CN105866334B - 一种马铃薯资源耐寒性鉴定方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯资源耐寒性鉴定方法与应用，该方法其步骤包括：分别取待鉴定的马铃薯和作为对照的耐寒马铃薯的成熟叶片；2）将叶片放入低温环境中，初始温度设为0℃，保持20‑40min,后，取样作为样品1；3）将温度从0℃降至‑1℃，保持50‑70min后，取样作为样品2；4）再将温度从‑1℃降至‑2℃，保持50‑70min后，取样作为样品3；5）测量样品1、2、3的可溶性糖含量；6）运用DPS分析软件对数据进行聚类分析并作图；8）根据作图结果得出待鉴定马铃薯的耐寒性。该检测方法材料处理快速，项目分析简单，每批次处理材料量大，可在短时间内对大批量材料进行初步抗寒性分级，检测效率提高，检测的成本低。
Description
技术领域
本发明属于农作物抗逆性鉴定分析技术领域，涉及一种梯度低温处理马铃薯离体叶片，分析不同处理条件下叶片的可溶性糖含量，以耐寒性材料作为对照，系统聚类分析材料与对照的欧式距离来分析马铃薯耐寒性的分析方法。
背景技术
我国南方水稻产区有3亿多亩的冬闲田，在冬闲田种植马铃薯是提高我国粮食安全水平的新的有效措施。我国冬作马铃薯的种植面积已经达到3000万亩以上。由于马铃薯喜温怕寒，而冬作马铃薯幼苗生长期多处于低温阴雨天气，且霜冻频发，常常导致冬作马铃薯生长期延迟和产量不稳定，从而制约了冬作马铃薯产业的发展。所以，低温胁迫是伴随中国冬作马铃薯迅速发展，不同于其他马铃薯主产区所面临的全新科学问题。研究马铃薯的耐寒性和不同栽培方式下冬作马铃薯防寒（冻）技术，对冬作马铃薯高效栽培技术体系的建立具有重要意义。
资源的耐寒性鉴定是马铃薯冬作适应型品种选育的必要前提。在自然霜冻条件下评价作物耐霜冻性，固然具有快速、方便、经济等优势，但受气温影响较大，只能在特殊的季节进行。因此不同农作物的室内耐寒性鉴定方法分别从植物形态学、细胞学、生理生化属性分析，以及耐寒性分子标记等不同层面展开。生长发育和形态差异研究发现，低温条件下的种子发芽率、发芽指数、发芽临界温度等出苗性状可以对玉米苗期耐寒性作出可靠估计［1、2］。低温下种子吸水速度、植株萎蔫状况与玉米耐寒性也存在显著相关性［3］。发育和形态指标鉴定法具有简便易测、实用性强的特点，但是温度压力的确定和表型分析是难点。研究表明，细胞膜结构的稳定性与作物的耐寒性成正相关，耐寒性强的作物品种膜透性增大程度较慢。因此，电解质渗漏法测定质膜的透性常用于对作物耐寒性的评估［4－5］。另有研究认为以电解质渗漏率为基础的半致死温度更能反映特定低温下质膜的透性［6］。此外，膜脂中不饱和脂肪酸的含量与质膜相变温度呈显著正相关，膜脂中不饱和脂肪酸的含量也成为衡量作物的耐寒性差异的指标［7-8］。同时研究者发现，低温下不同耐寒玉米和马铃薯品种光合速率变化的差异与其耐寒性相一致［9-10］。由于脂肪酸的含量，光合速率指标测定难度大，仪器设备操作复杂，费用昂贵，同时要求取样和测定环境均非常严格，因此，不适合对大量材料进行鉴定。游离脯氨酸、可溶性蛋白作［11-13］和可溶性糖作为细胞内渗透调节物质也经常被用于作物耐寒性评价。但有关可溶性蛋白质含量与作物耐寒性关系的研究结论不尽一致，有研究认为逆境下脯氨酸的积累是伤害的结果，只能作为辅助指标［14］。植物体内含有许多参低温响应的酶，其中，抗氧化酶保护系统的超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶(POD) 、过氧化氢酶( CAT)、叶绿体中半乳糖脂酶在适应低温的过程中表现活跃，但酶活性对分析处理条件与材料状况极其敏感，分析过程中的稳定性、重复性差。一般认为脱落酸(ABA) 是抗寒基因的启动子，通过信号转导引发酶活性变化或者基因表达的改变调控植物的耐寒生理机能。研究认为低温下ABA 的含量变化或GA /ABA 值能够清楚反映作物适应低温的能力［15］，但植物体内激素含量极微，测定困难，低温条件下内源激素作为抗寒性鉴定指标的研究甚少。近年来，迅速发展的分子遗传学为进行耐寒性的遗传研究提供了有利的工具，尤其是已经创立的数量性状基因( QTL) 作图方法极大地促进作物耐寒性的遗传研究。但目前可实际运用的分子标记很少。
综上所述，确定一个易于分离提取，对实验室分析条件要求较低的鉴定指标，建立一套处理方便、操作简单、重复性好，经济可靠的分析方法仍然是目前农作物包括马铃薯在内的耐寒性室内分析亟待解决的问题。
参考文献
