A - 一种两性霉素b的杂质c或杂质e的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离纯化两性霉素B的杂质C或杂质E的方法，该方法主要通过液相制备技术，得到两性霉素B的杂质C和杂质E纯品。具体包括以下步骤：在不同条件下加速破坏得到两性霉素B的杂质溶液，以EDTA‑2Na水溶液/乙腈为流动相进行洗脱，收集目标杂质馏分，用液相色谱法测定纯度，纯度可达90％以上。改变流动相以水/乙腈进行再洗脱除盐，收集目标馏分，减压浓缩后得到目标产物。两性霉素B相关杂质存在样品不稳定，分离制备难度大等特点，本发明所述的两性霉素B的杂质C和杂质E的分离纯化方法，具有分离效率高、分离速度快、操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明属于药物分离纯化领域，具体地涉及两性霉素B杂质杂质C和杂质E分离制备方法。
背景技术
随着器官移植、免疫抑制药物、放疗和抗癌化疗等在先进的医学治疗中的应用以及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，使真菌病患者的人数有所增加。两性霉素B(AmphotericinB)为多烯类抗真菌药物，其主要作用机制为通过选择性与细胞膜的麦角固醇结合，增加膜的通透性，使重要物质外漏、有毒物质内渗，从而降低真菌生命力，达到抗真菌作用。两性霉素B因其抗菌谱广、抗真菌作用强而在临床治疗上发挥着重要的作用。
两性霉素B作为临床应用药物，其含量必须满足药品质量控制标准。因此，对其杂质控制即杂质谱的研究，即掌握两性霉素B杂质种类、含量、来源及结构信息是非常必要的。截至目前，国内外相关期刊文献和专利著作等对两性霉素B的研究主要集中在临床应用及其毒副作用和含量测定这几个方面，对两性霉素B杂质相关杂质的分离纯化研究少有报道，尤其是两性霉素B杂质C个杂质E的分离纯化方法。
如有学者对两性霉素B杂质进行了系统的研究，包括两性霉素B的碱性条件降解产物的考察研究、两性霉素B的酸性条件降解产物的考察研究以及两性霉素B的DMF溶液条件下水浴加热降解产物的研究。
CN102115484A发明了一种两性霉素B降解产物、其制备方法及其应用，该发明通过制备液相色谱仪分离纯化降解产物，再经凝胶过滤纯化，冷冻干燥后得两性霉素B降解产物(AmB(H))，产率仅9％。
目前对两性霉素B杂质的考察研究资料较少，两性霉素B杂质稳定性较差，分离具有一定难度，如果能开发通用的适用于两性霉素B杂质的分离制备方法，得到两性霉素B杂质纯品，即能完善两性霉素B的杂质谱，对于两性霉素B杂质的研究具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供两性霉素B杂质的分离制备方法，该分离制备方法操作简单，分离效率高，能够得到纯度较高的杂质C或杂质E。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明所述两性霉素B的杂质C和杂质E的结构式如下所示：
本发明具体地涉及两性霉素B的杂质C或杂质E分离制备方法，包括如下操作步骤：
(1)对两性霉素B进行预处理，得到两性霉素B的杂质溶液；
(2)在动态轴向压缩制备色谱中，以柠檬酸水溶液/乙腈或EDTA-2Na水溶液/乙腈为流动相进行两次洗脱，收集目标杂质馏分，然后经过减压浓缩，得到两性霉素B杂质浓缩液；
(3)以水/乙腈为流动相平衡色谱柱，改变流动相比例，将步骤(2)中得到的两性霉素B杂质浓缩液进行再洗脱除盐，收集目标馏分；
(4)将步骤(3)收集的馏分进行减压蒸馏，除去大部分溶剂后，然后进行冷冻干燥，得到两性霉素B的杂质C或杂质E。
当杂质为杂质C时，优选的，步骤(1)中，前处理方式为：50mg两性霉素B，加入5mL的NMP、35mL乙醇以及0.1mL浓盐酸。超声搅拌至完全溶解，避光破坏30min后，再加入5mL的10g/L的乙酸铵溶液。
