CN104311569B - 一种提取和初步纯化河豚毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从河豚鱼内脏组织中提取及初步纯化河豚毒素的方法。该方法使用匀浆、透析、反相+弱阴离子层析吸附除去杂质、弱阳离子交换浓缩纯化河豚毒素,然后冷冻干燥获得80％纯度河豚毒素干粉。这种新的方法和工艺使用LC‑MS或LC‑MS/MS检测每一步河豚毒素浓度，确保无河豚毒素的损失和抛弃。使用本发明的方法,河豚毒素产量是现有专利和文献产量的10‑100倍。使用本发明的工艺，尤其是连续流色谱和特别的弱阳离子交换材料，可以一次性处理10kg河豚鱼的卵巢，获得10‑20g纯度80％‑90％的河豚毒素干粉。

Description

一种提取和初步纯化河豚毒素的方法
技术领域
本发明涉及色谱柱技术领域，具体涉及一种提取和初步纯化河豚毒素的方法，尤其涉及一种使用弱阳离子交换色谱柱进行的提取和初步纯化河豚毒素的方法
背景技术
河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是鲀鱼类(俗称河豚鱼)及其它生物体内含有的一种生物碱。其分子式为C11H17O8N3，分子量为319，其为氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，可高选择性和高亲和性地阻断神经兴奋膜上的钠离子通道。河豚毒素是小分子量、非蛋白质的神经性毒素，其毒性比剧毒氰化钠还要高1250多倍，0.5mg即可致死。河豚毒素与钠通道的SS1/SS2亚基具有高特异性和高亲和力的结合，过去几十年已作为一种工具药物广泛用于药理学研究，特别是在神经和肌肉生理领域。TTX具有镇痛、降压、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效。将河豚毒素应用于制药领域的先决条件是制备足量高纯度、高质量的河豚毒素。
对河豚毒素的提取一般分为两步，包括从河豚鱼组织中提取河豚毒素粗品，即提取步骤，和从河豚毒素粗品中精制高纯度河豚毒素，即纯化精制步骤。
1950年，Yokoo成功获得了最小致死剂量(MLD)为0.01gamma的结晶河豚毒素。(J.Chem.Soc.Japan71，590(1950))。他从河豚鱼获得卵巢组织，用水浸出河豚毒素，蒸干，获得MLD为40.gamma的干物质。接着他用醋酸铅和氨沉淀毒素，然后用磷酸钨酸和汞苦味酸盐除去杂质，用苯肼除糖。再次使用汞苦味酸盐以沉淀毒素，接着用苦酮酸-甲醇-苦酮酸处理获得结晶毒。但该提取方法用20公斤卵巢，只获得13毫克的结晶河豚毒素。
在1951年，Nagai(Fukuoka Ishi45，1(1954))使用离子交换树脂(AmberliteIRC-50)吸附毒素，用盐酸溶液洗脱，然后用Amberlite IR-4B处理该洗脱液以除去盐酸。浓缩后，用无水乙醇来提取毒素。该提取方法用20公斤河豚鱼的卵巢只得到2.5毫克毒素晶体。
1952年，Tsuda和Kawamura使用圆形滤纸色谱法(K.Tsuda等人，J.Pharm.Soc.Japan72,187,771(1952))获得MLD＝10μg/公斤毒素。后来他们通过活性炭柱层析发展了大规模生产的方法(Tsuda,Kagaku no Ryouiki,supplement,80,9(1967))，能够处理千公斤豚鱼卵巢，并取得10克MLD＝10.μg/公斤毒素。同时，Woodward(R.B.Boodward,Pure Appl.Chem.9,49-74(1964)取得了类似的结果。
1964年，Goto Toshio等人(Goto Toshio and Takahashi等人,J.Chem.Soc.Japan85,508(1964))简化了工艺流程，采用离子交换和活性炭吸附，从百公斤河豚卵巢只得到1-2克所谓的粗毒素。
1980年后，一些改进的方法不时被报道，但普遍跟进Goto Toshio等人的方法，产量没有增加。值得指出的是，广西和加拿大Wex Medical InstrumentationCo.,Ltd.发表的2003年美国专利US6,552,191中提供的提取方法是迄今为止最好的，产量比其他方法增加了3倍，处理20公斤河豚卵巢，取得1克80-90％纯度的河豚毒素。
然而，所有这些方法都包含一些让河豚毒素大量损失的步骤，例如：(1)醋酸提取液加热脱脂；(2)使用离子交换树脂和活性炭吸附；(3)调节pH到碱性条件，沉淀河豚毒素重结晶等等。此外，从河豚卵巢等组织样品提取河豚毒素是一个缓慢的过程，是整个工艺中的限速步骤，需要重复8-20次醋酸提取，同时伴有河豚毒素的大量损失和失活。
