CN103243111B - 菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了菊花GA20ox和CPD双基因片段(序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)和基于上述片段构建的菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体，将该RNAi载体通过农杆菌介导转化菊花，所得转基因阳性植株中GA20ox和CPD两基因的表达均较非转基因植株显著降低，植株株型为微型化表型，从而通过GA20ox和CPD双基因共沉默获得了微型化菊花新品种，具有良好的市场前景和经济价值，同时为其它植物的微型化育种提供了参考和借鉴。

Description

菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及植物基因片段、基于该基因片段构建的RNAi载体、该RNAi载体的构建方法，以及该RNAi载体在植物育种中的应用。

背景技术

株型是植物重要的农艺性状。微型化作为观赏植物株型的重要方面，已显示出良好的市场前景。例如，现代月季中的一个特殊品种——微型月季，因其株型矮小紧凑，叶片、花朵小巧可爱，不占空间，摆放位置选择性更大等优点，目前已成为国际花卉市场上最受欢迎的盆栽花卉之一。菊花是深受人们喜爱的观赏花卉，品种达三千余种，培育株型微型化的菊花品种，预期在未来的花卉市场中也可以取得不错的成绩。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通过基因工程技术培育微型化菊花植株的方法，以及该方法中涉及的基因片段、重组载体、转化体等。

为达到上述目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1.菊花GA20ox基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.菊花CPD基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体，含有一个hpRNA表达盒，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的启动子、GA20ox/CPD双基因拼接片段的正向片段、GA20ox/CPD双基因拼接片段的反向片段和终止子；所述GA20ox/CPD双基因拼接片段包括菊花GA20ox基因片段或其互补片段以及菊花CPD基因片段或其互补片段，所述菊花GA20ox基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，菊花CPD基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的CaMV35S启动子、GA20ox/CPD双基因拼接片段的正向片段、PDK内含子、GA20ox/CPD双基因拼接片段的反向片段和Nos终止子；所述GA20ox/CPD双基因拼接片段包括顺序连接的菊花GA20ox基因片段的正向片段和菊花CPD基因片段的正向片段。

进一步，所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体是以pBI121载体为骨架，将所述GA20ox/CPD双基因拼接片段的正向片段、PDK内含子和GA20ox/CPD双基因拼接片段的反向片段顺序插入pBI121载体的多克隆位点中即得，所述GA20ox/CPD双基因拼接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的构建方法，包括以下步骤：

a.菊花GA20ox和CPD双基因片段的克隆：以菊花幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以DmGA20ox-F和DmGA20ox-R、DmCPD-F和DmCPD-R为引物，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的菊花GA20ox基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的菊花CPD基因片段，所述引物DmGA20ox-F和DmGA20ox-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，DmCPD-F和DmCPD-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；然后，将PCR扩增所得的菊花GA20ox基因片段和菊花CPD基因片段分别与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒GA20ox::pGEM-T和CPD::pGEM-T；

b.菊花GA20ox和CPD双基因片段的拼接：以步骤a所得重组质粒CPD::pGEM-T为模板，以DmCPD(F+XbaI)和DmCPD(R+XhoI)为引物，PCR扩增两侧带XbaI和XhoI酶切位点的菊花CPD基因片段，所述引物DmCPD(F+XbaI)和DmCPD(R+XhoI)的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，将纯化的PCR产物用XbaI和XhoI双酶切，再与经SpeI和SalI酶切的步骤a所得重组质粒GA20ox::pGEM-T连接，获得重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T；

c.菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的构建：以步骤b所得重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T为模板，以DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+X为引物，PCR扩增两侧带XbaI和HindIII酶切位点的GA20ox/CPD双基因拼接片段，所述引物DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+X的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，将纯化的PCR产物用XbaI和HindIII双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得重组质粒GA20ox/CPD::pHANNIBAL；然后，以步骤b所得重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T为模板，以DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+XS为引物，PCR扩增两侧带KpnI和XhoI酶切位点的GA20ox/CPD双基因拼接片段，所述引物DmCPD-R+XS的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，将纯化的PCR产物用KpnI和XhoI双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒GA20ox/CPD::pHANNIBAL连接，获得重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL；最后，将重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL用XbaI和SacI双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒(GA20ox/CPD)i::pBI121，即菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体。

