CN115119693A - 苗期耐低温节瓜的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苗期耐低温节瓜的筛选方法，包括以下步骤：将待测节瓜的幼苗低温胁迫处理2天～4天后，测定待测节瓜幼苗的生理指标，并与低温胁迫处理前的生理指标进行比较；低温胁迫处理18天～22天后，统计待测节瓜幼苗的存活率；结合生理指标的变化，以及存活率的结果，鉴定待测节瓜是否为耐低温节瓜。本发明找到了适合筛选耐低温节瓜材料的低温胁迫处理温度，再结合低温胁迫处理前后节瓜幼苗生理生化指标的变化及表型的变化，从而可以较为全面准确地筛选出苗期耐低温节瓜材料，为节瓜的耐低温育种提供有效的亲本或中间材料。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，更具体地，本发明涉及一种苗期耐低温的节瓜的筛选方法。
背景技术
节瓜起源于亚热带和热带地区，生长适宜温度范围为20℃-30℃，对低温敏感，在我国华南地区早春和冬季生产中易遭受苗期低温的伤害。节瓜苗期长期处于低温会导致叶片发黄，出现水浸状斑点、植株生长缓慢、衰老甚至死亡，严重制约着其早熟丰产。随着节瓜周年生产需求的增加，尤其是在早春和冬季，提高节瓜苗期对低温胁迫的抗性成为亟待解决的问题。
在对蔬菜作物的苗期耐低温研究中发现，苗期低温胁迫的温度与时间，幼苗的大小以及是否壮苗均可以影响植株的低温耐受性，尤其是低温胁迫的温度至关重要，温度的细微调节，都会影响到低温鉴定的准确性。一般将形态学指标、生理生化指标及激素等物质指标作为苗期低温鉴定指标。此外，低温会出现较多生理生化过程的改变，如活性氧、丙二醛MDA的积累，细胞膜防御系统中大量保护酶的活性增强，可溶性糖、脯氨酸等物质的增加，低温下叶片叶绿素含量变化等，这些生理指标也被报道可以作为耐冷鉴定指标。也有研究报道将植物激素ABA和GA作为黄瓜苗期耐冷鉴定的间接指标
目前节瓜苗期耐低温鉴定方法仍不成熟，鉴定指标不完善，不能综合性对苗期的耐低温能力进行鉴定。因此，在苗期对节瓜的耐低温进行鉴定可以确定不同种质资源的苗期耐低温性能，为筛选优异的耐低温材料提供借鉴方法。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种苗期耐低温节瓜的筛选方法，采用该筛选方法，可以在苗期准确快速地筛选出耐低温节瓜材料。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一种苗期耐低温节瓜的筛选方法，包括以下步骤：
(1)、测定待测节瓜的幼苗的生理指标；
(2)、将待测节瓜的幼苗低温胁迫处理2天～4天后，测定待测节瓜幼苗的生理指标；所述低温胁迫处理为：白天10℃～11℃，夜间7℃～8℃；
(3)、低温胁迫处理18天～22天后，统计待测节瓜幼苗的存活率；
(4)、结合步骤(2)与步骤(1)中所述生理指标的变化，以及步骤(3)中所述存活率的结果，鉴定待测节瓜是否为耐低温节瓜。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述低温胁迫处理为白天10℃～10.5℃、夜间：7.5℃～8℃。
在其中一些实施例中，步骤(2)中低温胁迫处理3天～4天；和/或步骤(3)中低温胁迫处理19天～21天。
在其中一些实施例中，步骤(1)中和步骤(2)中所述生理指标包括脯氨酸含量、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性。
在其中一些实施例中，若步骤(2)中脯氨酸含量是步骤(1)脯氨酸含量的30倍以上，步骤(2)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性是步骤(1)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性的2倍以上，且步骤(3)中所述存活率大于50％，则待测节瓜为耐低温节瓜。
在其中一些实施例中，步骤(2)中脯氨酸含量是步骤(1)中脯氨酸含量的30倍～40倍。
在其中一些实施例中，步骤(2)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性是步骤(1)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性的2.0倍～2.5倍。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述存活率大于50％。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述幼苗为一叶一心。
本发明还提供了上述苗期耐低温节瓜的筛选方法在节瓜遗传育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人发现：采用常规的低温胁迫处理对节瓜幼苗进行处理时，节瓜幼苗都可以正常生长，不能筛选到耐低温的节瓜材料，发明人经过大量的实验，找到了适合筛选耐低温节瓜材料的低温胁迫处理温度，在此构思下，再结合低温胁迫处理前后节瓜幼苗生理生化指标(从众多的生理生化指标中，筛选到脯氨酸含量、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性这三个在低温胁迫处理前后有着显著差异的指标)的变化及表型的变化，从而可以较为全面准确地筛选出苗期耐低温节瓜材料，为节瓜的耐低温育种提供有效的亲本或中间材料。
