CN1206236C - 刺五加总皂苷提取物及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明总地涉及天然植物总皂苷提取物。特别是涉及天然药用植物刺五加叶总皂苷提取物、其制备方法、含有所说的总皂苷提取物的药物组合物，以及所说的药物组合物在治疗/预防心脑血管性疾病和生产治疗/预防心脑血管性疾病的药物中应用。

Description

刺五加总皂苷提取物及其药物组合物

本发明总地涉及天然植物总皂苷提取物，特别是涉及天然药用植物刺五加叶总皂苷提取物、其制备方法、含有所说的总皂苷提取物的药物组合物，以及所说的药物组合物在治疗/预防心脑血管性疾病和生产治疗/预防心脑血管性疾病的药物中应用。

刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms)是五加科人参属药用植物刺五加的根和根茎，主要分布在中国的东北和华北地区，其次是俄罗斯的远东地区，以及朝鲜半岛和日本。在古代中国的传统医药学中，人们很早就发现刺五加是一种具有“补中益气、坚筋骨、强志意”的有价值天然药物。随着现代化学、生理学和药理学在中医药学领域里的应用和研究进展，近三十多年来，人们对刺五加的化学结构进行了较为深入的研究。现已发现，刺五加的主要化学成分是三萜皂苷，特别是齐墩果酸皂苷。例如，Suprunov(Suprunov，NI：Chemical Abstract 73：127741e，1970)首先从刺五加叶中分离得到了六种单体皂苷，并分别鉴定为齐墩果酸皂苷A、B、C、D、E和F。继后，Frolova等人(Frolova，GM.et al.，Chemical Abstract 76：70053n，1972；Frolova，GM.et al.，Chemical Abstract 76：59965r，1972)又进一步分离得到了齐墩果皂苷I、K、L和M等四种单体。在这些研究的基础上，邵春杰等(Shao，C.J.et al.，Chem.Pham.Bull.，36(2)：601，1988)首次从刺五加叶中分离得到十三种新的三萜皂苷，并分别命名为刺五加皂苷(Ciwujianoside)A₁、A₂、A₃、A₄、B、C₁、C₂、C₃、C₄、D₁、D₂、D₃及E。邵春杰等人的研究证实，这些三萜皂苷的配基(甙元)均属于齐墩果烷型化合物，其中包括齐墩果酸皂苷元、羟甲齐墩果酸皂苷元，和去甲齐墩果酸皂苷元。糖基包括葡萄糖、鼠李糖及阿拉伯糖，并分别通过糖苷键和酯苷键连接到配基的C₃羟基和C₂₈羧基上。另外，作者还从同一原料中得到三种已知的皂苷：Hederasaponin B、Eleutheroside K，和微量的Seponin-1。

生理学、药理学和临床药理学研究进一步证实，刺五加确实是一种典型的固本强壮类药物，具有显著的扶正固本和镇静安神作用。现代生理学和药理学研究表明，刺五加提取物对循环和心脑血管系统具有突出的生物学活性，主要表现为(1)改善动物的耐缺氧能力和抗应变能力(参见吴秉纯等，中成药研究，增刊(2)，1984和Golotin，V.G.，et al.，Chemical Abstract 110：128610f，1989)；(2)增加离体动物的冠脉血流量(参见田葆杰等，中国中药杂志，14(8)：493，1989和马丽娜等，中国药学杂志，29(11)：654，1994)；以及(3)减少(小)血小板聚集和血液粘滞度(参见杨秋生等，首都医学院学报，12(3)：171，1991和刘玉兰等，沈阳药学院学报，6(1)：57，1989)。目前为止，已有许多关于使用刺五加根为原料，单独或配合其他天然药物成分，制成临床上普遍适用的保健饮料和辅助治疗剂的报道(参见中国专利92109660.7、93100533.7、94109342.5、9612145.6、99126793.1和00108022.9)。这些现有技术的主要缺陷在于：(1)大规模开发和利用刺五加根将造成自然资源的严重破坏；(2)只利用简单的水提取物将不利于对有效部位或成分的深入分析与研究。

作为本发明密切相关的现有技术，宋士岳的已授专利94107718.7号公开了以刺五加根、茎或叶为原料，制备适于静脉内给药的水和醇提取物的方法。该方法包括用终浓度75％的乙醇提取浓缩的水提物后，再使用大孔树脂脱色。可见，该专利描述的方法只是最简单的常规方法，而且产物(主要是黄酮类化合物)的纯度难以保证。

本发明的一个目的是提供生产刺五加总皂苷提取物的方法，该方法包括首先用CaO将刺五加的水煎煮液制成石灰乳；然后在中性pH条件下使所说的石灰乳通过大孔吸附树脂柱吸附并用乙醇洗脱；最后再使所得到的洗脱物通过弱酸型离子交换树脂并进行常规脱色。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的石灰乳的pH约为10-12。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的刺五加是刺五加植物的叶和/或茎。

根据本发明这一目的的另一个优选实施方案，其中所说的刺五加是刺五加植物的叶。

根据本发明这一目的的再一个优选实施方案，其中用于洗脱的乙醇浓度约为70-95％(V/V)。

根据本发明这一目的的再一个优选实施方案，其中所说的常规脱色方法包括使用弱碱型阴离子树脂脱色和/或活性炭脱色。

根据本发明这一目的的再一个优选实施方案，其中所说的刺五加总皂苷提取物的产率为1-3％(W/W)。

本发明的另一个目的是提供按如上限定的方法制备刺五加总皂苷提取物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的刺五加总皂苷提取物的纯度为80％(W/W)以上。