5.含有菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的微生物转化体。

进一步，所述微生物转化体为农杆菌。

6.菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体在微型化菊花植株育种中的应用。

7.利用菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体培育微型化菊花植株的方法，包括以下步骤：

a.菊花外植体的制备：取菊花幼叶，清洗消毒，切成直径为6-8mm的小片，平放于含有质量分数为3%的蔗糖和质量分数为0.8%的琼脂、pH为5.8的MS固体培养基上，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养48小时，然后更换新鲜培养基，在相同条件下继续培养，至获得菊花叶片外植体；

b.农杆菌工程菌液的制备：将含有菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.2%的琼脂、50mg/L利福平(Rif)、500mg/L链霉素(Str)和50mg/L卡那霉素(Kan)、pH为7.2的YEB固体培养基上，在28±2℃黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基中，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，然后28±2℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3%的蔗糖、pH为5.8的MS盐溶液100mL重悬，制得农杆菌工程菌液；

c.转基因菊花植株的制备：将步骤a所得的菊花叶片外植体切成直径小于6mm的小片使其重新产生伤口，置步骤b所得的农杆菌工程菌液中浸染15分钟，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、2mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和0.5mg/L萘乙酸(NAA)、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、质量分数为0.2%的活性炭、4mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、3mg/L硝酸银、400mg/L羧苄青霉素和10-15mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、0.1mg/L萘乙酸、200mg/L羧苄青霉素和5mg/L卡那霉素、pH为5.8的1/2MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至生根，即得转基因菊花植株；

d.转基因菊花阳性植株的筛选：通过PCR检测菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体中含有的报告基因在转基因菊花植株中的表达，以及qPCR检测GA20ox和CPD双基因在转基因菊花植株中的表达，从步骤c获得的转基因菊花植株中筛选出转基因菊花阳性植株，即获得微型化菊花植株。

进一步，所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体中含有NPTII报告基因，所述步骤d通过PCR检测NPTII报告基因在转基因菊花植株中的表达以及qPCR检测GA20ox和CPD双基因在转基因菊花植株中的表达来筛选转基因菊花阳性植株；所述PCR检测方法是分别取转基因菊花植株和非转基因菊花植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTII-F和NPTII-R为引物进行PCR，所述引物NPTII-F和NPTII-R的核苷酸序列分别如SEQID No.13和SEQ ID No.14所示；所述qPCR检测方法是分别取转基因菊花植株和非转基因菊花植株，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以特异性引物qDmGA20ox-F和qDmGA20ox-R、qDmCPD-F和qDmCPD-R、内参引物qDmACTIN-F和qDmACTIN-R进行qPCR，所述引物qDmGA20ox-F和qDmGA20ox-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，qDmCPD-F和qDmCPD-R的核苷酸序列分别如SEQID No.17和SEQ ID No.18所示，qDmACTIN-F和qDmACTIN-R的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.19和SEQ ID No.20所示。

进一步，所述步骤a中菊花品种为“粉地毯”。

本发明中所述1/2MS培养基为除蔗糖外其他组分浓度减少至原浓度1/2的MS培养基；所述MS盐溶液为不含有机物成分的MS液体培养基。

本发明的有益效果在于：本发明利用物种进化同源性，克隆得到菊花GA20ox和CPD双基因片段，基于上述双基因片段构建了菊花GA20ox和CPD双基因共沉默的RNAi载体，将该RNAi载体转入菊花，所得转基因菊花阳性植株中GA20ox基因和CPD基因的表达均较非转基因植株显著降低，植物株型为微型化表型，成功获得了微型化菊花新品种。与传统育种方法通过喷施相应植物激素、改变植株耕作时间或扦插方式等来获得矮化植物株型，费时费力且不可稳定遗传相比，本发明采用基因工程技术，高效并可稳定遗传地改变了植物株型，为观赏植物的品种改良作出了积极的探索，也为其他植物的微型化育种提供了参考和借鉴，所得微型化菊花新品种具有良好的市场前景和经济价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明流程示意图。

图2为菊花GA20ox和CPD双基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中M为DNA分子量标准(Maker)，1-5为GA20ox基因扩增片段，6为CPD基因扩增片段。

