CN105717057A - 一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定植物细胞氨基酸泄漏率的方法，其步骤包括a.试验准备；b．准确称样；c．浸提；d．离心；e．去除杂蛋白干扰；f．测定吸光度；g．计算氨基酸泄漏率。利用本方法测定生物细胞氨基酸泄漏率简单方便，整个测定工作耗时不到3.5h，可对一次试验中各处理成批测定，处理间可比性强，稳定性好，误差小，在植物抗逆性研究中应用性广，可推广应用于植物对高温、低温、辐射、重金属、盐害、干旱抗逆性鉴定研究中，也可应用于生物细胞对其他非生物胁迫因子的抗逆性鉴定研究中。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗逆性鉴定技术，具体是指一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法。
背景技术
受全球气候变暖的影响，环境变化程度增大，春夏季寒流天气频繁，对已进入生长发育期的植物造成严重威胁，引起草原植被群落的变迁和结构的改变，尤其在农业生产中造成很大的减产，甚至绝收。另外，在农业生产过程中，随着化肥的投入使用，土壤盐碱化问题愈加突出，对农作物造成一定程度的盐害，严重影响农业生产。抗逆性强的植物在逆境胁迫中产出性能强，减产小。因此，通过选育抗逆性强的植物新品种是改良植物抗逆性，保持农牧业增收的有效途径。
植物抗逆性快速鉴定的方法是植物抗逆育种的关键技术，一直受到研究者的关注，但传统的形态鉴定法不能对抗逆性进行量化分析，分子鉴定技术成本高，操作难度大且耗时，要求精密仪器才能完成。电导率法虽然能反映细胞的完整性，但测定时误差难以控制。由于植物细胞为双磷脂分子层通透性膜，中间镶嵌大量蛋白质和糖类分子，具有渗透调节功能，也具有双向选择透性。当植物受到低温冷冻、盐碱非生物环境因子胁迫后，机体内抗氧化系统失衡，自由基积累，一些蛋白质被降解为游离氨基酸，膜蛋白降解后从生物膜脱落下来，破坏了生物膜系统结构，造成生物膜不同程度出现孔洞，细胞内含物开始向外泄露，介质中游离氨基酸增多。不同程度的环境胁迫引起蛋白质降解的程度不同，造成氨基酸泄露的程度就不同。然而，抗逆性强的植物具有较强的抗氧化系统，能及时清除多余的自由基，维持体内自由基的稳定和平衡，保护功能蛋白质不被降解，保持膜系统的完整性。因此，当植物遭到逆境胁迫后，抗逆性强的植物生物膜系统稳定，蛋白质相对稳定，氨基酸泄露率低。根据自由基学说、生物膜损伤原理和蛋白质稳定性原理，可通过测定植物组织细胞氨基酸泄漏的程度，来衡量生物膜系统的完整性和蛋白质的稳定性，这对于鉴定植物的抗逆性和选育抗逆性强的植物新品种均有着实际的应用价值。
发明内容
鉴于上述，本发明的目的在于提供一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法。本方法利用氨基酸在280nm处有一吸收高峰为依据，以杀死组织后280nm吸光度为参照，通过试验准备-准备样品-浸提-离心-去除杂蛋白干扰-测定鲜组织吸光度-高压灭杀-合并离心-测定杀死组织吸光度，最后计算氨基酸泄露率。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法，其步骤是：
a．试验准备
根据试验处理数，准备足量5-10ml带螺盖离心管，用无离子水洗净后烘干备用；
b．准备样品
处理前用蒸馏水冲洗待测植物组织，用滤纸吸干表面水分；处理结束，准确称取各处理植物新鲜组织0.0401-0.0509g，置a步骤准备的离心管中；
c．浸提
在b步骤含植物新鲜组织的离心管中各加入4mL蒸馏水，在室温条件下，浸提2-3h，摇床轻摇浸提3h；
d．离心
浸提结束，立即将c步骤的浸提管放置在转速为3000rev/min的离心机离心5-10分钟；
e．去除杂蛋白干扰
上述d步骤离心结束，吸取浸提管中的上清液3.0ml,转入另一测试管，加入0.3ml的72%（w/v）三氯乙酸（TCA）溶液，再在3000rev/min离心5-10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；
f．测定鲜组织的吸光度
将e步骤离心后的测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光度值A280nm，空白为蒸馏水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm，测定后将比色杯液体倒回测试管中；
g.高压灭杀