附图说明
图1为本发明实施例1中低温胁迫前后不同节瓜材料的脯氨酸含量变化。
图2为本发明实施例1中低温胁迫前后不同节瓜材料过氧化物酶活性的变化。
图3为本发明实施例1中低温胁迫前后不同节瓜材过氧化氢酶活性的变化。
图4为本发明实施例1中低温胁迫处理20天后，不同节瓜材料的存活率统计结果。
图5为本发明实施例1中低温胁迫前后AW65、AW126、AW133的表型变化。
图6为本发明试验例1中丙二醛的含量测定结果。
图7为本发明试验例1中超氧化物歧化酶的含量测定结果。
图8为本发明试验例1中相对电导率的测定结果。
图9为本发明试验例2中采用与本发明不同的低温胁迫条件(白天20℃，夜间15℃)前后AW65、AW124、AW126、AW133的表型变化。
图10为本发明试验例2中采用与本发明不同的低温胁迫条件(白天15℃，夜间12℃)前后AW65、AW124、AW126、AW133的表型变化。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的其中一个方面，提供了一种苗期耐低温节瓜的筛选方法，所述鉴定方法包括以下步骤：
(1)、选取待测节瓜，在正常生长温度为28～32℃的条件下长到一叶一心时，测定节瓜幼苗的脯氨酸(Pro)的含量，以及过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性；
(2)、将待测节瓜幼苗低温胁迫处理3天～4天后，测定待测节瓜幼苗脯氨酸(Pro)的含量，以及过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性；所述低温胁迫处理为：白天10℃～11℃，夜间7℃～8℃；
本发明的发明人发现，当对节瓜幼苗进行低温胁迫处理时，低温胁迫处理温度——白天和晚上的温度的细微改变，都会对苗期耐低温节瓜材料的筛选造成极大的影响。具体来说：白天的温度若高于15℃，晚上的温度若高于12℃(例如白天20℃、夜间15℃或白天15℃、夜间12℃)，在这样的低温胁迫处理下，待测的节瓜幼苗都可以正常生长，各项生理指标之间达不到显著的差异；而白天的温度若是高于11℃，即使晚上的温度维持在8℃，也不能显著区分大部分的节瓜幼苗；若是白天温度低于10℃，晚上温度低于7℃，待测的节瓜幼苗又全部死亡；因此，这样的一些处理条件实际上并不能起到低温胁迫的作用，不能筛选出耐冷或冷敏的节瓜材料。
(3)、低温胁迫处理18天～22天后，观察待测节瓜幼苗的表型，统计待测节瓜幼苗的存活率；
(4)、根据待测节瓜幼苗脯氨酸(Pro)的含量变化，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性的变化，及存活率的变化，鉴定待测节瓜是否为耐低温节瓜材料；其中，当待测节瓜幼苗的脯氨酸含量在低温胁迫处理3～4天后，比低温胁迫处理前提高超过30倍；SOD活性和CAT活性在低温胁迫处理3～4天后，比低温胁迫处理前提高超过2倍；在低温胁迫处理18～22天后，存活率超过50％时，待测节瓜为耐低温节瓜材料。
本发明的筛选苗期耐低温节瓜材料的方法，可以准确地鉴定不同节瓜种质资源的苗期耐低温性能，节瓜种质资源包括但不限于—AW65：广西品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(TC-301B)；AW66：广东地方品种七星节瓜，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(大籽-5-2)；AW73：广西品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(tc303)；AW75：利用强雌性技术选育的强雌系纯合材(g1-4-2)；AW124：利用强雌性技术选育的强雌系纯合材料(28号-4-1)；AW125：广东地方品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(绿3)；AW126：小籽连环节瓜；AW129：绿宝石节瓜；AW133：新农民节瓜品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(25-0-1)；AW134：广西地方品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(石48石-3-2)。市面上出售的其它节瓜品种也同样适用于本发明的方法。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1苗期耐低温节瓜的筛选方法
本实施例的一种苗期耐低温节瓜的鉴定方法，包括以下步骤：
一、节瓜材料
AW65：广西品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(TC-301B)
AW66：广东地方品种七星节瓜，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(大籽-5-2)