专利CN1470514A、CN101391999A、CN102584843A、CN101367821A以及CN102584843A都公开了使用高效液相进行河豚毒素的提取和纯化，但本领域的研究依然进展缓慢。河豚毒素不溶于绝大多数有机溶剂，在强酸性和强碱性条件下的水相中非常不稳定，即使是在弱酸性条件下LC-MS或LC-MS/MS分析表明，河豚毒素8小时后也失去5-30％活性。这些特点让河豚毒素纯化精制充满技术挑战。
综上所述，本领域急需寻找一种方法以应用于从河豚鱼组织中提取和初步纯化河豚毒素粗品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取和初步纯化河豚毒素的方法，其可应用于包括从河豚鱼组织中高产率提取河豚毒素粗品。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的目的在于提供一种从河豚鱼内脏组织中提取粗品河豚毒素的方法，其通过使用本发明的连续流动色谱工艺来完成，包括匀浆、透析、反相层析吸附除去杂质、弱阳离子交换浓缩纯化和冻干。
具体地，所述从河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素方法的步骤为：
(1)匀浆：将河豚鱼内脏组织进行匀浆，制得匀浆液；
(2)透析：将所述匀浆液放入透析袋中使用醋酸水溶液浸提，反复浸提，制得透析液；
(3)反向+弱阴离子液相色谱分离：使用反向+弱阴离子交换双层柱层析液相色谱法吸附除去杂质，收集包含所有河豚毒素及其类似物的第一洗脱液；
(4)弱阳离子色谱柱提取：将所述第一洗脱液通过弱阳离子交换色谱柱，河豚毒素保留浓缩到弱阳离子色谱柱上，使用流动相醋酸溶液洗脱，制得第二洗脱液；
(5)冻干：将所述第二洗脱液冷冻干燥，制得粗品河豚毒素干粉。
所述河豚鱼内脏组织为卵巢、血液和/或任何河豚毒素富集的组织，优选卵巢。所述匀浆使用Polytron、Robot Coupe、Tissumizer、Tissue Tearor或Powergen匀浆仪，优选Polytron或Robot Coupe匀浆仪，所述匀浆仪依靠声音或旋转刀板的机械力破开细胞组织，将坚硬组织(包括优选卵巢、肌肉)转化为匀浆液，使河豚毒素在从细胞中释放，以游离的形式存在于所述匀浆液中以便透析提取。
所述透析使用浓度为0.1％-1％的醋酸溶液，例如0.1％、0.4％、0.6％、0.8％和1％，透析袋内外使用浓度相同的的醋酸水溶液，反复透析直至使用LC-MS/MS检测到最后醋酸透析液河豚毒素浓度低于0.1μg/L，原料中河豚毒素含量和实际重复醋酸透析次数由LC-MS/MS分析来准确。所述反复浸提的次数可为8-20次，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。重复浸提透析确保完整提取和回收河豚毒素。
中规模或工业规模生产时使用陶瓷膜专业生产设备或横向流纳滤膜仪器替换透析袋。匀浆液使用醋酸溶液浸泡后500g离心力下离心3分钟，上清液放入陶瓷膜专业生产设备中进行透析，沉积物重复使用1％醋酸浸泡离心，直到LC-MS/MS分析表明醋酸上清液河豚毒素浓度低于0.1μg/L。
LC-MS/MS检测表明透析袋外部河豚毒素醋酸水溶液在4℃存储8小时后失去20-30％的活性，所以透析获得的河豚毒素透析液需要立即作进一步处理。
所述透析液立即通过反向+弱阴离子交换双层柱层析液相色谱法除去疏水性杂质,酸性杂质和色素:利用C18+弱阴离子交换双层柱层析液相色谱法保留除去疏水性杂质、酸性杂质和色素。疏水性杂质、酸性杂质和色素可保留吸附在C18+弱阴离子交换双层层析柱上，而河豚毒素是碱性化合物,亲水性强故不保留,收集制得包含所有河豚毒素及其类似物的第一洗脱液。通过此步骤，可除去大量杂质，并得到含有河豚毒素且杂质量大大减少的第一洗脱液。
具体地，所述步骤3)的操作可为：50升河豚毒素醋酸透析液使用平流泵用100mL/min的流速流过反向C18+弱阴离子交换(200克/200克/50mm口径)低压双层层析柱(flash cartridge)。疏水性杂质、酸性杂质和色素保留吸附在C18+弱阴离子交换双层层析柱上，河豚毒素不保留，进一步使用5升1％醋酸洗涤，收集得包含所有河豚毒素及其类似物的55升第一洗脱液。
经反向C18+弱阴离子交换双层柱层析液相色谱法进行分离后，进行弱阳离子色谱柱提取制备第二洗脱液。所述流动相醋酸溶液为2M醋酸水溶液。
所述透析液经C18+WAX混合床除去大量杂质后，所得的第一洗脱液立即穿过本发明的弱阳离子交换色谱柱，河豚毒素及其类似物保留在色谱柱上，然后使用2M醋酸洗脱。河豚毒素及其类似物被浓缩50-1000倍。