将e步骤吸取上清液后留有植物组织和1ml浸提液的浸提管上盖置高压灭菌锅灭杀20min，浸提管称之灭杀管；
h.合并离心
将e步骤测试管测试液全部回倒入其g步骤对应灭杀管中，合并后再在3000rev/min离心5-10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；
i.测定杀死组织的吸光度
将上述h步骤合并离心的灭杀管上清液倒入比色杯，空白为蒸馏水，再次测定吸光度值Ak280nm，即为杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm；
j．计算氨基酸泄漏率
氨基酸泄漏率为各处理鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm占杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm的比率，按下列公式计算：
氨基酸泄漏率（%）=A280nm×100/Ak280nm。
本发明的优点和产生的有益效果是：
1、本发明根据自由基学说和生物膜损伤机制，利用游离氨基酸在280nm处有一吸收高峰为依据，以杀死组织后280nm吸光度作为游离氨基酸100%泄漏的参照值，通过测定各处理鲜组织280nm吸光度，最后计算氨基酸泄露率，成本低廉，方法简单，处理间可比性强，在植物抗逆性鉴定中应用成效显著。
2、本发明关键技术步骤在于样品经浸提、离心、去除杂蛋白干扰、通过测定鲜组织和杀死组织280nm的吸光度，计算出氨基酸泄露率。在这一步骤中，鲜样和杀死样为同一样品，一次称样即可完成测定，样品用量少，取样部位灵活，鲜样和杀死样在280nm的吸光度值可比性强，不存在因样组织部位和质量的不同造成280nm吸光度值的差异，测定误差小。
3、利用本方法测定氨基酸泄漏率快速方便，整个测定工作耗时不到4h，可对一次试验各处理成批测定，处理间可比性强，稳定性好，可快速鉴定植物的抗低温冷冻性和抗盐性，在植物抗逆性研究中应用性广。
具体实施方式：
下面，本发明结合实施实例，对本发明的技术方案再作进一步的说明：
实施例1
为了鉴定瓜果生长期间对寒流引起的冷、冻害的抗性，本发明采用抗寒性有差异的西瓜品种京欣1号和陇丰早成品种，将出苗后在23/25℃培养30d的幼苗在4℃和0℃处理24h，用25℃作为对照。测定京欣1号和陇丰早成西瓜在冷、冻胁迫下子叶氨基酸泄露率的变化。试验在中国科学院寒区旱区环境与工程研究所分子生物学实验室进行，测定试验重复3次。
一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法，其步骤是：
1．试验准备
根据试验处理数，准备36个10ml带螺盖离心管，用无离子水洗净后烘干备用；
2．准备样品
将室内温度为23/25℃条件下播种出苗并生长10d的西瓜品种京欣1号和陇丰早成幼苗用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干表面水分，然后置4℃和0℃处理24h，对照留在23/25℃，处理结束，准确称取各处理幼苗子叶3份，作为3次重复，每份0.0401-0.0409g，分别置上述离心管编号；
3．浸提
在上述含子叶的离心管中各加入4mL蒸馏水，在23/25℃条件下浸提2-3h，期间每隔30分钟轻摇1次或置摇床轻摇浸提；
4．离心
轻摇结束，立即将浸提管放置在转速为3000rev/min的离心机离心10分钟；
5．去除杂蛋白干扰
吸取浸提管中上清液3.0ml转入另一测试管，加入0.3ml的72%（w/v）三氯乙酸（TCA）溶液，再在转速为3000rev/min的离心机离心10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；
6．测定鲜样品的吸光度
将测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光度值A280nm，空白为蒸馏水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm，测试结束将比色杯液体全部回收入测试管中；
7.高压灭杀
将吸取浸提液后含有子叶和1ml浸提液的浸提离心管置高压灭菌锅灭菌20min，冷却后与对应测试管浸提液合并；
8.离心
将含合并液的杀灭离心管在转速为3000rev/min的离心机离心10分钟,以沉淀去除杂蛋白干扰；
9．测定杀死样品的吸光度
将上述合并离心的灭杀管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光度值A280nm，空白为蒸馏水；再次测定吸光度值Ak280nm，即为杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm；