本发明的再一个目的是提供含有如上限定的刺五加总皂苷提取物的药物组合物，其中所说的药物组合物除含有作为基本活性成分的治疗有效量的刺五加总皂苷提取物外，还含有一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的药物组合物被制成适于胃肠道途径给药的各种剂型。

根据本发明这一目的的另一个优选实施方案，其中所说的药物组合物被制成适于胃肠道外途径给药的各种剂型。

根据本发明这一目的的再一个优选实施方案，其中所说的药物组合物除含有作为基本活性成分的刺五加皂苷提取物外，还可含有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并与所说的基本活性成分有辅助或协同作用但又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物。

本发明总地涉及天然植物总皂苷提取物，特别是涉及天然药用植物刺五加叶总皂苷提取物、其制备方法、含有所说的总皂苷提取物的药物组合物，以及所说的药物组合物在治疗/预防心脑血管性疾病和生产治疗/预防心脑血管性疾病的药物中应用。

本发明的一个目的是提供生产刺五加总皂苷提取物的方法，该方法包括：首先在中性条件下使刺五加的水煎煮液通过大孔吸附树脂柱吸附，并用乙醇洗脱；然后再使洗脱物通过弱酸型离子交换树脂，并进行常规脱色。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中用石灰乳将所说的水提取物滤液的pH调到大约10-12。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的刺五加是刺五加植物的叶或茎。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的刺五加是刺五加植物的叶。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中用于洗脱的乙醇浓度约为70-95％(V/V)。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的常规脱色方法包括使用弱碱型阴离子树脂脱色和/或活性炭脱色。

众所周知，刺五加是中国传统医药学中已知的可药用植物，并已于1977年收入《中华人民共和国药典》。已知刺五加植物的根主要含有刺五加苷A-E、酸或酯类化合物以及很少量刺五加多糖；茎皮主要含有丁香酚-β-D-葡糖苷等葡萄糖或半乳糖苷类化合物；叶则主要含有刺五加苷I-M，以及前述的十三种刺五加叶苷。因此，当选择使用刺五加植物的不同解剖部位或组织作为原料以制备生物学活性组份或单体成分时，即使使有同样的方法，也可能因所使用的原料不同而得到成分和/或比例完全不同的化合物或组分。当然，所使用的提取方法不同，例如使用不同的试剂和/或步骤，也必将得到不同的活性组份(即所谓“活性部位”)或成分。

一般所来，相对于刺五加根，刺五加叶和茎中均含有较高比例的皂苷类化合物，例如刺五加根中总皂苷含量(干重)为0.6-0.9％(w/w)。而茎叶中总皂苷含量(干重)甚至可高达1.5％(W/W)(Chemical Abstract，72：19118r，1970)。因此，为本发明的目的，我们优选的原料是刺五加叶和茎，而且特别优选的原料是刺五加叶。

简单地说，为了得到所需的刺五加总皂苷，首先在装有经过预处理的刺五加叶的容器内加入体积过量的水，并加热煮沸1-4小时。为了尽可能地增加水提取物的收率，可按照常规制备中草药煎剂的方法，在加热煮沸条件下用过量的水将原料生药反复提取2-4次。然后收集并过滤如此得到的水提取物。

搅拌下用生石灰(CaO)制成石灰乳，将所得滤液(水提取物)制成pH大约10-12，以使其中所含有的黄酮及鞣质以与固体物结合的方式沉淀下来。再次过滤后，用酸将主要含有皂苷成分和糖类物质的滤液的pH调至中性，以利于继后使滤液中的皂苷吸附于大孔吸附树脂柱上。然后用水洗柱以除去滤液中含有的以糖类化合物为主的杂质。水洗至无色后，便可使用一般浓度为70-95％，较好浓度为80-90％(v/v)的乙醇洗脱吸附柱结合的、以皂苷为主的被结合物。对柱洗脱的流速没有具体限制，一般保持洗脱液的自然流速即可。

收集洗出液后，例如可使之首先通过弱酸型阳离子交换树脂柱预处理，然后再使用例如弱碱型阴离子交换树脂柱脱色。经过树脂柱脱色处理的产物可能仍带有浅淡的黄颜色，为了进一步改善产物的纯度和外观，必要时可再次使用活性炭处理，以使通过脱色树脂的洗脱物进一步脱色。经过活性炭脱色后，虽然可使产物的纯度提高到95％，但有时也可能导致产物收率的降低。一般说来，按干重计算，依照本发明方法制得的刺五加总皂苷的产率约为1-3％。同时，使用齐墩果皂苷B作为标准品，以比色法或分光光度法测得的产物纯度为大约85％(仅一次树脂脱色)至大约95％(w/w)(树脂脱色加活性炭脱色)。

本发明的另一个目的是提供按上述方法制备的刺五加总皂苷提取物，特别是刺五加叶总皂苷提取物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的刺五加总皂苷提取物的纯度为80％以上，而且在经过二次(活性炭)脱色后其纯度甚至可达到大约95％(w/w)或更高。