图3为重组质粒GA20ox::pGEM-T构建示意图。

图4为重组质粒CPD::pGEM-T构建示意图。

图5为重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T构建示意图。

图6为重组质粒GA20ox/CPD::pHANNIBAL构建示意图。

图7为重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL构建示意图。

图8为重组质粒(GA20ox/CPD)i::pBI121构建示意图。

图9为菊花转基因组织培养过程，其中a为菊花叶片预培养2天后，b为菊花愈伤组织分化，c为菊花抗性芽的分化，d为菊花抗性植株的产生。

图10为PCR检测NPTII报告基因在转基因菊花植株中的表达，其中M为Maker，CK-为阴性对照，CK+为阳性对照，1-11为转基因菊花植株。

图11为GA20ox和CPD双基因在转基因菊花阳性植株中的沉默效果鉴定，其中WT为非转基因菊花，RNAi-1、3、5、9、10、11为不同的转基因菊花阳性株系。

图12为转基因菊花阳性植株的表型，其中a为整个植株的表型，b为叶片表型，WT为非转基因菊花，RNAi-1和RNAi-3为不同的转基因菊花阳性株系。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例中使用的菊花品种为“粉地毯”，由北京市农林科学院生物技术中心花卉实验室惠赠。pGEM-T Easy载体为Promega公司产品，pHANNIBAL载体、pBI121载体、大肠杆菌DH5α、含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌“协助”菌(helper)、根癌农杆菌LBA4404由本实验室保存。RNA提取试剂盒、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、DNA提取试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.0(T4DNA连接酶/SolutionI)、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶均为大连TaKaRa公司产品。超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)为TIANGEN公司产品。其余试剂均为分析纯试剂。

本发明的流程示意图如图1所示。

一、菊花GA20ox和CPD双基因片段的克隆

根据菊花GA20ox基因序列(GenBank登录号AB371601)，设计特异性引物DmGA20ox-F和DmGA20ox-R。根据菊科艾属黄花蒿(Artemisia annua)和菊科百日菊属百日菊(Zinnia elegans)的类固醇23-alpha羟化酶基因序列，在保守区域设计特异性引物DmCPD-F和DmCPD-R。引物序列如下：

DmGA20ox-F：5′-AAGTTGGTGAAAGTTGTG-3′(SEQ ID No.4)；

DmGA20ox-R：5′-AGC DmCPD-F CCTGTAATGCTTCTG-3′(SEQ ID No.5)；

DmCPD-F：5′-AGGGGATGAAGAAGAACGACATGTT-3′(SEQ ID No.6)；

DmCPD-R：5′-GATTTCTGCCATCTCCA-3′(SEQ ID No.7)。

以菊花幼叶总RNA为模板，根据RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书，以oligodT引物反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以DmGA20ox-F和DmGA20ox-R、DmCPD-F和DmCPD-R为引物，PCR扩增菊花GA20ox基因片段和CPD基因片段。PCR反应体系为：ddH₂O16.5μL、10×PCR Buffer2.5μL、MgCl₂2.5μL、dNTP(10μM)1.0μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1.0μL、Taq DNA聚合酶0.5μL，共25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃终延伸10分钟。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)后，采用超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。将纯化的菊花GA20ox基因片段和CPD基因片段分别与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒GA20ox::pGEM-T和CPD::pGEM-T(图3-4)。将上述两种重组质粒委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，结果显示，分别获得698bp的菊花GA20ox基因片段(SEQ IDNo.1)和475bp的菊花CPD基因片段(SEQ ID No.2)。

二、菊花GA20ox和CPD双基因片段的拼接

根据重组质粒GA20ox::pGEM-T的多克隆位点和菊花CPD基因片段序列，设计如下引物：

DmCPD(F+XbaI)：5′-CTAGTCTAGAAGGGGATGAAGAAGAACGACATGTT-3′(SEQ IDNo.8)，下划线部分为XbaI酶切位点；