当杂质为杂质C时，步骤(2)中，一次纯化结束之后，收集目标馏分，减压浓缩，然后用流动相稀释，进行二次纯化；作为优选，一次纯化的色谱条件如下：流动相比例：0.01～0.03M柠檬酸水溶液与乙腈的体积比为65～75:25～35，检测波长：383nm，流速：45～55mL/min，进样体积200mL，采用50DAC制备液相色谱制备；
二次纯化的色谱条件如下：流动相比例：0.01～0.03M柠檬酸水溶液与乙腈的体积比为60～70:30～40；检测波长：383nm，流速：45～55mL/min，进样体积400mL，50DAC制备液相色谱制备。作为进一步的优选，步骤(2)中，制备液相色谱条件为：一次纯化：0.02M柠檬酸水溶液/乙腈(65：35)，检测波长383nm，流速50mL/min，进样体积200mL，50DAC制备液相色谱制备(图1)；二次纯化：0.02M柠檬酸水溶液/乙腈(67：33)，检测波长383nm，流速50mL/min，进样体积400mL，50DAC制备液相色谱制备(图2)。
当杂质为杂质E时，优选的，步骤(1)中，前处理方式为：2g两性霉素B，加入400mL的DMF，超声搅拌至完全溶解，于60℃破坏3d。
当杂质为杂质E时，步骤(2)中，一次纯化结束之后，收集目标馏分，减压浓缩，然后用流动相稀释，进行二次纯化；作为优选，一次纯化的色谱条件如下：2.0～3.0mM EDTA-2Na水溶液与乙腈的体积比为55～65：35～45，检测波长383nm，流速45～55mL/min，进样体积100mL，50DAC制备液相色谱制备；
二次纯化的色谱条件如下：2.0～3.0mM EDTA-2Na水溶液与乙腈的体积比为60～70：30～40，检测波长383nm，流速45～55mL/min，50DAC制备液相色谱制备。作为进一步的优选，步骤(2)中，制备液相色谱条件为：一次纯化：2.5mM EDTA-2Na水溶液/乙腈(60：40)，检测波长383nm，流速50mL/min，进样体积100mL，制备色谱柱为50DAC(图3)；二次纯化：2.5mMEDTA-2Na水溶液/乙腈(65：35)，检测波长383nm，流速50mL/min，50DAC制备液相色谱制备(图4)。
优选的，S2所述两性霉素B杂质C和杂质E纯度均可达90％以上。
优选的，S3所述两性霉素B杂质C和杂质E除盐方法为：平衡色谱柱时，水和乙腈的体积比为85～95：5～15；洗脱时，水和乙腈的体积比为60～70：30～40。进一步优选为，以水/乙腈(90：10)平衡色谱柱，用泵抽入两性霉素B杂质浓缩液250mL，再以水/乙腈(90：10)平衡5min，改变流动相水/乙腈(65：35)进行洗脱，收集目标馏分。
本发明所采用前处理方式、制备液相色谱条件、除盐方式均可根据具体情况进行适当调整。
因此，本发明方法能纯化两性霉素B杂质，对两性霉素B杂质具有较好的普适性及通用性。两性霉素B杂质样品不稳定，分离制备难度大，本发明所述的两性霉素B的杂质C和杂质E的分离制备方法分离效率高、分离速度快、操作简便。
附图说明
图1为两性霉素B杂质C一次纯化液相色谱图；
图2为两性霉素B杂质C二次纯化液相色谱图；
图3为两性霉素B杂质E一次纯化液相色谱图；
图4为两性霉素B杂质E二次纯化液相色谱图；
图5为两性霉素B杂质C纯品液相色谱图；
图6为两性霉素B杂质E纯品液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。以下实施例中所用试剂和原料，除制备方法外，其余均为市售。除非另有定义，否则本文中所有科技术语具有的含义与权利要求主题所属技术领域人员通常理解的含义相同。
实施例1：两性霉素B杂质C分离纯化
(1)称取50mg两性霉素B，加入5mL的NMP以及35mL乙醇以及0.1mL浓盐酸。超声搅拌至完全溶解，避光破坏30min后，再加入5mL的10g/L的乙酸铵溶液，搅拌均匀后即可进样。
(2)动态轴向压缩制备色谱条件：