另外，按刺五加原料的干重计算，根据本发明的刺五加总皂苷提取物的收率约为1-3％。

由以上的描述和事实可以看出，本发明的生产刺五加总皂苷提取物的方法和由该方法直接得到的刺五加总皂苷产物所具有的主要优点包括：(1)工艺相对比较简单，而且不需要特殊的或大型的设备；(2)方法中所使用的试剂或材料相对比较便宜，而且均无毒无害；(3)所得到的产品的纯度相对较高，并已达到或超过了中国国家药品监督与管理局《新药审评办法》规定的中药第二类新药的标准。

因此，本发明的生产刺五加总皂苷提取物的方法不仅是一种十分有用的方法，而且是特别适于大规模工业化生产使用的方法。如前所述，本发明方法不仅工艺简便、产品的收率较高，而且基本上不会造成环境污染。

本发明的再一个目的是提供含有如上限定的刺五加总皂苷提取物的药物组合物，其中所说的药物组合物除含有作为基本活性成分的治疗有效量的刺五加总皂苷提取物外，还含有一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。

作为本发明的药物组合物的基本活性成份，刺五加总皂苷和其相关成分，对中枢神经系统、免疫系统，心血管系统以及内分泌和代谢系统均表现有不同程度的生物学活性。但如前所述，其中特别令人感兴趣的是刺五加总皂苷对心血管系统和血小板聚集的影响。

我们利用各种不同的动物模型，对本发明的刺五加总皂苷提取物的药效学进行了广泛的研究(参见实施例3-7)。这些研究的结果包括：

1.对于犬和大鼠急性心肌梗死模型，本发明的刺五加总皂苷提取物(15、30mg/kg)能明显地减轻实验动物的心肌缺血(或心肌梗死)程度和范围，并明显地降低血清天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)活性；降低血小板粘附性及聚集性；明显降低全血低切、高切粘度及血浆粘度。另外，对于大鼠垂体后叶素诱发的急性心肌缺血模型，不同剂量(25、50、100mg/kg)的本发明刺五加总皂苷提取物可明显地减轻缺血性心电图改变，并由此证明其具有抗急性心肌缺血活性。

2.在急性心肌梗死犬心功能及血流动力学试验中，可见本发明的刺五加总皂苷提取物(15、30mg/kg)能够明显地减慢心率(HR)，降低左心室内压(LVP)、平均动脉压(MAP)及总外周阻力(TPR)，表明该提取物能够减轻心脏前、后负荷，减少心脏作功和心肌氧耗。另外，该提取物还可使心室舒张期延长，增加冠脉灌注时间，从而有利于缩小心肌梗死面积。

3.在急性心肌梗死犬冠状循环及氧代谢试验中，本发明的刺五加总皂苷提取物(15、30mg/kg)可明显地增加梗死后心肌血流量，降低冠脉血管阻力，并且两者作用时程基本一致。该提取物(40、80、160mg/kg)亦能明显地提高小鼠心肌⁸⁶Rb摄取率，增加心肌营养性血流量。另外，本发明的刺五加总皂苷提取物(15、30mg/kg)还可明显地降低心肌氧摄取率、心肌耗氧量及心肌耗氧指数。

4.在抗心律失常试验中，本发明的刺五加总皂苷提取物(50、100mg/kg)对BaCl₂所致的大鼠心律失常具有明显的预防及治疗作用，并能显著地提高豚鼠对哇巴因中毒诱发的室性早搏、室性心动过速和心室纤颤的耐受量。

5.在大鼠高脂血症模型中，本发明的刺五加总皂苷提取物(25、50、100mg/kg)可明显地增加血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)，降低血清总胆固醇降低(TC)、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c的比例。

可按照制药工业中已知的方法(参见Remington’s Pharmaceutical Science.15thed.，Mack Publishing Company，1980)，将含刺五加皂苷和其相关化合物的提取物与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，并按已知方法除菌后制成本发明的各种不同剂型的药物组合物。

例如，根据给药途径的不同，可将本发明的药物组合物配制成适于静脉内、肌肉内、体腔内(如胸腔、腹腔、脊髓腔、颅内及关节囊内)、组织内、皮内或皮下给药的可注射的溶液剂或分散剂；或适于口服给药的粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、悬浮剂、胶囊剂、酊剂；或适于局部给药和通过皮肤或粘膜吸收给药的喷雾剂、霜剂、乳剂、软膏剂、凝胶剂、含片或栓剂等。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的药物组合物可被制成适于胃肠道外途径给药的各种剂型。

为了制备适于胃肠道外途径给药的可注射溶液剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠或葡萄糖溶液，或低浓度(如1-100mmol)磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。必要时，可加入抗氧化剂(如抗坏血酸)、抗生素(如青霉素和链霉素或其它抗真菌剂)及防腐剂(如苯甲酸钠、三氯叔丁醇、度米酚、山梨酸等)，以及增溶剂和用于维持分散剂中所需颗粒大小的表面活性剂。

根据本发明这一目的的另一个优选实施方案，其中所说的药物组合物可被制成适于胃肠道途径给药的各种剂型。

为了制备适于口服给药的片剂、粉末剂、胶囊剂、颗粒剂或乳剂，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖等糖，或甘露醇、山梨醇等六碳多羟基醇，以及玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素等作为载体或赋形剂。必要时，也可在这些口服制剂中加入崩解剂、润滑剂、缓冲盐、着色剂、甜味剂、香料、分散剂及表面活性剂。