所述C18+WAX混合床和弱阳离子交换色谱柱可重复再生使用半年甚至更长的时间，且所述C18+WAX混合床和弱阳离子交换色谱柱可以用作连续色谱流的模式，24小时连续自动操作。大规模生产时可以采用连续流动色谱模式或膨胀床吸附模式。
所述从河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法中各个步骤都使用LC-MS/MS检测河豚毒素的浓度，这保证各个步骤的提取和回收完整，避免了活性损失，河豚毒素产量是现有专利和文献产量的10倍至100倍。
由此可见，本发明提供的从河豚鱼内脏组织中提取粗品河豚毒素的方法，避免使用加热、活性炭吸附、重结晶等许多让河豚毒素大量损失、降解和/或失活的工艺，使用匀浆、透析、反相+弱阴离子交换色谱柱吸附杂质、弱阳离子交换色谱柱吸附目标化合物，实现高回收率的河豚毒素提取，并使用LC-MS或LC-MS/MS检测各个步骤中河豚毒素的浓度，跟踪河豚毒素，确保无损失、无目标毒素丢弃、无有毒废弃物对环境的污染，并可实现工艺连续化和半自动化。最后使用冷冻干燥技术，获得纯度为80％以上的河豚毒素干粉粗品。
在一个优选的实施方案中，使用高效液相色谱检测所提取的河豚毒素粗品的质量，从该粗品的高效液相色谱图可知，使用本发明的提取方法制备的河豚毒素粗品纯度为88.7％。
本发明所用的弱阳离子交换色谱柱为通过Schiff碱反应将谷氨酸和/或聚谷氨酸键合至醛基色谱硅胶制得的色谱柱，其中所述聚谷氨酸的聚合度为2-10；所述醛基色谱硅胶是以醛基为键合官能团，平均颗粒直径为20-75μm的球形低压或中压色谱硅胶。所述低压指压力为0-10bar，中压是指10-50bar。
本发明的弱阳离子交换色谱的制备方法可使用领域内公开的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成聚谷氨酸：此制备方法无特殊限制，可通过已公开的方法进行，如文献J.Amer.Chem.Soc.80,3361etssq.,1958所报道的制备方法；
(2)合成醛基色谱硅胶：此步骤将领域内已知的色谱硅胶骨架改性成醛基色谱硅胶，可通过已公开的方法实现；
(3)键合反应：通过Schiff碱反应将谷氨酸和/或聚谷氨酸键合至醛基色谱硅胶，制得弱阳离子交换色谱柱。
为了确保谷氨酸或聚谷氨酸可高密度化学键合到平均颗粒直径为20-75μm的低压或中压色谱硅胶上，聚谷氨酸的聚合度小于10。
所述色谱填料还包括核-壳硅胶、球形刚性聚合物。
在一个优选的实施方案中，所述色谱硅胶骨架为球形B型硅胶，其特征参数为：平均颗粒直径20μm；孔径表面积480-530m2/g；pH6-7；孔体积0.8mL/g；SiO2纯度>99.95；重金属含量<10ppm。所述色谱硅胶骨架改性的一个实施方案为使用高碘酸钠将平均颗粒直径为20-75μm的低压或中压二醇色谱硅键合相氧化，以产生醛基色谱硅胶键合相。
本发明所述的弱阳离子交换色谱柱具有高离子交换容量，用于提取和纯化河豚毒素及其类似物，取得了较高的TTX回收率。
优选地，中规模或工业规模生产时C18+WAX混合床低压色谱柱及弱阳离子交换低压色谱柱经过优化作为连续流色谱模式。
优选地，大规模生产时使用连续流动色谱模式或膨胀床吸附模式代替所述弱阳离子交换色谱柱。
本发明的目的还在于提供所述方法在提取和初步纯化河豚毒素中的应用。
综上所述，本发明的弱阳离子交换色谱、从河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法和纯化河豚毒素的方法明显优于领域内已知技术，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的从河豚鱼内脏组织中提取粗品河豚毒素的方法，避免使用加热、活性炭吸附、重结晶等许多让河豚毒素大量损失、降解和/或失活的工艺，使用匀浆、透析、反相色谱柱吸附杂质、弱阳离子交换色谱柱吸附目标化合物，实现高回收率的河豚毒素提取，并使用LC-MS或LC-MS/MS检测各个步骤中河豚毒素的浓度，跟踪河豚毒素，确保无毒性产物的抛弃、无有毒废弃物对环境的污染，并可实现工艺连续化和半自动化。最后使用冷冻干燥技术，获得纯度为80％以上的粗品河豚毒素干粉。
(2)使用本发明的工艺,尤其是连续流色谱和特别的弱阳离子交换材料,可以一次性处理10kg河豚鱼的卵巢,获得10-20克80％-90％纯度河豚毒素干粉。
(3)本发明提供的方法融合多种工艺，在保存河豚毒素活性的情况下可实现90％以上的回收率，而现有专利的回收率不超过10％，还伴随严重的活性损失。因而本发明在提取和纯化河豚毒素中取得了显著进步。河豚毒素产量是现有专利和文献产量的10倍至100倍。
附图说明