一次纯化：流动相A相为0.02M柠檬酸水溶液(氨水调节pH至4.7)，B相为乙腈；流动相A：流动相B＝65：35；检测波长为383nm；流速为50mL/min；进样体积为200mL，50DAC动态轴向压缩柱为ODS柱，粒径为10um。
按上述制备液相色谱条件运行洗脱方法，收集目标杂质(RT＝54.68min)馏分。
二次纯化：流动相A相为0.02M柠檬酸水溶液(氨水调节pH至4.7)，B相为乙腈；流动相A：流动相B＝67：33；检测波长为383nm；流速为50mL/min；向一次纯化所得馏分中加入等体积流动相A进行稀释，进样体积为400mL，50DAC动态轴向压缩柱为ODS柱，粒径为10um。
按上述制备液相色谱条件运行洗脱方法，收集目标杂质(RT＝54.8min)馏分，用液相色谱法测定各馏分纯度，纯度可达90％以上。将收集的馏分30℃减压蒸馏，除去有机溶剂后，得两性霉素B杂质C浓缩液，待用。
(3)除盐：以水：乙腈＝90：10作流动相平衡色谱柱，用泵抽入两性霉素B杂质C浓缩液250mL，再以水：乙腈＝90：10作流动相平衡5min，改变流动相为水：乙腈＝65：35进行洗脱，收集目标馏分。
(4)将收集的馏分30℃减压蒸馏，除去绝大部分溶剂后，将样品转移至培养皿中，冷冻后放入冷冻干燥机干燥，除去残留溶剂，得到20mg黄色粉末，即为两性霉素B杂质C纯品，用分析型液相色谱法测定其纯度，纯度为90％(图5)。
实施例2：两性霉素B杂质E分离纯化
(1)称取2g两性霉素B，加入400mL的DMF，超声搅拌至完全溶解，于60℃破坏3d，得两性霉素B杂质E破坏溶液。
(2)动态轴向压缩制备色谱条件：
一次纯化：流动相A相为2.5mM EDTA-2Na水溶液，B相为乙腈；流动相A：流动相B＝60：40；检测波长为383nm；流速为50mL/min；进样体积为100mL，制备色谱柱为50DAC。
按上述制备液相色谱条件运行洗脱方法，收集目标杂质(RT＝49.75min)馏分。
二次纯化：流动相A相为2.5mM EDTA-2Na水溶液，B相为乙腈；流动相A：流动相B＝65：35；检测波长为383nm；流速为50mL/min；将一次纯化馏分稀释后进样，50DAC动态轴向压缩柱为ODS柱，粒径为10ul。
按上述制备液相色谱条件运行洗脱方法，收集目标杂质(RT＝154.49min)馏分，用液相色谱法测定各馏分纯度，纯度可达90％以上。将收集的馏分30℃减压蒸馏，除去有机溶剂后，得两性霉素B杂质E浓缩液，待用。
(3)除盐：以水：乙腈＝90：10作流动相平衡色谱柱，用泵抽入两性霉素B杂质E浓缩液250mL，再以水：乙腈＝90：10作流动相平衡5min，改变流动相为水：乙腈＝65：35进行洗脱，收集目标馏分。
(4)将收集的馏分30℃减压蒸馏，除去绝大部分溶剂后，将样品转移至培养皿中，冷冻完全后放入冷冻干燥机干燥，最终得到20mg黄色粉末，即为两性霉素B杂质E纯品，用分析型液相色谱法测定其纯度，纯度为92％(图6)。
实施例3：两性霉素B杂质C预处理优化
称取50mg两性霉素B，加入5mL的NMP以及35mL乙醇以及0.1mL浓盐酸。超声搅拌至完全溶解，再加入5mL的10g/L的乙酸铵溶液，分别避光破坏30min、60min及120min后进样检测，随着破坏时间的延长，目标杂质C含量更低，最终优选30min为最佳的破坏时长。
实施例4：两性霉素B杂质E预处理优化
称取2g两性霉素B，加入200mL的DMF，将其浓度提高1倍，超声搅拌至完全溶解，于60℃破坏3d，得两性霉素B杂质E破坏溶液后进样分析，随着破坏溶液浓度的提高，目标杂质E含量反而降低，最终优选2g/400ml为最佳破坏浓度。
Claims (6)
1.一种两性霉素B的杂质C或杂质E的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对两性霉素B进行预处理，得到两性霉素B的杂质溶液；
(2)在动态轴向压缩制备色谱中，以柠檬酸水溶液/乙腈或EDTA-2Na水溶液/乙腈为流动相进行两次洗脱，收集目标杂质馏分，然后经过减压浓缩，得到两性霉素B杂质浓缩液；