另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。

为了制备适于外用或局部给药的制剂，可以将刺五加总皂苷和其相关化合物溶解于含水介质或其他适当的载体或基质中，并与适当的透皮吸收剂如二甲基亚砜或月桂氮卓酮混合，制成喷雾剂或气雾剂。另外，也可使用适当的基质或赋形剂将本发明的药物组合物制成适于局部或通过皮肤或粘膜吸收给药的乳剂、霜剂、软膏、凝胶剂或栓剂(如阴道栓剂或直肠栓剂)。为此，可使用甘油、硬脂酸镁、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、胆固醇、卵磷脂、甲基纤维素或羧甲基纤维素、滑石粉、乳糖、葡聚糖、淀粉等作为基质或赋形剂。

根据使用目的的不同，本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分的刺五加皂苷和其相关化合物外，还可含有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并与基本活性成分有辅助或协同作用的天然或合成的其他药物成份或其混合物。

根据本发明，所说的其它活性成分包括天然来源的或合成的心脑血管扩张剂、抗肿瘤剂、抗菌剂或抗病毒剂、镇静剂、抗氧化剂、血栓形成抑制剂，以及免疫调节剂等。

一般说来，本发明的药物组合物的口服给药剂量一般为0.1-100mg/kg/天，较好为1-80mg/kg/天，最好为5-50mg/kg/天；腹腔内或肌肉内注射给药剂量一般为0.05-100mg/kg/天，较好为0.1-80m/kg/天，最好为0.5-50mg/kg/天；静脉内注射给药剂量一般为0.01-100mg/kg/天，较好为0.05-80mg/kg/天，最好为0.1-50mg/kg/天。当然，确切的给药剂量应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状态，以及病人对所用药物的敏感性、耐受性和给药方式等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。

鉴于按本发明方法制备的刺五加总皂苷提取物的上述已知药理学活性，因此有可能使用本发明的药物组合物治疗或预防中枢系统兴奋/抑制功能失调、中枢或组织缺血/缺氧、冠脉血管供血不足、心功能不全、血栓形成等疾病或病理状态。另外，还可使用本发明的药物组合物作为抗肿瘤剂、抗炎剂、血脂调节剂等的辅助治疗剂。

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。应明确指出的是，在不违背本发明精神和原则的前提下，对本发明个别非必要技术特征所作的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求的范围内。

实施例1：刺五加叶总皂苷提取物的制备

称取仲秋季节收集的干燥的刺五加叶约1000克，洗净并捣碎后向其中加入约13倍体积的水。浸泡2小时后加热煮沸约2小时。如此在每次换液(浸泡用水)并煮沸后过滤的条件下，反复煎煮4次。同时，收集并合并每次煮沸后的滤液。搅拌下缓慢向所得滤液内加入生石灰制成的石灰乳，以将pH调整到大约11。将滤液放置2小时后，再次过滤并使用约HCl(1mol/L)将此滤液的pH调到大约7.0。

然后将所得滤液上D101大孔吸附树脂柱。充分吸附后，先用去离子水洗柱，直到流出液没有肉眼可见的颜色为止。然后用大约80％(V/V)的乙醇洗脱，并洗至流出液的皂苷反应呈阴性为止。收集洗脱物(液)并过732型弱酸性阳离子交换树脂柱。然后收集流出液并再次过D941型弱碱性阴离子交换树脂柱。最后，收集所得到的流出液，减压浓缩并蒸发干燥，得到大约24.3克白色粉末状的刺五加叶总皂苷提取物。

实施例2：溶液态刺五加叶总皂苷提取物的制备

称取干燥的刺五加叶100kg，置提取罐中，加水煎煮三次。三次煎煮时间依次为2.5、2.0、1.5小时，加水量依次为药材重量的10、8、6倍。煎煮完成后，合并煎煮液并常规过滤。滤液经高位槽缓缓注入预先处理的200kg AB8型大孔吸附树脂柱，并用水洗至流出液几乎无色，然后再用85％(v/v)乙醇洗脱。收集至无色的洗脱液并移入减压浓缩罐中。减压回收乙醇，并将洗脱物浓缩至流浸膏状，使其相对密度达到1.15(20℃)。在搅拌下向其中加入4倍量的95％乙醇，静置24小时以使提出物沉淀析出。过滤后回收乙醇至相对密度达1.05～1.10(20℃)时，喷雾干燥得到粉末状的刺五加总皂苷提出物。

精确称取刺五加叶总皂苷粉末25g，加入注射用水2000ml溶解并将所得溶液调到pH＝6.5～7.5。然后，向其中加入活性碳6g(0.3％，w/v)，并在沸水浴中加热10～15分钟。常规过滤后再将滤液用0.02μ微孔滤膜过滤除菌，制得溶液态刺五加叶总皂苷。

