CN111154748A - 一种提高l-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体 - Google Patents
一种提高l-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体 Download PDFInfo
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- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
Abstract
本发明公开了一种提高L‑异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体，属酶代谢工程领域。本发明通过将SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶第47位氨基酸进行定点突变，改变了蛋白质分子与底物的结合效率，提高了L‑异亮氨酸的合成量，降低了L‑缬氨酸的合成量。本发明改造的谷氨酸棒状杆菌工程菌将L‑异亮氨酸合成能力提高12.4％的同时，将L‑缬氨酸的合成能力降低了62.0％，显著增加了L‑异亮氨酸的纯度和产量，为其在食品、医药、化妆品和饲料中的应用提供了重要的价值。
Description
技术领域
本发明提供了一种提高L-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体，属酶代谢工程领域。
背景技术
L-异亮氨酸是人体必需氨基酸，广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料等行业。微生物发酵法是目前合成L-异亮氨酸的主要方法，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是微生物发酵法合成L-异亮氨酸的重要菌株。
乙酰羟酸合酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)是支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-异亮氨酸)生物合成途径中关键的酶，它既可以催化两分子的丙酮酸缩合形成2-乙酰乳酸，又可以催化一分子的丙酮酸和一分子的2-酮丁酸缩合形成2-乙酰-2-羟基丁酸。2-乙酰乳酸是L-缬氨酸和L-亮氨酸合成过程中的重要前体，而2-乙酰-2-羟基丁酸是L-异亮氨酸合成过程中的重要前体。在发酵生产L-异亮氨酸的过程中，L-缬氨酸作为副产物大量存在，对于L-异亮氨酸的分离、纯化造成了困难。
发明内容
针对现有技术中L-异亮氨酸合成量低、副产物L-缬氨酸合成量高的问题，本发明通过对乙酰羟酸合酶进行点突变，提供了一种提高L-异亮氨酸合成，降低副产物L-缬氨酸合成的乙酰羟酸合酶的突变体。
本发明的第一个目的是提供一种提高L-异亮氨酸合成，降低L-缬氨酸合成的乙酰羟酸合酶的突变体，所述乙酰羟酸合酶的突变体是将SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶第47位的异亮氨酸突变为酪氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酰羟酸合酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酰羟酸合酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明的第二个目的是提供一种提高L-异亮氨酸合成，降低L-缬氨酸合成的谷氨酸棒状杆菌工程菌；所述工程菌是以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)WM001为宿主，将乙酰羟酸合酶突变体的重组表达质粒转化到宿主中。
在一种实施方式中，所述乙酰羟酸合酶突变体的重组表达质粒是pJYW4。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌WM001(Corynebacterium glutamicumWM001)，已于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016303，保藏地址为中国武汉武汉大学，并公开于公开号为CN105950517B的专利文件中。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：将乙酰羟酸合酶突变体重组表达质粒电转C.glutamicum WM001感受态细胞，在1mL的LBHIS培养基中培养1h，取50μl菌液涂布于含有卡那霉素的固体LBB平板，30℃培养48h。
本发明的第三个目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸合成，降低L-缬氨酸合成的方法，所述方法是将谷氨酸棒状杆菌乙酰羟酸合酶的第47位的异亮氨酸突变为酪氨酸。
本发明的第四个目的是提供所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-异亮氨酸中的应用。
在一种实施方式中，所述应用以表达所述乙酰羟酸合酶突变体的谷氨酸棒杆菌为发酵微生物，在28～30℃发酵至少48h。
在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌经过活化；所述活化是将谷氨酸棒杆菌在LBB固体培养基中划线培养，于28～30℃培养36～48h，获得单菌落，再将单菌落转接至种子培养基中，于28～30℃培养10～12h，获得种子液。
在一种实施方式中，所述发酵是将所述种子液转接至发酵培养基中，使发酵培养基中的初始OD≥1，于30℃、200rpm发酵96h。
本发明还要求保护所述乙酰羟酸合酶突变体及其基因在提高L-异亮氨酸合成、降低L-缬氨酸合成中的应用。
本发明还要求保护所述乙酰羟酸合酶突变体及其基因在制备含L-异亮氨酸或其衍生物的食品、医药、化妆品和饲料中的应用。
本发明的有益效果：本发明对来源于谷氨酸棒状杆菌的乙酰羟酸合酶进行定点突变，将乙酰羟酸合酶特异性合成L-异亮氨酸的能力提高了12.4％，同时将其合成L-缬氨酸的能力降低了62.0％，为L-异亮氨酸的大量、高纯度合成及其在在食品、医药、化妆品和饲料中的应用提供了重要的理论基础。
附图说明
图1为重组菌株过表达点突变的乙酰羟酸合酶HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
培养基：
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L
LBB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、脑心浸液18.5g/L
LBHIS培养基：蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、氯化钠5g/L、脑心浸液18.5g/L、山梨醇91g/L
种子培养基：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 0.4g/L、玉米浆30g/L，pH 7。
发酵培养基：葡萄糖100g/L、(NH4)2SO4 35g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 0.4g/L、玉米浆15g/L，pH 7。
表1引物序列
实施例1：乙酰羟酸合酶表达菌株的构建