DmCPD(R+XhoI)：5′-CCGCTCGAGGATTTCTGCCATCTCCA-3′(SEQ ID No.9)，下划线部分为XhoI酶切位点。

以重组质粒CPD::pGEM-T为模板，以DmCPD(F+XbaI)和DmCPD(R+XhoI)为引物，PCR扩增两侧带XbaI和XhoI酶切位点的CPD基因片段，将纯化的PCR产物用XbaI和XhoI双酶切，再与经SpeI和SalI酶切的重组质粒GA20ox::pGEM-T在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T(图5)。将重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，结果显示，获得1183bp的GA20ox/CPD双基因拼接片段(SEQID No.3)，其中包括顺序连接的菊花GA20ox基因片段(SEQ ID No.1，698bp)的正向片段和菊花CPD基因片段(SEQ ID No.2，475bp)的正向片段。

上述步骤中，酶切体系为：ddH₂O23μL、重组质粒20μL、限制性内切酶各1μL、10×Buffer5μL，共50μL；连接体系为：T4DNA连接酶(SolutionI)5μL、目标基因片段4.5μL、重组质粒线性片段0.5μL，共10μL。

三、菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的构建

根据pHANNIBAL载体的多克隆位点和所得GA20ox/CPD双基因拼接片段序列，设计如下引物：

DmGA20ox-F+KH：5′-CGG AAGCTTAAGTTGGTGAAAGTTGTG-3′(SEQ IDNo.10)，下划单直线部分为HindIII酶切位点，下划双直线部分为KpnI酶切位点；

DmCPD-R+X：5′-CCGTCTAGAGATTTCTGCCATCTCCA-3′(SEQ ID No.11)，下划单直线部分为XbaI酶切位点；

DmCPD-R+XS：5′-CCG GAGCTCGATTTCTGCCATCTCCA-3′(SEQ ID No.12)，下划单直线部分为SacI酶切位点，下划双直线部分为XhoI酶切位点。

以重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T为模板，以DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+X为引物，PCR扩增两侧带HindIII和XbaI酶切位点的GA20ox/CPD双基因拼接片段；将纯化的PCR产物用HindIII和XbaI双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒GA20ox/CPD::pHANNIBAL(图6)；另以重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T为模板，以DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+XS为引物，PCR扩增两侧带KpnI和XhoI酶切位点的GA20ox/CPD双基因拼接片段；将纯化的PCR产物用KpnI和XhoI双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒GA20ox/CPD::pHANNIBAL在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL(图7)，即将GA20ox/CPD双基因拼接片段分别正向和反向插入pHANNIBAL载体中PDK内含子的两侧。上述步骤中，PCR体系为：ddH₂O16μL、10×PrimeSTAR Buffer(含MgCl₂)2.5μL、dNTP(2.5μM)4.0μL、上下游引物各0.5μL、质粒模板1.0μL、PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5μL，共25μL。PCR循环参数为：98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延伸1.5分钟，共40个循环；最后72℃终延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。

最后，将重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL用XbaI和SacI双酶切，再与经同样双酶切的植物表达载体pBI121在T4DNA连接酶作用下连接，获得重组质粒(GA20ox/CPD)i::pBI121(图8)，即菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体，其含有一个hpRNA表达盒“35Spro-fGA20ox/CPD-pdk-rGA20ox/CPD-Nos ter”，即顺序连接的CaMV35S启动子、GA20ox/CPD双基因拼接片段(SEQ ID No.3)的正向片段、PDK内含子、GA20ox/CPD双基因拼接片段(SEQID No.3)的反向片段和Nos终止子。

四、菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体转化农杆菌

将根癌农杆菌LBA4404在含有1.2%(w/w)琼脂、50mg/L利福平和500mg/L链霉素的YEB固体培养基上划线，28±2℃黑暗条件下培养2-2.5天至长出单菌落；分别将含有重组质粒(GA20ox/CPD)i::pBI121的大肠杆菌DH5α和含有游动质粒Prk2013的大肠杆菌helper在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，37±2℃条件下倒置培养14-16小时至长出单菌落；将根癌农杆菌LBA4404单菌落、大肠杆菌helper单菌落和含有重组质粒(GA20ox/CPD)i::pBI121的大肠杆菌DH5α单菌落依次重叠均匀涂在含有1.2%(w/w)琼脂的YEB固体培养基(pH7.2)中央直径为1cm的圆圈中，28±2℃黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团适量，在含有1.2%(w/w)琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基(pH7.2)中划线，28±2℃黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基(pH7.2)，在28±2℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD₆₀₀为1.8-2.0，提取重组质粒，用EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，阳性重组子即为(GA20ox/CPD)i::pBI121农杆菌工程菌株，-80℃冻存备用。