图1为本发明提取的粗品河豚毒素干粉的高效液相色谱图。
图2为河豚毒素的的LC-MS/MS图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：键合谷氨酸和/或聚谷氨酸的弱阳离子交换色谱柱的制备方法
本发明的弱阳离子交换色谱柱的制备方法可使用领域内公开的制备方法，其中一种制备方法为：
(1)依据文献J.Amer.Chem.Soc.,80,3361etssq.,1958合成聚合度为8的聚谷氨酸；
(2)选用球形B型二醇硅胶作为色谱硅胶骨架，用高碘酸钠处理所述骨架，制备20μm的醛基色谱硅胶。所述B型二醇硅胶的参数示于表1；
(3)将所述聚合度为8的聚谷氨酸通过Schiff碱反应键合到上述醛基色谱骨架，制得本发明所述的弱阳离子交换色谱柱。
表1球形B型硅胶的技术参数
实施例2：从10g河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法
(1)匀浆：精确称取取10g河豚鱼的卵巢为原料，使用Polytron，在高转速下匀浆；
(2)透析：使用1％醋酸浸泡所得匀浆液，放入透析袋中，用4倍1％醋酸在4℃冰柜中搅拌透析，每2小时更换新1％醋酸透析液，重复醋酸透析20次，此时使用LC-MS/MS检测到最后醋酸透析液河豚毒素浓度低于0.1μg/L(分析)；
(3)反向C18+弱阴离子液相色谱分离：使用C18+WAX混合床C18+弱阴离子交换双层层析柱吸附除去杂质，收集包含所有河豚毒素及其类似物的第一洗脱液；
(4)弱阳离子色谱柱提取：将所述第一洗脱液通过本发明的弱阳离子色谱柱，使用2M醋酸溶液洗脱，制得第二洗脱液；
(5)冻干：将所述第二洗脱液冷冻干燥，制得粗品河豚毒素干粉。
LC-MS/MS检测表明本实施例回收率超过95％，从10克野生河豚鱼卵巢中获得17.4mg河豚毒素，纯度85.6％。
实施例3：从1kg河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法
1kg野生河豚鱼卵巢和干冰混合，使用Robot Coupe匀浆。在-20℃冰柜中干冰升华后部分或全部使用10升1％醋酸浸泡，使用陶瓷膜设备重复透析萃取需要16次。透析获得的河豚毒素醋酸水溶液流过一根C18+WAX混合床，然后再流过本发明的弱阳离子交换色谱柱。河豚毒素及其类似物保留在第二根色谱柱上，使用500毫升2M醋酸洗脱。然后冷冻干燥获得1.54g、纯度为87％的河豚毒素干粉。
实施例4：从10kg河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法
10公斤野生河豚鱼卵巢和干冰混合，使用Robot Coupe匀浆。在-20℃冰柜中干冰升华后部分或全部使用20-100L浓度1％醋酸浸泡，使用陶瓷膜设备重复透析20次。透析获得的河豚毒素醋酸水溶液流过一根C18+WAX混合床，然后再流过本发明的弱阳离子交换色谱柱。河豚毒素及其类似物保留在第二根色谱柱上，使用2L浓度2M醋酸的洗脱。使用C18+WAX混合床和弱阳离子交换色谱柱连续色谱流的模式，24小时连续自动操作。然后冷冻干燥获得13.2g纯度82％的河豚毒素干粉。
实施例5：粗品河豚毒素干粉的纯度检测
使用高效液相来分析制得的粗品河豚毒素干粉，其色谱条件为
色谱柱：Chrom-Matrix InnovationTM TTX HPLC column5um25cmx4.6mm
流动相：10mM醋酸铵(pH＝4)：甲醇＝98；2
流速:1000μL/min
进样量:10μL
检测波长：201nm
测量结果见图1，河豚毒素峰在10.8分钟，峰对称性1.0。7.2分钟、11.4分钟、12.8分钟和13.5分钟是河豚毒素四类似物(analogues)。3.8峰是冷冻干燥时的添加剂。河豚毒素的纯度为88.7％。
实施例6：LC-MS/MS检测
本发明从河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法中各个步骤都使用从河豚鱼内脏组织中提取河豚毒素的方法检测河豚毒素的含量，以确保回收率。其检测条件为：
色谱柱:InnovationTM HP Amide5μm10cm×4.6mm；
流动相A:乙腈(0.1％甲酸)；流动相B:水(0.1％甲酸)；流速:750μL/min进样量:10μL；
梯度洗脱条件参数：0min→0.2min20％A+80％B
0.2min→4min线性梯度到100％B；
4min→4.2min线性梯度到20％A+80％B
4.2min→5min20％A+80％B
仪器：Perkin-Elmer200series HPLC
ABI API4000tandem mass spectrometer