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发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种马铃薯资源耐寒性鉴定方法，该方法处理方便、操作简单、重复性好，经济可靠，可在短时间内对大批量材料进行初步抗寒性分级，检测效率提高，检测的成本低。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种马铃薯资源耐寒性鉴定方法，其步骤包括：
1）分别取待鉴定的马铃薯和作为对照的耐寒马铃薯的成熟叶片；
2）将叶片放入低温环境中，初始温度设为0℃，保持20-40min,后，取样作为样品1；
3）将温度从0℃降至-1℃，保持50-70min后，取样作为样品2；
4）再将温度从-1℃降至-2℃，保持50-70min后，取样作为样品3；
5）测量样品1、2、3的可溶性糖含量；
6）运用DPS分析软件对数据进行聚类分析并作图；
8）根据作图结果得出待鉴定马铃薯的耐寒性。
本发明选择强耐寒性马铃薯材料作为对照：选用属于commersonii种的强耐霜冻马铃薯野生材料GS393，和1份强耐寒性马铃薯栽培种AV9，可根据待鉴定材料多少自行选择2-3个对照为。
优选地，第1）步是取待鉴定的马铃薯充分成熟的植株上部功能叶片，洗净并吸干叶片表面水分，将叶片放入容器中。
所述的方法，优选地，第2）步是将密封容器放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30min；向离心管中加入一小块冰，保持30min后取样。
所述的方法，优选地，第3）和4）步是中保持时间为60min。
所述的方法，其中第6）步的聚类分析操作如下：
1）分别计算待鉴定材料和对照在0℃、-1℃、-2℃低温下处理后的叶片可溶性糖含量，并求得三次重复的平均值；
2）DPS软件分别对待鉴定材料和对照三种温度下可溶性糖含量平均值进行系统聚类分析，优选采用欧式距离，或最短距离法；
3）根据待鉴定材料与对照的欧式距离分析耐寒性，其中与强耐寒性马铃薯材料对照欧式距离≤10即待鉴定材料被视为耐寒性与对照相近或较耐寒；相反其中与弱耐寒性马铃薯材料对照欧式距离≤10即待鉴定材料被视为耐寒性与对照相近或不耐寒。
所选择的对照马铃薯为由美国国家植物资源中心（The U.S. National PlantGermplasm System NPGS）提供湖南省马铃薯工程技术中心收集并保存，并可对外分发的强耐寒性马铃薯野生种GS393、和马铃薯普通栽培种AV9。
植物叶片可溶性糖分析方法有：蒽酮比色法，2-硫代巴比妥酸（TBA）法，高效气相色谱法等。
本发明具有以下有益效果：
本发明检测方法以叶片可溶性总糖作为分析指标，易于分离提取，对实验室分析条件要求较低；鉴定过程中材料处理简单、设置对照，进行相对耐寒性分析，重复性好；一批次处理材料量大，可在短时间内对大批量材料进行初步抗寒性分级，检测效率提高，检测的成本低。
附图说明
图1为 0℃低温下各材料叶片可溶性糖系统聚类分析。
图2 为-1℃低温下各材料叶片可溶性糖系统聚类分析。
图3 为-2℃低温下各材料叶片可溶性糖系统聚类分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释（试验Ⅰ），同时采用目前运用较多的电导率分析法（试验Ⅱ）和霜冻表型分析法（试验Ⅲ）做比较，以说明本发明的可靠性。但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例
待鉴定材料：费乌瑞它、BS226、BS214、Yan2、13*10、41*8、中薯3号（被中国农业科学蔬菜花卉研究所验证为耐寒性弱的马铃薯普通栽培种）、兴佳二号。
对照：GS393（美国国家植物资源中心（The U.S. National Plant GermplasmSystem NPGS）提供，湖南省马铃薯工程技术中心收集并保存，并可对外分发的强耐寒性马铃薯野生种）、S4、Q304、AV9；基质盆栽，基质采用商用蔬菜栽培土。
试验Ⅰ：（梯度处理分析可溶性糖含量）
1）取待鉴定的马铃薯材料（含对照1-2份，处理材料数量根据实验室低温处理容量和后续分析能力自行决定）充分成熟的植株上部功能叶片，用蒸馏水反复冲洗并吸干叶片表面水分，将叶片放入50mL离心管中，封口。
2）将离心管放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30 min，向离心管中加入一小块冰，继续保持30 min后取样1。
3）温度从0℃降至-1℃，保持1h后取样2。
4）温度从-1℃降至-2℃，保持1h后取样3。
5）测量样品1、2、3采的可溶性糖含量。
6）重复测定三次，收集整理数据。
7）运用DPS分析软件对数据进行聚类分析并作图。
8）材料耐寒性分析。