实施例3：本发明的药物组合物对犬急性心肌梗死(AMI)模型的影响

体重12～15kg的健康成年杂种犬30只，随机均分为5组，每组6只：只注射盐水的空白对照组、只注射盐水的心肌梗死组(阴性对照组)、注射已知药物碟脉灵(6ml/kg，相当临床日用量20ml/60kg的11.3倍)的阳性对照组及注射本发明的药物组合物(15、30mg/kg，相当临床日用量100mg/60kg的5.6、11.2倍)的实验组。用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉动物并颈部切开气管插管后，于左第4肋间开胸，分离冠脉左回旋支的钝缘支，LAD第1、2分支及与钝缘支相连的各侧支及吻合支以备结扎，使预定缺血区约相当左室游离壁前表面的1/2。用多点湿布式吸附法标测心外膜电图(EECG)，取24个标测点并分为正常区、梗死边缘区和梗死中心区。术后稳定15分钟，记录各点EECG作为给药前值。除空白盐水组只分离冠脉不结扎外，其它各组均施冠脉结扎。于结扎后5分钟将药液溶于200ml生理盐水中恒速静脉输注90分钟。记录给药30、60、90、120、180、240、300、360分钟后的EECG，以ST段升高总mV数表示∑-ST值，并以ST段升高＞2mV的导联数为N-ST。结扎后360分钟从股动脉取血，以COBAS-FAARA自动生化分析仪测血清天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)活性；以LBY-F5血小板粘附仪计算血小板粘附率；采用LBY-NJ2血小板聚集仪测定3分钟时的最大聚集率；使用LBY-N6A自清洗旋转式粘度计测定全血低切(10/s)、中切(40/s)、高切(120/s)粘度及血浆粘度(120/s)。同时取心脏，去除心房及右室组织后称取左室湿重。平行于房室沟将左室横切4～5片，进行N-BT染色。待梗死心肌界线清楚时立即取出，切取梗死心肌并称重。以梗死心肌与左室湿重的百分比做为心肌梗死面积(MIS)。结果如下列表1-4所示。

(一)对AMI犬心肌缺血程度的影响

从下列表1所示的结果可以看出，给模型动物投用本发明的刺五加皂苷提出物(15mg/kg)后不同时间(90、120、240分钟)，动物的∑-ST值得到明显改善，并且与阴性对照组相比较差异显著(p＜0.05)。较大剂量用药(30mg/kg)后60、90、120、180、240、300分钟，可见模型动物的∑-ST值明显降低，而且与阴性对照组组比较差异显著(p＜0.05或0.01)。

表1  本发明的药物组合物对AMI犬心肌缺血程度的影响(∑-ST，Mv)(x±s，n＝6)

时间        阴性对照组              实验组                阳性对照组

                           (15mg/kg)      (30mg/kg)       (6ml/kg)

药前        5.80±1.31     5.60±2.05     5.50±1.28      5.90±1.47

药后

30min       20.15±0.78    19.20±1.81    18.75±2.37     19.26±2.58

60min       18.49±0.91    17.50±1.92    16.89±1.45^*   16.91±2.12

90min       16.57±2.03    14.21±1.30^*  13.67±2.30^*   14.17±1.28^*

120min      14.60±1.14    13.07±1.18^*  11.75±1.48^**  12.24±2.25^*

180min      14.31±3.08    11.81±2.60    10.61±1.06^*   11.11±1.20^*

240min      13.54±1.37    10.94±1.40^*  10.31±1.70^**  10.50±1.52^**

300min      11.80±1.76    10.82±2.48    9.78±1.16^*    9.98±0.96^*

360min      11.50±2.54    10.40±1.52    9.56±2.14      9.70±1.48

与阴性对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

(二)对AMI犬心肌缺血范围(N-ST)的影响

从下列表2所示的结果可以看出，给模型动物投用本发明的刺五加皂苷提出物(15mg/kg)不同时间(120、180、240、300分钟)后，明显降低了动物的心肌缺血程度，并且与阴性对照组比较差异显著(p＜0.05)。给药30mg/kg后60、90、120、180、240、300分钟，可见动物的心肌缺血范围明显减小，并且与阴性对照组比较差异非常显著(p＜0.05或0.01)。

表2  本发明的药物组合物对AMI犬心肌缺血范围的影响(N-ST，点)(x±s，n＝6)

时间       阴性对照组               实验组              阳性对照组

                          (15mg/kg)      (30mg/kg)      (6ml/kg)

药前       15.80±4.38    15.90±2.85    15.50±4.21    15.70±3.17

药后

30min      110.2±19.2    105.80±18.6   98.75±16.5    101.21±15.4

60min      108.9±16.1    96.50±11.9    85.80±14.5^*  89.91±12.2^*

90min      99.78±12.3    92.51±17.3    66.82±19.8^** 78.67±16.8^*

120min     94.60±17.4    72.15±16.6^*  58.95±124^**  64.67±11.5^**

180min     85.38±13.8    68.21±12.6^*  55.98±19.6^*  61.61±14.2^*

240min     71.54±16.3    52.98±10.4^*  44.33±11.7^** 50.50±13.2^*

300min     63.82±11.6    43.85±14.8^*  39.78±16.6^*  41.98±15.1^*

360min     48.59±14.5    38.40±11.5    34.56±10.4     39.70±16.8

与阴性对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01。

(三)对AMI犬心肌梗死面积(MIS)及三种心肌酶(AST、CK、LDH)的影响

从下列表3所示的结果可以看出：阴性对照组与空白对照组比较，MIS及血清AST、CK、LDH活性均明显增加(P＜0.01或0.001)。实验组(15、30mg/kg)与阴性对照组比较，可见实验动物的急性心肌梗死面积(MIS)明显缩小(P＜0.01或0.001)，并且血清AST、CK及LDH活性明显降低(P＜0.05或0.01)。这些结果表明本发明的刺五加皂苷提出物具有显著的抗心肌缺血作用。

        表3  本发明的药物组合物对AMI犬的抗心肌缺血作用(x±S，n＝6)