AW73：广西品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(tc303)
AW75：利用强雌性技术选育的强雌系纯合材(g1-4-2)
AW124：利用强雌性技术选育的强雌系纯合材料(28号-4-1)
AW125：广东地方品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(绿3)
AW126：小籽连环节瓜
AW129：绿宝石节瓜
AW133：新农民节瓜品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(25-0-1)
AW134：广西地方品种，经过系谱法选育而来的纯合自交系材料(石48石头-3-2)
二、实验方法
1、在正常生长温度为28～32℃(更佳为30℃)条件下长到一叶一心时，测定处理前的脯氨酸含量，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性。
其中，脯氨酸(Pro)含量的测定：将0.2g新鲜幼苗样品，加入3％的5mL磺基水杨酸，沸水浴10分钟。冷却后离心10分钟，加入2mL脯氨酸提取液，同体积的蒸馏水和冰醋酸，两倍体积的2.5％的酸性茚三酮溶液；对照样品为3％的磺基水杨酸代替脯氨酸提取液，混匀后，沸水浴60分钟。用4mL甲苯萃取红色脯氨酸，于520nm处比色。
过氧化物酶(POD)活性的测定：利用POD催化过氧化氢氧化特定底物，在470nm处有特征光吸收。具体包括准确称取组织重量，冰水浴条件下，按重量(g)：体积(ml)＝1:10的比例加入10倍体积的提取液。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上，用分光光度计测吸光值。
过氧化氢酶(CAT)活性的测定：因过氧化氢(H2O2)在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。具体包括按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1:5～10的比例(称取约0.1g组织，加入1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上，用分光光度计测吸光值。
2、低温胁迫处理
将生长至一叶一心时的节瓜幼苗置于(白天：10℃；夜间：8℃)胁迫处理3天，处理3天后，取叶片并测定脯氨酸(Pro)含量，过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性。同时，观察不同材料在低温胁迫7天，14天，20天时的受害程度。
三、实验结果
以下所有生理指标检测是三次技术重复和生物学重复的平均结果。
1、脯氨酸含量变化
低温胁迫前后不同节瓜材料脯氨酸的变化如图1所示。从图1可以看出，正常生长条件下，各材料间的脯氨酸含量较低，但是低温处理3天后，脯氨酸含量增加，且AW124、AW126、AW133低温胁迫后较处理前上升30倍以上，其中AW124上升33倍，AW126上升35倍，AW133升高最多，达38倍。
2、POD和CAT活性的变化
低温胁迫前后不同节瓜材料POD和CAT活性的变化分别如图2和图3所示。
从图2可知，在低温胁迫处理后，所有节瓜材料POD活性均升高，其中AW124、AW125、AW129、AW133、AW134升高的倍数均在2倍以上。其中AW124上升2.2倍，AW125上升3.2倍，AW129上升3.0倍，AW133上升2.3倍，AW134上升2.8倍。
从图3可知，在低温胁迫处理后，绝大多数节瓜材料CAT活性都升高，不同材料CAT活性升高程度有所不同，其中AW75、AW124、AW126、AW129、AW133升高的倍数均在2倍以上。其中AW75上升2.4倍，AW124上升2.4倍，AW126上升3.1倍，AW129上升4.2倍，AW133上升2.0倍。
3、存活率
低温胁迫(白天：10℃；夜间：8℃)处理20天后，统计不同节瓜材料的存活率，结果如图4所示。其中AW124、AW126、AW133的存活率较高，超过了50％。其中AW124的存活率为63.4％，AW126存活率为92％，AW133存活率为52.2％。
4、表型变化
对10份节瓜材料低温胁迫7天、14天、20后的表型变化进行了统计，部分材料处理结果如图5所示。从图5可以看出，正常生长条件下，经过低温胁迫处理20天后，只有AW65幼苗死亡率较高，AW126植株均可以正常生长，AW133有超过一半的幼苗存活。
综上1～4的结果，结合低温胁迫前后脯氨酸(Pro)含量变化、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性变化，以及低温胁迫处理20天后节瓜材料的存活率，可以初步确定AW124和AW133节瓜材料苗期的耐低温强，可以为以后节瓜的耐低温育种提供材料基础。
实施例2苗期耐低温节瓜的筛选方法
本实施例的一种苗期耐低温节瓜的鉴定方法，除了低温胁迫处理温度为：白天10.5℃，夜间7℃外，其他步骤均与实施例1相同。本实施例中同样筛选到AW124和AW133节瓜材料为耐低温材料。