五、农杆菌介导的菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体转化菊花

将菊花幼嫩叶片切下后，在自来水中冲洗45-60min，在70%(v/v)乙醇中消毒2min，期间不断搅动，用无菌水冲洗3次，然后在0.1%(w/w)氯化汞溶液中浸泡冲洗12min，用无菌水冲洗5-6次，最后用无菌吸水纸将水吸干后，将叶片切成直径为6-8mm的小片，平放于含有3%(w/w)蔗糖和0.8%(w/w)琼脂、pH为5.8的MS固体培养基上，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养48小时，然后更换新鲜培养基，在相同条件下继续培养，至获得菊花叶片外植体。

将(GA20ox/CPD)i::pBI121农杆菌工程菌株接种于含有1.2%(w/w)琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB固体培养基上，28±2℃黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基中，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，然后28±2℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有3%(w/w)蔗糖、pH为5.8的MS盐溶液100mL重悬，制得(GA20ox/CPD)i::pBI121农杆菌工程菌液。

将菊花叶片外植体切成直径为5mm的小片使其重新产生伤口，置(GA20ox/CPD)i::pBI121农杆菌工程菌液中浸染15分钟，用无菌吸水纸吸去多余菌液后，接入共培养培养基(即含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、2mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L萘乙酸、pH5.8的MS固体培养基)中，在25±2℃黑暗条件下共培养48小时，用无菌水清洗后，再转入抗性筛选诱导生芽培养基(即含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、0.2%(w/w)活性炭、4mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、3mg/L硝酸银、400mg/L羧苄青霉素和10-15mg/L卡那霉素、pH5.8的MS固体培养基)中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至长出绿色愈伤组织及抗性芽(图9a,b)；将同一个生长点长出的长2-3cm的抗性芽切下，转入生根培养基(即含有3%(w/w)蔗糖、0.8%(w/w)琼脂、0.1mg/L萘乙酸、200mg/L羧苄青霉素和5mg/L卡那霉素、pH5.8的1/2MS固体培养基)中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至生根，即得转基因菊花植株(图9c,d)。

上述农杆菌介导菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体转化菊花的方法为优化方法，其具有以下特点：①农杆菌的浓度影响菌体在植物细胞上的附着，在一定范围内，菌液浓度越大，附着率越高，转化率越大，但超过该范围，由于菌的毒害作用或生长过快等，会使外植体受到农杆菌过度伤害而导致外植体切口褐化腐烂严重，且不利于共培养后去除农杆菌，而低于该范围，较低的菌液浓度会使T-DNA不能有效地整合进植物细胞基因组中，大大降低转化效率。本发明对农杆菌工程菌液的浓度进行了优化，能够有效保证菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的转化率；②激素是影响再生频率的主要因素之一，不同的激素组合及激素水平对诱导不同外植体愈伤和出芽的影响不同，本发明方法中共培养的激素组合优选为2mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L萘乙酸；分化的激素组合优选为4mg/L6-苄氨基腺嘌呤和0.1mg/L萘乙酸，并加入3mg/L硝酸银促分化与0.2%(w/w)活性炭抑制褐化；生根激素优选为0.1mg/L萘乙酸；③由于菊花对卡那霉素很敏感，卡那霉素浓度过低，选择压不足，易产生非转基因植株，反之则不利于芽分化，本发明方法中抗性筛选诱导生芽培养基中卡那霉素的浓度优选为10-15mg/L；④采用本发明所述生根培养基进行生根培养，生根率可达15%，阳性植株得率可达4.2%。

六、转基因菊花阳性植株的筛选

1.PCR检测NPTII报告基因在转基因菊花植株中的表达

根据载体pBI121中的NPTII报告基因序列，设计如下特异引物：

NPTII-F：5′-TTGTCACTGAAGCGGGAAGG-3′(SEQ ID No.13)；

NPTII-R：5′-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3′(SEQ ID No.14)。