(3)以水/乙腈为流动相平衡色谱柱，改变流动相比例，将步骤(2)中得到的两性霉素B杂质浓缩液进行再洗脱除盐，收集目标馏分；
(4)将步骤(3)收集的馏分进行减压蒸馏，除去大部分溶剂后，然后进行冷冻干燥，得到两性霉素B的杂质C或杂质E。
2.根据权利要求1所述的两性霉素B的杂质C或杂质E的分离纯化方法，其特征在于，两性霉素B的杂质为杂质C；
步骤(1)中，所述预处理包括：
在两性霉素B中加入NMP、乙醇和浓盐酸，超声搅拌至完全溶解，避光破坏20～40min后，再加入乙酸铵溶液；
步骤(2)中，流动相为柠檬酸水溶液/乙腈。
3.根据权利要求2所述的两性霉素B的杂质C或杂质E的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，一次纯化结束之后，收集目标馏分，减压浓缩，然后用流动相稀释，进行二次纯化；
一次纯化的色谱条件如下：流动相比例：0.01～0.03M柠檬酸水溶液与乙腈的体积比为65～75:25～35，检测波长：383nm，流速：45～55mL/min，进样体积200mL，采用50DAC制备液相色谱制备；
二次纯化的色谱条件如下：流动相比例：0.01～0.03M柠檬酸水溶液与乙腈的体积比为60～70:30～40；检测波长：383nm，流速：45～55mL/min，进样体积400mL，50DAC制备液相色谱制备。
4.根据权利要求1所述的两性霉素B的杂质C或杂质E的分离纯化方法，其特征在于，两性霉素B的杂质为杂质E；
步骤(1)中，所述预处理包括：
在两性霉素B中加入DMF，超声搅拌至完全溶解，于60～70℃破坏3～4天；
步骤(2)中，流动相为EDTA-2Na水溶液/乙腈。
5.根据权利要求4所述的两性霉素B的杂质C或杂质E的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，一次纯化结束之后，收集目标馏分，减压浓缩，然后用流动相稀释，进行二次纯化；
一次纯化的色谱条件如下：2.0～3.0mM EDTA-2Na水溶液与乙腈的体积比为55～65：35～45，检测波长383nm，流速45～55mL/min，进样体积100mL，50DAC制备液相色谱制备；
二次纯化的色谱条件如下：2.0～3.0mM EDTA-2Na水溶液与乙腈的体积比为60～70：30～40，检测波长383nm，流速45～55mL/min，50DAC制备液相色谱制备。
6.根据权利要求1～5任一项所述的两性霉素B的杂质C或杂质E的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，平衡色谱柱时，水和乙腈的体积比为85～95：5～15；
洗脱时，水和乙腈的体积比为60～70：30～40。
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| WO1991009047A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-27 | Beecham Group Plc | Amphotericin b derivatives, their production and use |
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| Title |
|---|
| YAN CHANG ET AL.: "Simultaneous determination of purity and potency of amphotericin B by HPLC", 《ORIGINAL ARTICLE》, vol. 64, 5 October 2011 (2011-10-05), pages 739 * |
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