实施例3苗期耐低温节瓜的筛选方法
本实施例的一种苗期耐低温节瓜的鉴定方法，除了低温胁迫处理温度为：白天10℃，夜间7.5℃外，其他步骤均与实施例1相同。本实施例中同样筛选到AW124和AW133节瓜材料为耐低温材料。
试验例1苗期耐低温节瓜的鉴定方法中生理指标筛选实验
除了脯氨酸含量、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性的生理指标外，本试验例测试了丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量、以及相对电导率是否可以作为苗期耐低温节瓜鉴定的生理指标。
节瓜材料和实验方法同实施例1。
丙二醛、超氧化物歧化酶的含量测定结果、以及相对电导率的测定结果分别如图6～图8所示。
从图6～图8可知，10种节瓜材料的丙二醛和超氧化物歧化酶含量，在低温胁迫处理前后，没有一定的变化趋势，很难从中筛选出耐低温或低温敏感的材料；10份节瓜材料的相对电导率，不同材料间的差异没有显著水平，说明每份材料的相对电导率差异不明显，不能反应低温的细胞膜受损程度。
因此，丙二醛、超氧化物歧化酶和相对电导率都不适合作为苗期耐低温节瓜材料的鉴定指标。
试验例2苗期耐低温节瓜的鉴定方法中低温胁迫温度的筛选实验
为确定最合适的低温胁迫温度，本试验例在表1所示的6个低温胁迫条件下，对10份节瓜材料的耐低温能力进行了鉴定。
表1不同低温胁迫处理条件下节瓜材料的存活率
从表1结果可知，白天10℃，夜间8℃和白天11℃，夜间7℃条件下，10份节瓜材料存活率差异显著；白天12℃，夜间8℃，虽然10份材料的存活率有差别，但是不能显著区分大部分材料；当温度低到白天8℃，夜间6℃时，所有节瓜材料均死亡；当白天20℃，夜间15℃或白天15℃，夜间12℃时，所有材料均能生长，存活率达到90％以上。
选取AW65、AW124、AW126、AW133材料观察白天20℃，夜间15℃或白天15℃，夜间12℃低温胁迫处理7天、14天和20天时的表型变化，结果如图9和10所示，所有材料的叶片都出现发黄现象，但是可以生长，存活率达到90％以上。
综上结果，白天10℃～11℃，夜间7℃～8℃条件是苗期耐低温节瓜的鉴定方法中低温胁迫的最佳温度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、测定待测节瓜的幼苗的生理指标；
(2)、将待测节瓜的幼苗低温胁迫处理2天～4天后，测定待测节瓜幼苗的生理指标；所述低温胁迫处理为：白天10℃～11℃，夜间7℃～8℃；
(3)、低温胁迫处理18天～22天后，统计待测节瓜幼苗的存活率；
(4)、结合步骤(2)与步骤(1)中所述生理指标的变化，以及步骤(3)中所述存活率的结果，鉴定待测节瓜是否为耐低温节瓜。
2.根据权利要求1所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述低温胁迫处理为白天10℃～10.5℃，夜间7.5℃～8℃。
3.根据权利要求1所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中低温胁迫处理3天～4天；和/或步骤(3)中低温胁迫处理19天～21天。
4.根据权利要求1所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中和步骤(2)中所述生理指标包括脯氨酸含量、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性。
5.根据权利要求4所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，若步骤(2)中脯氨酸含量是步骤(1)中脯氨酸含量的30倍以上，步骤(2)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性是步骤(1)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性的2倍以上，且步骤(3)中所述存活率大于50％，则待测节瓜为耐低温节瓜。
6.根据权利要求5所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中脯氨酸含量是步骤(1)中脯氨酸含量的30倍～40倍。
7.根据权利要求5所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性是步骤(1)中过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性的2.0倍～2.5倍。
8.根据权利要求5所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述存活率大于50％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述幼苗为一叶一心。
10.权利要求1～9任一项所述的苗期耐低温节瓜的筛选方法在节瓜遗传育种中的应用。
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