10．计算氨基酸泄漏率
氨基酸泄漏率为各处理子叶在波长280nm的吸光度值A280nm占高压杀死子叶在波长280nm的吸光度值Ak280nm的比率，按下列公式计算：
氨基酸泄漏率（%）=A280nm×100/Ak280nm
表1西瓜品种京欣1号幼苗分别经4℃和0℃处理24h氨基酸泄露率的比较
表1表明，对照23/25℃条件下京欣1号平均氨基酸泄漏率为5.22%，标准误为1.11%，95%置信区间为[0.44%，9.99%]；4℃处理24h平均氨基酸泄漏率为3.91%，标准误为0.26%，95%置信区间为[2.79%，5.02%]；0℃处理24h平均氨基酸泄漏率为50.13%，标准误为3.48%，95%置信区间为[35.15%，65.11%]。经t检验，4℃处理24h后京欣1号品种子叶氨基酸泄漏率与对照差异性不显著（t＝1.151，P＞0.05），而0℃处理24h后氨基酸泄漏率平均值为50.13%，较对照极显著增大（t＝-12.288，P＜0.001）。
表2西瓜品种陇丰早成幼苗分别经4℃和0℃处理24h氨基酸泄露率的比较
表2表明，对照23/25℃条件下陇丰早成品种平均氨基酸泄漏率为6.02%，标准误为0.98%，95%置信区间为[1.82%，10.26%]；4℃处理24h平均氨基酸泄漏率为5.79%，标准误为0.77%，95%置信区间为[2.47%，9.10%]；0℃处理24h平均氨基酸泄漏率为39.31%，标准误为1.19%，95%置信区间为[34.20%，44.20%]。经t检验，4℃处理24h后陇丰早成品种子叶氨基酸泄漏率与对照差异性不显著（t＝0.202，P＞0.05），而0℃处理24h后氨基酸泄漏率平均值为39.31%，较对照极显著增大（t＝-21.608，P＜0.001）。
综合表1和表2显示，对照23/25℃条件下和4℃处理24h后，京欣1号和陇丰早成品种子叶氨基酸泄漏率分别相差0.882%和1.882%，经t检验差异性均不显著（t＝-0.555，P＞0.05；t＝-2.315，P＞0.05），而在0℃处理24h后，陇丰早成品种子叶氨基酸泄漏率较京欣1号品种降低10.821%，两者差异性达到显著水平（t＝2.941，P＜0.05）。以上说明在幼苗期，4℃持续24h的寒流对京欣1号和陇丰早成品种幼苗子叶影响均不显著，但0℃持续24h的寒流对京欣1号影响的程度显著大于对陇丰早成影响的程度，0℃持续24h的寒流造成京欣1号幼苗处于半致死状态，即子叶受冻害程度因品种而异，陇丰早成品种较京欣1号品种的抗冻性强，这与生产实际相符合。由此得出，通过对西瓜品种幼苗期子叶氨基酸泄漏率的测定可筛选出抗寒性强的西瓜品种。
实施例2
在中国科学院寒区旱区环境与工程研究所分子生物学实验室，用本方法对荒漠植物白刺的抗盐性进行鉴定，测定试验重复2次。
本发明按照以下步骤实施：
1．试验准备
根据试验处理数，准备12个10ml带螺盖离心管，用无离子水洗净后烘干备用；
2．准备样品
将盆栽生长60d的白刺苗用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干表面水分，挖出大小一致的3株，将根分别在清水、1%和10%NaCL溶液浸泡处理12h，处理结束，准确称取各处理心叶6份，每份0.0501-0.0509g，分别置上述离心管；
3．浸提
在上述含子叶的浸提离心管各加入4mL蒸馏水，在室温条件下浸提2h，每隔30分钟轻摇1次；
c．浸提
在b步骤含植物新鲜组织的离心管中各加入4mL蒸馏水，浸提2-3h，期间每隔30分钟轻摇1次或置摇床轻摇浸提；
4．离心
浸提结束，立即将浸提管放置在转速为3000rev/min的离心机离心10分钟；
5．去除杂蛋白干扰
吸取浸提管中上清液3.0ml，转入另一测试管，加入0.3ml的72%（w/v）三氯乙酸（TCA）溶液，再在转速为3000rev/min的离心机离心10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；
6．测定鲜叶片的吸光度
将测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光度值A280nm，空白为蒸馏水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm，测定结束，将将比色杯液体回收倒入原测试管中；
7.高压灭杀
将吸取浸提液后含有叶片和1ml浸提液的浸提离心管置高压灭菌锅灭菌20min，冷却后与对应测试管浸提液合并；