分别取转基因菊花植株和非转基因菊花植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTII-F和NPTII-R为引物进行PCR扩增，检测NPTII报告基因在转基因菊花植株中的表达。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果如图10所示，部分转基因菊花植株的PCR产物在492bp位置出现目标DNA条带，经测序证明与NPTII报告基因片段序列一致，证实这些植株为转基因菊花阳性植株。

2.qPCR检测GA20ox和CPD双基因在转基因菊花阳性植株中的表达

根据菊花GA20ox基因片段序列、CPD基因片段序列和ACTIN内参基因(GenBank登录号AB205087)序列，设计如下引物：

qDmGA20ox-F：5′-TATGTCCAAAGAAGGATAAGGTAGTG-3′(SEQ ID No.15)；

qDmGA20ox-R：5′-AGGTTGAGAAAGCTTGAAGGG-3′(SEQ ID No.16)；

qDmCPD-F：5′-TTACCGACACTCCATTAGCCC-3′(SEQ ID No.17)；

qDmCPD-R：5′-TAGTCTTCCCATTCGAGACACAC-3′(SEQ ID No.18)；

qDmACTIN-F：5′-TTGTGTTGGATTCTGGTGATGG-3′(SEQ ID No.19)；

qDmACTIN-R：5′-AGAATCTTCATCAACGCATCAGTC-3′(SEQ ID No.20)。

分别取转基因菊花阳性植株和非转基因菊花植株的幼叶，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以qDmGA20ox-F和qDmGA20ox-R、qDmCPD-F和qDmCPD-R、qDmACTIN-F和qDmACTIN-R为引物进行qPCR，检测GA20ox和CPD双基因在转基因菊花阳性植株中的表达。结果如图11所示，转基因菊花阳性植株中GA20ox和CPD双基因的表达都较非转基因菊花植株显著降低，基因沉默效率较高。

七、转基因菊花阳性植株的表型分析

将上述筛选出的转基因菊花阳性植株和非转基因菊花植株按常规方法培育，观察分析转基因菊花阳性植株的表型特征，结果显示，转基因菊花阳性植株的株系为微型化表型(图12)。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体，其特征在于，含有一个hpRNA表达盒，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的CaMV35S启动子、GA20ox/CPD双基因拼接片段的正向片段、GA20ox/CPD双基因拼接片段的反向片段和终止子；所述GA20ox/CPD双基因拼接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体，其特征在于，所述hpRNA表达盒包括顺序连接的CaMV35S启动子、GA20ox/CPD双基因拼接片段的正向片段、PDK内含子、GA20ox/CPD双基因拼接片段的反向片段和Nos终止子。

3.根据权利要求2所述的菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体，其特征在于，以pBI121载体为骨架，将所述GA20ox/CPD双基因拼接片段的正向片段、PDK内含子和GA20ox/CPD双基因拼接片段的反向片段顺序插入pBI121载体的多克隆位点中，即得菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体。

4.权利要求1至3任一项所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．菊花GA20ox和CPD双基因片段的克隆：以菊花幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以DmGA20ox-F和DmGA20ox-R、DmCPD-F和DmCPD-R为引物，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的菊花GA20ox基因片段和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的菊花CPD基因片段，所述引物DmGA20ox-F和DmGA20ox-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，DmCPD-F和DmCPD-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；然后，将PCR扩增所得的菊花GA20ox基因片段和菊花CPD基因片段分别与pGEM-T Easy载体连接，获得重组质粒GA20ox::pGEM-T和CPD::pGEM-T；

b．菊花GA20ox和CPD双基因片段的拼接：以步骤a所得重组质粒CPD::pGEM-T为模板，以DmCPD(F+XbaI)和DmCPD(R+XhoI)为引物，PCR扩增两侧带XbaI和XhoI酶切位点的菊花CPD基因片段，所述引物DmCPD(F+XbaI)和DmCPD(R+XhoI)的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，将纯化的PCR产物用XbaI和XhoI双酶切，再与经SpeI和SalI酶切的步骤a所得重组质粒GA20ox::pGEM-T连接，获得重组质粒GA20ox/CPD:: pGEM-T；