组别            MIS(％)      AST(U/L)         CK(U/L)          LDH(U/L)

空白对照组      -            43.8±12.5      579.2±142.5      396.0±101.5

阴性对照组      18.2±3.5    165.5±74.2^##  1411.0±353.7^### 998.6±249.3^###

实验组

15mg/kg         10.6±2.5**  76.5±21.2*     887.2±244.8*     610.5±201.4*

30mg/kg         9.1±2.5***  71.9±28.8*     794.6±229.4**    586.5±158.4**

阳性对照组

6ml/kg          10.4±2.7**  79.2±18.9*     812.3±185.0**    582.9±171.2**

与空白对照组比较##P＜0.01  ###P＜0.001

与阴性对照组比较*p＜0.05  **p＜0.01  ***p＜0.001

(四)、对AMI犬血小板粘附性和聚集性的影响

1.在前述方法中，于结扎冠状血管后360分钟从模型动物的股动脉采血1ml，用3.8％枸橼酸钠按1∶9比例抗凝处理后，取10ml加入1ml血小板稀释液中。摇振混匀，滴入细胞计数板，静置10分钟，在光学显微镜下计数血小板数。剩余血加入LBY-F5血小板粘附仪球中，转动15分钟后，在光镜下计数粘附后的血小板数，并计算血小板粘附率。

结果表明，阴性对照组的血小板粘附性明显提高，与空白对照组比较差异显著(P＜0.01)，而注射本发明的刺五加皂苷提出物(15、30mg/kg)的实验组动物则明显地降低了血小板粘附性(P＜0.05或P＜0.01)(见表4)。

2.在前述方法中，于结扎冠状血管后360分钟从模型动物的股动脉采血3ml，按1∶9比例用3.8％枸橼酸钠抗凝混匀，以180转/分离心5分钟。然后取上清作为富血小板血浆(PRP)，放入0.5ml道夫管中，置恒温孔中备用。剩余的抗凝血以300转/min离心10分钟，将所得上清作为贫血小板血浆(PPP)。取PPP和PRP各200μl，采用LBY-NJ2血小板聚集仪测定3分钟时的最大聚集率。

结果表明，阴性对照组的血小板聚集性明显提高，与空白对照组比较差异显著(P＜0.05)，而注射本发明的刺五加皂苷提出物(15、30mg/kg)的实验组动物则明显地降低了血小板聚集和粘附能力(P＜0.05或P＜0.01)(见表4)。

表4  本发明的药物组合物对AMI犬血小板粘附性及聚集性的影响(x±s)

组别          动物数    血小板粘附率(％)      3min最大聚集率(％)

空白对照组    6         0.113±0.049          59.58±21.60

阴性对照组    6         0.226±0.059^##       99.98±28.52^#

实验组

15mg/kg       6         0.150±0.061*         66.42±20.13*

30mg/kg       6         0.121±0.060**        60.54±22.65*

阳性对照组

6ml/kg        6         0.124±0.057**        62.78±25.20*

与空白对照组比较#P＜0.05  ##P＜0.01

与阴性对照组比较*p＜0.05  **p＜0.01

(五)、对AMI犬全血及血浆粘度的影响

在前述方法中，于结扎冠状血管后360分钟从模型动物的股动脉采血3ml，加1％肝素抗凝，从中取1ml加入LBY-N6A自清洗旋转式粘度计内测定全血低切(10/s)、中切(40/s)、高切(120/s)粘度，剩余2ml血以3000转/min离心10分钟，取上层血浆测血浆粘度(120/s)。

结果表明，阴性对照组全血低切、高切粘度及血浆粘度均明显提高，与空白对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)，但全血中切粘度无明显改变。而注射本发明的刺五加皂苷提出物(15、30mg/kg)的实验组动物则明显地降低了全血低切、高切粘度及血浆粘度(P＜0.05或P＜0.01)。对中切粘度虽有降低作用，但与阴性对照组比较无明显差异(P＞0.05)。结果如下列表5所示。

表5  本发明的药物组合物对AMI犬全血及血浆粘度的影响(n＝6，x±s)

                           全血粘度

组别                                                  血浆粘度

            10/s           40/s         120/s         (120/s)