Leap Technologies Autosampler
TTX MRM transition:320→162(ESI positive)；
河豚毒素的的LC-MS/MS图示于图2。
本发明提供的从河豚鱼内脏组织中提取粗品河豚毒素的方法，避免使用加热、活性炭吸附、重结晶等许多让河豚毒素大量损失、降解和/或失活的工艺，使用匀浆、透析、反相色谱柱吸附杂质、弱阳离子交换色谱柱吸附目标化合物，实现高回收率的河豚毒素提取,并使用LC-MS或LC-MS/MS检测各个步骤中河豚毒素的浓度，跟踪河豚毒素，确保无损失、无目标毒素的抛弃、无有毒废弃物对环境的污染，并可实现工艺连续化和半自动化。最后使用冷冻干燥技术，获得纯度为80％以上的粗品河豚毒素干粉，且回收率为现有技术的10-100倍。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (15)

1.一种从河豚鱼内脏组织中提取并初步纯化河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)匀浆：将河豚鱼内脏组织进行匀浆，制得匀浆液；
(2)透析：将所述匀浆液放入透析袋中，使用醋酸水溶液反复浸提，制得透析液；
(3)反向+弱阴离子液相色谱分离：使用反向+弱阴离子交换双层柱层析液相色谱法吸附除去杂质，收集包含所有河豚毒素及其类似物的第一洗脱液；
(4)弱阳离子色谱柱提取：将所述第一洗脱液通过弱阳离子交换色谱柱，河豚毒素保留浓缩到弱阳离子色谱柱上，使用流动相醋酸溶液洗脱，制得第二洗脱液；
(5)冻干：将所述第二洗脱液冷冻干燥，制得河豚毒素干粉粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的河豚鱼内脏组织为卵巢和/或血液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述匀浆使用Polytron、Robot Coupe、Tissumizer、Tissue Tearor或Powergen匀浆仪。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述匀浆使用Polytron或Robot Coupe匀浆仪。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所述的透析使用浓度为0.1％-1％的醋酸水溶液，透析袋内外使用浓度相同的醋酸水溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反复浸提的次数为8-20次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，中规模或工业规模生产时使用陶瓷膜专业生产设备或横向流纳滤膜仪器替换透析袋。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)调节所述透析液的pH值至4-5。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)所述的流动相醋酸溶液为2M醋酸水溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中各个步骤都使用LC-MS/MS检测河豚毒素的浓度以确保无河豚毒素的损失和抛弃。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱阳离子交换色谱柱为通过Schiff碱反应将谷氨酸和/或聚谷氨酸键合至醛基色谱硅胶而制得的色谱柱。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，中规模或工业规模生产时C18+WAX混合床低压色谱柱及弱阳离子交换低压色谱柱经过优化作为连续流色谱模式。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，大规模生产时使用连续流动色谱模式或膨胀床吸附模式代替所述弱阳离子交换色谱柱。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述聚谷氨酸的聚合度为2-10；所述醛基色谱硅胶是以醛基为键合官能团，平均颗粒直径为20-75μm的球形低压或中压色谱硅胶。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法在提取或初步纯化河豚毒素中的应用。
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