c．菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的构建：以步骤b所得重组质粒GA20ox/CPD:: pGEM-T为模板，以DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+X为引物，PCR扩增两侧带XbaI和HindIII酶切位点的GA20ox/CPD双基因拼接片段，所述引物DmGA20ox-F+KH和DmCPD-R+X的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，将纯化的PCR产物用XbaI和HindIII双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得重组质粒GA20ox/CPD:: pHANNIBAL；然后，以步骤b所得重组质粒GA20ox/CPD::pGEM-T为模板，以DmGA20ox-F+ KH和DmCPD-R+XS为引物，PCR扩增两侧带KpnI和XhoI酶切位点的GA20ox/CPD双基因拼接片段，所述引物DmCPD-R+XS的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，将纯化的PCR产物用KpnI和XhoI双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒GA20ox/CPD::pHANNIBAL连接，获得重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL；最后，将重组质粒(GA20ox/CPD)i::pHANNIBAL用XbaI和SacI双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒(GA20ox/CPD)i:: pBI121，即菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体。

5.含有权利要求1至3任一项所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的微生物转化体。

6.权利要求1至3任一项所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体在微型化菊花植株育种中的应用。

7.利用权利要求1至3任一项所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体培育微型化菊花植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．菊花外植体的制备：取菊花幼叶，清洗消毒，切成直径为6-8mm的小片，平放于含有质量分数为3%的蔗糖和质量分数为0.8%的琼脂、pH为5.8的MS固体培养基上，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养48小时，然后更换新鲜培养基，在相同条件下继续培养，至获得菊花叶片外植体；

b．农杆菌工程菌液的制备：将含有菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.2%的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB固体培养基上，在28±2℃黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基20mL，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素、pH为7.2的YEB液体培养基中，在28±2℃、200rpm条件下扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，然后28±2℃离心弃上清，菌体用新鲜的YEB液体培养基洗涤，再用含有质量分数为3%的蔗糖、pH为5.8的MS盐溶液100mL重悬，制得农杆菌工程菌液；

c．转基因菊花植株的制备：将步骤a所得的菊花叶片外植体切成直径小于6mm的小片使其重新产生伤口，置步骤b所得的农杆菌工程菌液中浸染15分钟后，接入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤和0.5mg/L萘乙酸、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃黑暗条件下共培养48小时，再转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、质量分数为0.2%的活性炭、4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、3mg/L硝酸银、400mg/L羧苄青霉素和10-15mg/L卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至长出愈伤组织及抗性芽；将长2-3cm的抗性芽切下，转入含有质量分数为3%的蔗糖、质量分数为0.8%的琼脂、0.1mg/L萘乙酸、200mg/L羧苄青霉素和5mg/L卡那霉素、pH为5.8的1/2MS固体培养基中，在25±2℃、光周期16h/d、光照强度1000-2000lx条件下培养至生根，即得转基因菊花植株；

d．转基因菊花阳性植株的筛选：通过PCR检测菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体中含有的报告基因在转基因菊花植株中的表达，以及qPCR检测GA20ox和CPD双基因在转基因菊花植株中的表达，从步骤c获得的转基因菊花植株中筛选出转基因菊花阳性植株，即获得微型化菊花植株。

8.根据权利要求7所述的利用菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体培育微型化菊花植株的方法，其特征在于，所述菊花GA20ox和CPD双基因RNAi载体中含有NPTII报告基因，所述步骤d通过PCR检测NPTII报告基因在转基因菊花植株中的表达以及qPCR检测GA20ox和CPD双基因在转基因菊花植株中的表达来筛选转基因菊花阳性植株；所述PCR检测方法是分别取转基因菊花植株和非转基因菊花植株，提取基因组DNA，再以所得基因组DNA为模板、NPTII-F和NPTII-R为引物进行PCR，所述引物NPTII-F和NPTII-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；所述qPCR检测方法是分别取转基因菊花植株和非转基因菊花植株，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以特异性引物qDmGA20ox-F和qDmGA20ox-R、qDmCPD-F和qDmCPD-R、内参引物qDmACTIN-F和qDmACTIN-R进行qPCR，所述引物qDmGA20ox-F和qDmGA20ox-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，qDmCPD-F和qDmCPD-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，qDmACTIN-F和qDmACTIN-R的核苷酸序列分别如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。