空白对照组  10.15±2.85    6.05±1.62   4.73±1.25    1.50±0.65

阴性对照组  18.75±5.52^## 6.95±2.12   6.96±2.08^#  2.59±0.82^#

实验组

15mg/kg     11.82±3.24*   5.57±2.46   4.82±1.09*   1.62±0.58*

30mg/kg     10.29±3.45**  5.12±2.32   4.38±1.16*   1.28±0.44**

阳性对照组

6ml/kg      10.85±4.67*   4.71±1.60*  4.06±0.56**  1.19±0.49**

与空白对照组比较#P＜0.05  ##P＜0.01

与阴性对照组比较*p＜0.05  **p＜0.01

实施例4：本发明的药物组合物对AMI犬血流动力学及心肌氧代谢的影响

本实验是在实施例3所述实验的基础上，同时对模型动物进行右颈总动脉插管，经压力换能器接AP-621G载波放大器记录动脉血压(SBP、DBP)。分离右侧股动脉，切开插入8#心导管至左室腔内，连压力换能器接AP-621G载波放大器，记录左室内压(LVP)(定标敏度为100mmHg/10mm)。将LVP电信号放大10倍，描记曲线基部，于曲线缓慢微升转变为急剧上升的转折点读取左室舒张期末压(LVEDP)。同时，将LVP电信号输入微分器，描记左室内压变化最大速率(±dp/dtmax)。其中微分器时间常数为1ms，高频滤波50Hz，定标敏度为零线±1000mmHg/s/5mm。分离冠状动脉左旋支及主动脉根部，放置适当内径的电磁流量计探头后，接MF-27型电磁流量计测定冠脉血流量及主动脉流量。四肢连接肢体导联，测定标准II导心电图(ECG)并计算心率(HR)。将上述各指标于给药前及给药后30、60、90、120、180、240、300、360分钟同步定时记录于RM-6000型多道生理记录仪上。于给药前及给药后60、120、180、240、300、360分钟分别从冠状静脉窦及左股动脉同时取血，用CORNING178型血气分析仪测定血氧。并按文献(Chun-Jie Shao，et al，Chem Pharm Bull，1988；36(2)：601)中描述的通用公式计算下列各参数：平均动脉压(MAP)、总外周阻力(TPR)、心脏指数(CI)、心搏指数(SI)、左室作功指数(LVWI)、心肌血流量(MBF)、冠状血管阻力(CVR)、心肌氧耗量、心肌氧摄取率及心肌耗氧指数。

空白对照组在观察期360分钟内血流动力学各参数基本保持稳定。阴性对照组血流动力学各参数出现明显变化，表现为：HR明显减慢，SBP、DBP、MAP、LVP、CO、SI、CI及MBF明显降低，TPR、CVR、LVWI及LVEDP明显增高(数据未示出)。与阴性对照组比较，可见投用本发明药物组合物(15、30mg/kg)的实验组动物的HR明显减慢，LVP、MAP、TPR、LVWI及LVEDP降低，表明心脏前、后负荷减轻，心脏作功和心肌氧耗减少，并且心室舒张期延长，从而增加了冠脉的灌注时间。本发明的药物组合物对模型动物的心肌氧代谢、心肌氧摄取率、心肌耗氧量及心肌耗氧指数的影响如下列表6所示。

              表6  本发明的药物组合物对AMI犬心肌氧代谢的影响(x±s，n＝6)

                                                          给药后

组别          给药前

                           60’                     120’                  180’                   240’                   300’

心肌耗氧量(ml/100g/min)

阴性对照组    8.70±1.7    8.40±1.2    9.19±1.2    9.70±1.7    10.6±1.3    10.2±1.8

实验组

15mg/kg       8.80±1.4    7.60±1.8    7.21±1.8^*  7.50±1.4^*  8.20±1.8^*  8.80±2.0

30mg/kg       8.65±1.3    7.40±1.6    7.20±1.2^*  7.30±1.5^*  8.10±1.7^*  7.60±1.4^*

阳性对照组

6ml/kg        9.04±2.7    7.75±1.3    7.25±1.4^*  7.42±1.2^*  8.25±1.4^*  8.90±1.8

心肌氧摄取率(％)

阴性对照组    54.1±7.9    58.0±8.7    62.1±9.6    66.2±8.7     76.2±12.6   77.1±13.6

实验组

15mg/kg       54.8±6.0    56.7±6.1    47.6±9.5^*  51.6±8.5^*  62.6±16.2   64.6±12.5

30mg/kg       59.1±8.6    57.2±6.8    48.2±8.9^*  47.9±9.8^*  57.1±9.5^*  61.2±7.5^*

阳性对照组

6ml/kg        61.1±9.2    59.5±8.9    49.0±6.7^*  52.7±7.5^*  59.0±8.7^*  60.6±8.7^*

心肌耗氧指数

阴性对照组    22.9±4.3    20.5±3.1    18.6±2.4    16.4±3.6     14.8±2.9    13.7±3.2

实验组

15mg/kg       23.5±3.0    21.4±3.0    19.8±2.7    18.3±4.8     16.9±3.5    15.8±2.2

30mg/kg       23.4±4.6    21.0±4.7    20.8±5.2    19.1±6.9     17.2±6.2    16.0±5.8

阳性对照组

6ml/kg        23.7±5.1    21.3±4.7    20.8±4.7    19.9±7.1     18.0±3.1^*  16.4±3.3^*

与阴性对照组比较，^*p＜0.05

实施例5：本发明的药物组合物对BaCl₂诱发的大鼠心律失常的预防及治疗作用

体重190～280g的Wistar大鼠100只(雌雄各半)，随机分为5组：空白对照组、阳性对照组(维拉帕米1mg/kg)、及三个注射本发明的药物组合物(25、50、100mg/kg)的实验组，每组10只动物。静脉注射10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉后，仰位固定动物并描记II导联心电图。由舌下静脉注射0.4％BaCl₂(4mg/kg)诱发心律失常。预防给药：于注射BaCl₂前3分钟分别经舌下静脉注射维拉帕米1mg/kg及本发明的药物组合物25、50、100mg/kg。对照组则给予等体积生理盐水。治疗给药：于注射BaCl₂出现心律失常后1分钟分别经舌下静脉注射维拉帕米1mg/kg及本发明的药物组合物25、50、100mg/kg。对照组给予等体积生理盐水。然后，观察并记录是否出现心律失常及心律失常持续时间和恢复窦性心律的时间。