结果请参见图1至图3，图1～3分别为0℃、-1℃、-2℃低温下各材料叶片可溶性糖系统聚类分析。0℃和-1℃低温处理下，供试材料Q304和S4与对照AV9，Yan2、兴佳二号和BS214与对照GS393的欧式距离≤3，两个组群的欧式距离≤6。而与弱耐寒性对照中薯3号所在组群的欧式距离≥14（图1、图2）。当温度继续下降到-2℃，类群特点并没有改变，但类群间的欧式距离有所增加，但两个对照各自群类内欧式距离仍保持在5以内，群间欧式距离仍保持在10以内，与弱耐寒性对照中薯3号所在组群的欧式距离≥12（图3）。
试验Ⅱ： （电导率法求半致死率验证试验Ⅰ的结果）
1）取待鉴定的马铃薯材料（含对照1-2份，处理材料数量根据实验室低温处理容量和后续分析能力自行决定）充分成熟的植株上部功能叶片，用蒸馏水反复冲洗并吸干叶片表面水分，将叶片放入50mL离心管中，封口。
2）将离心管放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30 min，向离心管中加入一小块冰，保持30 min后取样1。
3）温度从0℃降至-1℃，保持1h后取样2。
4）温度从-1℃降至-2℃，保持1h后取样3。
5）依次类推至温度到-7℃。共取样八次。将取出的所有离心管放在冰上解冻过夜，测量相对电导率。
6）取处理后的离心管中的叶片，尽量保持叶片完整性，少含茎节。用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸吸干叶片表面水分，剪成适宜长度的长条，迅速称量三份，每份0.2g,分别置于含20ml去离子水的试管中，封口，室温下浸泡12h后用DDSJ-308A型电导率仪测定提取液电导率（R1），然后沸水浴20min杀死叶片，冷却至室温，充分摇匀后测量浸提液电导率（R2）。相对电导率=R1/R2×100%
7）重复测定三次，收集整理数据。
8）求半致死率。半致死温度为相对电导率为50%时的数值。通过EXCEL做图，从图上找出相应的点。
试验Ⅲ：（霜冻表型分析验证试验Ⅰ的结果）
-1.5℃低温下霜冻处理3小时。寒冻处理：运用人工霜冻箱，-1.5℃连续处理3小时，取出室温恢复1小时后进行冻害评估。
冻害分级标准：其标准为：0 级, 无明显冷害症状；1 级,叶缘略失水, 其他无明显冷害症状；2 级,叶缘失水严重, 心叶无明显冷害症状；3 级,叶缘严重失水, 心叶略失水；4 级,叶片萎蔫,心叶严重失水, 很难恢复生长；5 级, 全部叶片、茎萎蔫, 幼苗在常温下不能恢复生长。最后用DPS多元统计分析软件进行霜冻评价。
结果表明电导率法所得材料的半致死温度越低，材料冻害指数越低，两者呈正相关（表1）。该结果与按本发明分析所得结果高度契合。
表1 马铃薯耐低温性半致死率分析
Claims (4)
1.一种马铃薯资源耐寒性鉴定方法，其步骤包括：
1）分别取待鉴定的马铃薯和作为对照的耐寒马铃薯的成熟叶片，其为充分成熟的植株上部功能叶片；
2）将叶片放入低温环境中，初始温度设为0℃，保持20-40min后，取样作为样品1；
3）将温度从0℃降至-1℃，保持50-70min后，取样作为样品2；
4）再将温度从-1℃降至-2℃，保持50-70min后，取样作为样品3；
5）测量样品1、2、3的可溶性糖含量；
6）运用DPS分析软件对数据进行聚类分析并作图；
7）根据作图结果得出待鉴定马铃薯的耐寒性；
其中，第6）步的聚类分析操作如下：
1）分别计算待鉴定材料和对照在0℃、-1℃、-2℃低温下处理后的叶片可溶性糖含量，并求得三次重复的平均值；
2）DPS软件分别对待鉴定材料和对照三种温度下可溶性糖含量平均值进行欧式距离系统聚类分析；
3）根据待鉴定材料与对照的欧式距离分析耐寒性，其中与强耐寒性马铃薯材料对照欧式距离≤10即待鉴定材料被视为耐寒性与对照相近或较耐寒；相反其中与弱耐寒性马铃薯材料对照欧式距离≤10即待鉴定材料被视为耐寒性与对照相近或不耐寒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：第2）步是将密封容器放入低温循环水浴锅中，水浴锅初始温度设为0℃，保持30min；向离心管中加入一小块冰，保持30min后取样。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：第3）和4）步是低温保持时间为60min。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：所选择的对照马铃薯为强耐寒性马铃薯野生种GS393和马铃薯普通栽培种AV9。
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