8.合并离心
将含合并液的杀灭离心管在转速为3000rev/min的离心机离心10分钟；
9．测定杀死叶片的吸光度
将上述合并离心的灭杀管上清液倒入比色杯，空白为蒸馏水，再次测定吸光度值Ak280nm，即为杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm；
10．计算氨基酸泄漏率
氨基酸泄漏率为各处理叶片在波长280nm的吸光度值A280nm占高压杀死叶片在波长280nm的吸光度值Ak280nm的比率，按下列公式计算：
氨基酸泄漏率（%）=A280nm×100/Ak280nm
表3白刺苗抗盐性鉴定试验氨基酸泄漏率测定结果
结果经检验表明，将生长60d的白刺苗用浓度为1%NaCL溶液浸泡处理12h后，白刺叶片氨基酸泄漏率与对照清水浸泡差异性不显著（t＝0.550，P＞0.05），两处理平均氨基酸泄漏率分别为19.1%和16.3%，而用浓度为10%NaCL溶液浸泡白刺叶片12h处理后，其氨基酸泄漏率较清水浸泡白刺叶片对照显著增大（t＝-4.637，P＜0.05），说明1%盐溶液处理12h对白刺苗无伤害，而且有利于白刺膜系统加固，但10%NaCL溶液对白刺苗有较大影响，叶片已受到伤害，平均氨基酸泄漏率为39.0%，部分叶片已脱落。以上结果也说明，氨基酸泄漏率指标可以用来进行植物抗盐性快速鉴定。
实施例1-2说明，本发明通过测定氨基酸泄漏率，可鉴定植物对低温、盐害的抗性程度，这对选育抗寒性和抗盐性强的植物新品种提供了技术支撑和科学依据，有利于植物品种抗寒性和抗盐性改良选育的早期鉴定。同时，通过鉴定植物对环境因子的耐受性，可确定植物对环境因子适应的范围，确立新品种适宜推广的区域，这对农业生产的田间管理和作物布局结构的调整均具有重要的科学指导意义。本方法可推广应用于植物对低温、盐胁迫的抗性鉴定研究中，也可在其他抗逆性鉴定研究中参考应用。
Claims (1)
1.一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法，其步骤是：
a．试验准备
根据试验处理数，准备足量5-10ml带螺盖离心管，用无离子水洗净后烘干备用；
b．准备样品
处理前用蒸馏水冲洗待测植物组织，用滤纸吸干表面水分；处理结束，准确称取各处理植物新鲜组织0.0401-0.0509g，置a步骤准备的离心管中；
c．浸提
在b步骤含植物新鲜组织的离心管中各加入4mL蒸馏水，在室温条件下，浸提2-3h，摇床轻摇浸提3h；
d．离心
浸提结束，立即将c步骤的浸提管放置在转速为3000rev/min的离心机离心5-10分钟；
e．去除杂蛋白干扰
上述d步骤离心结束，吸取浸提管中的上清液3.0ml,转入另一测试管，加入0.3ml的72%（w/v）三氯乙酸溶液，再在3000rev/min离心5-10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；
f．测定鲜组织的吸光度
将e步骤离心后的测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光度值A280nm，空白为蒸馏水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm，测定后将比色杯液体倒回测试管中；
g.高压灭杀
将e步骤吸取上清液后留有植物组织和1ml浸提液的浸提管上盖置高压灭菌锅灭杀20min，浸提管称灭杀管；
h.合并离心
将e步骤测试管测试液全部回倒入其g步骤对应灭杀管中，合并后再在3000rev/min离心5-10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；
i.测定杀死组织的吸光度
将上述h步骤合并离心的灭杀管上清液倒入比色杯，空白为蒸馏水，再次测定吸光度值Ak280nm，即为杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm；
j．计算氨基酸泄漏率
氨基酸泄漏率为各处理鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm占杀死样品在波长280nm的吸光度值Ak280nm的比率，按下列公式计算：
氨基酸泄漏率（%）=A280nm×100/Ak280nm。
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2016
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