结果可见，对照组10只动物舌下静脉注射BaCl₂后，在0.42±0.10分钟内出现多源性室性心动过速，并持续10-15分钟。不同剂量的本发明药物组合物(25mg/kg-100mg/kg)可使10只动物在4.80±2.10分钟至7.20±2.60分钟内未出现心律失常(与对照组比较p＜0.001)，表明本发明的药物组合物对BaCl₂所致的大鼠心律失常具有预防作用。另一方面，在观察的15分钟内，空白对照组10只动物给生理盐水后均未见室性心动过速转为窦性正常心律(0/10)，而投用本发明的药物组合物(25mg/kg-100mg/kg)则可使2-8只大鼠室性心动过速在1分钟内转为窦性正常心律，并持续7-15min以上。另有2只大鼠室速减轻。可见阳性对照组(维拉帕米1mg/kg)9只动物室性心动过速在1分钟内转为窦性正常心律(9/10)并持续15分钟以上，其中1只动物室速减轻。经四格表X²检验表明，本发明的药物组合物(50、100mg/kg)及维拉帕米(1mg/kg)对BaCl₂所致的大鼠心律失常均具有治疗作用(与对照组比较p＜0.05或p＜0.01)。

实施例6：本发明的药物组合物对高脂血症大鼠胆固醇及脂蛋白-胆固醇代谢的影响

体重205～225g的雄性Wistar大鼠60只，按体重随机分为6组：正常对照组、高脂对照组、阳性对照组(非诺贝特200mg/kg)及三个实验组(本发明的药物组合物25、50、100mg/kg)，每组10只动物。高脂饮食在给药前一天开始，每晚6:00～7:00给予高脂饲料(配方：2％胆固醇、0.2％丙基硫氧嘧啶、0.3％胆酸钠、7.5％猪油、90％普通饲料)，白天补充普通饲料，共喂饲12天。除非诺贝特组灌胃给药外，各实验组均每日8时静脉注射给药1次，连续12日。最后1日晚禁食不禁水。次日上午用戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，经腹主动脉采血并分离血清。按文献(黄德才，中华医学检验杂志，1985，8(3)：142)中所述的酶学方法检测甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)。

结果可见，高脂对照组与正常组比较，血清TC、TG、LDL-c、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c均显著升高，HDL-c则显著下降，表明高脂模型复制成功。本发明的药物组合物50、100mg/kg组与高脂对照组比较，能明显降低血清TG、LDL-c、TC/HDL-c及LDL-c/HDL-c(P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001)，100mg/kg组能明显降低血清TC(P＜0.05)(见表7)。

                  表7  本发明的药物组合物对高脂血症大鼠血脂代谢的影响(x±s，n＝10)

组别        TG              TC                LDL-c            HDL-c          TC/HDL-c       LDL-c/HDL-c

            (mol/L)         (mmol/L)         (mmol/L)         (mmol/L)

正常对照组  0.67±0.24^*    2.98±0.85^**    4.25±0.88^**   1.10±0.32^*    2.71±0.85^***  3.86±1.32^***

高脂对照组  1.14±0.54      4.72±1.23       7.20±2.31      0.70±0.31       6.74±2.58     10.28±3.82

实验组

25mg/kg     0.98±0.28      4.55±2.02       6.14±2.02      0.75±0.35       6.07±1.56      8.19±2.57

50mg/kg     0.65±0.27^*    4.17±1.35       4.31±1.33^**   1.02±0.27^*    4.09±1.76^*    4.23+1.78^***

100mg/kg    0.62±0.35^*    3.52±1.01^*    4.27±1.32^**    1.08±0.19^**   3.26±1.39^**   3.95±1.45^***

阳性对照组

200mg/kg    0.69±0.21^*    3.38±1.02^*     4.75±1.61^*    0.92±0.20      3.67±1.60^**   5.16±2.38^**

与高脂对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001

Claims (12)

1.生产刺五加总皂苷提出物的方法，该方法包括首先用CaO制成的石灰乳，将刺五加的水煎煮液调成碱性；然后在中性条件下使刺五加滤液通过大孔吸附树脂柱吸附并用乙醇洗脱；最后再使所得到的洗脱物通过弱酸型离子交换树脂并进行常规脱色。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的石灰乳的pH为10-12。

3.根据权利要求1的方法，其中所说的刺五加是刺五加植物的叶和/或茎。

4.根据权利要求1的方法，其中所说的刺五加是刺五加植物的叶。

5.根据权利要求1的方法，其中用于洗脱的乙醇体积/体积浓度为70-95％。

6.根据权利要求1的方法，其中所说的常规脱色方法包括使用弱碱型阴离子树脂脱色和/或活性炭脱色。

7.根据权利要求1的方法，其中所说的刺五加总皂苷的重量/重量产率为1-3％。

8.按照权利要求1的方法制备的刺五加总皂苷提出物。

9.含有根据权利要求7的刺五加总皂苷提出物的药物组合物，其中所说的药物组合物除含有作为基本活性成分的治疗有效量的刺五加总皂苷外，还含有一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。

10、根据权利要求9的药物组合物，其中所说的药物组合物被制成适于胃肠道途径给药的各种剂型。

11.根据权利要求9的药物组合物，其中所说的药物组合物被制成适于胃肠道外途径给药的各种剂型。

12.根据权利要求9的药物组合物，其中所说的药物组合物除含有作为基本活性成分的刺五加皂苷提取物外，还可含有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性的天然或合成的其他药物成份或其混合物。