根据NCBI中谷氨酸棒状杆菌的乙酰羟酸合酶基因序列设计上下游引物P1、P2(如表1所示)，以C.glutamicum WM001的基因组为模板，用上下游引物扩增乙酰羟酸合酶的编码基因ilvBN，将目的基因ilvBN连接到表达质粒pJYW4(构建方法公开于Construction ofa novel expression system for use in Corynebacterium glutamicum)，化转E.coliJM109感受态细胞，在1mL的LB培养基中培养1h，取50μl菌液涂布于含有卡那霉素的固体LB平板，37℃培养10h，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后，提取质粒，酶切验证正确后，转化子由天霖公司测序，从而获得构建重组表达质粒pJYW4-ilvBN。
取500ng重组表达质粒pJYW4-ilvBN电转C.glutamicum WM001感受态细胞后，在1mL的LBHIS培养基中培养1h，取50μl菌液涂布于含有卡那霉素的固体LBB平板，30℃培养48h，挑取阳性菌落划格子到固体LBB平板，30℃培养16h，挑取格子中的菌株转接到5mL液体LBB试管，30℃培养16h后提取质粒，酶切验证正确后，从而获得可以高效表达乙酰羟酸合酶的谷氨酸棒状杆菌WM001/pJYW4-ilvBN。
实施例2：乙酰羟酸合酶突变株的获得
利用定点突变，设计上下游引物P3、P4(如表1所示)，以已构建的质粒pJYW4-ilvBN为模板，进行PCR，将乙酰羟酸合酶的第47位的异亮氨酸突变为酪氨酸。PCR条件为95℃5min，34个循环(95℃ 5min、55℃ 30min、68℃ 10min)，72℃ 10min，4℃保温。PCR扩增体系：模板0.5μl，上下游引物各0.5μl，5×PS Buffer5μl，dNTP mix 2μl，primeSTAR 0.25μl，ddH2O 16.25μl。取5μl进行核酸电泳验证，剩余加1μl DpnI去除模板，37℃ 1h，进行化转。转化子由天霖公司进行测序，转化子命名为pJYW4-ilvBN-I47Y。通过实施例1中电转方法，电转到谷氨酸棒状杆菌WM001，从而获得可以高效表达乙酰羟酸合酶突变体的谷氨酸棒状杆菌WM001 pJYW4-ilvBN-I47Y。
实施例3：乙酰羟酸合酶突变体催化谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸
将实施例1、实施例2中测序正确的菌株，和WM001/pJYW4对照菌株，划线固体LBB平板进行菌种活化，30℃培养48h，将活化菌株三个绿豆粒大小的量，转接50mL种子培养基，30℃ 200rpm培养12h，按照初始OD562nm为1转接50mL发酵培养基，30℃ 200rpm发酵96h。取1mL发酵液，12000rpm离心2min取上清，用三氯乙酸稀释20倍，4℃沉淀4h，12000rpm离心20min，过0.45μm水相针式过滤器，所得反应液采用高效液相色谱法进行检测，使用Hypersil ODS-2 25×4.6mm 5μm色谱柱，色谱柱条件：柱温：40℃；流动相A相：3.01g/L无水乙酸盐，5mL四氢呋喃，200μl三乙胺，pH 7.2；流动相B相：3.01g/L无水乙酸盐200mL，pH7.2，400mL色谱纯甲醇，400mL色谱纯乙腈；进样量：5μl；检测器：DAD；流速0.8ml/min。检测重组菌株WM001/pJYW4合成L-异亮氨酸4.95g/L，合成L-缬氨酸只有0.05g/L。过表达基因ilvBN后，重组菌株WM001/pJYW4-ilvBN合成L-异亮氨酸7.15g/L，主要副产物为L-缬氨酸2.79g/L。当过表达ilvBN-I47Y突变体时，C.glutamicum WM001/pJYW4-ilvBN-I47Y合成L-异亮氨酸8.04g/L，同时副产物L-缬氨酸降低为1.06g/L。突变菌株WM001/pJYW4-ilvBN-I47Y相较于WM001/pJYW4-ilvBN，L-异亮氨酸的合成提高了12.4％，同时L-缬氨酸的合成降低了62.0％。针对性的提高了乙酰羟酸合酶合成L-异亮氨酸的能力，降低了其合成L-缬氨酸的能力。
对比例1：
具体实施方式同实施例2，区别在于，将引物P3、P4序列替换为P5、P6；
P5：CAACTTGGTTACCCCACTCGCTGATGCAAACTTG(SEQ ID NO.8)；
P6：CAAGTTTGCATCAGCGAGTGGGGTAACCAAGTTG(SEQ ID NO.9)；
(即将第108位的异亮氨酸突变为亮氨酸)，构建的重组工程菌按照实施例3的方法发酵，测定L-异亮氨酸和L-缬氨酸的产量分别为7.31g/L和2.75g/L，没有明显影响L-异亮氨酸和L-缬氨酸的合成。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高L-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaattctta gatcttggcc ggag 24
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acatcgtgtt cggttaccct ggtggtgcgg t 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accgcaccac cagggtaacc gaacacgatg t 31
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caacttggtt accccactcg ctgatgcaaa cttg 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caagtttgca tcagcgagtg gggtaaccaa gttg 34
Claims (10)
1.一种乙酰羟酸合酶的突变体，其特征在于，为(a)或(b)：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰羟酸合酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述乙酰羟酸合酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.携带权利要求2或3所述基因的载体、细胞或转化体。
5.一种基因工程菌，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主，表达权利要求1所述的乙酰羟酸合酶的突变体。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌WM001。
7.一种提高谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸合成、降低L-缬氨酸合成的方法，其特征在于，将乙酰羟酸合酶的第47位氨基酸由异亮氨酸突变为酪氨酸。
8.权利要求5或6所述的基因工程菌在生产L-异亮氨酸或其衍生产品中的应用。
9.一种发酵生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的基因工程菌接种至发酵培养基中，在28～30℃发酵至少48h。
10.权利要求1所述的乙酰羟酸合酶的突变体，权利要求2或3所述的基因，或权利要求5或6所述的基因工程菌在制备含L-异亮氨酸或其衍生物的食品、医药、化妆品和饲料中的应用。
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